PLoS ONE: Nye imidazopyridinderivater Besidder anti-tumor virkning på menneskers kastrationsresistent prostatakræft Cells

Abstrakt

Prostatakræft (PCA) er den næststørste årsag til kræftrelaterede dødsfald plager amerikanske hanner. De fleste behandlinger til dato for metastatisk PCa omfatter androgen-afsavn terapi og anden generation anti-androgener, såsom abirateronacetat og enzalutamide. Men et flertal af patienterne i sidste ende udvikle resistens over for disse behandlinger og tilbagefald til den dødelige, kastrationsresistent form for PCa, som nogen passende behandlingsmulighed tilbage. Derfor er der et umiddelbart behov for at udvikle effektive terapeutiske midler mod denne patientgruppe. Imidazopyridiner er for nylig blevet vist at have Akt kinase-inhiberende aktivitet; således i dette studie undersøgte vi den inhiberende virkning af hidtil ukendte imidazopyridinderivater HIMP, M-Mei, OMP, og EtOP på forskellige humane kastrationsresistent PCA-celler. Blandt disse forbindelser blev HIMP og M-Mel sig at besidde selektiv dosis- og tidsafhængig vækstinhibering: de reduceret kastrationsresistent PCa celleproliferation og sparet benign prostata epitelceller. Brug af LNCaP C-81-celler som modelsystem disse forbindelser også reducerede kolonidannelse samt celleadhæsion og migrering, og M-Mel var den mest potente i alle undersøgelser. Yderligere undersøgelser viste, at mens HIMP primært hæmmer PCa cellevækst via undertrykkelse af PI3K /Akt signalvejen, kan M-Mei hæmme både PI3K /Akt og androgen receptor veje og arrestere cellevækst i G2 fase. Således er vores resultater tyder den hidtil ukendte forbindelse M-Mei at være en lovende kandidat til kastrationsresistent PCa terapi, og fremtidige undersøgelser undersøger mekanismen for imidazopyridin hæmning kan hjælpe til udviklingen af ​​effektive anti-PCA agenter.

citation: Ingersoll MA, Lyons AS, Muniyan S, D’Cunha N, Robinson T, Hoelting K, et al. (2015) Nye imidazopyridinderivater Besidder anti-tumor virkning på menneskers kastrationsresistent prostatacancerceller. PLoS ONE 10 (6): e0131811. doi: 10,1371 /journal.pone.0131811

Redaktør: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, ØSTRIG

Modtaget: 10. februar, 2015; Accepteret: 7 juni 2015; Udgivet: 29 juni 2015

Copyright: © 2015 Ingersoll et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet delvist af National Cancer Institute, National Institutes of Health [CA88184 (MFL), CA138791 (SKB)], Department of Defense PCa Uddannelse Tilskud [PC094594 (MFL), PC121645 (MFL)], og University of Nebraska Medical center Bridge Fund (MFL). Cellecyklus analyse blev udført på UNMC flowcytometri Core Facility delvist støttet af UNMC Eppley Cancer Center tilskud [CA036727] (Ken Cowan). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft (PCA) er den mest almindeligt diagnosticeret solid tumor og den næststørste årsag til kræft dødsfald i USA mænd, at opretholde et behov for nye effektive behandlingsmuligheder [1]. Øjeblikket, androgen-deprivation terapi (ADT) er standard behandlingsforløb for metastatisk PCa, men de fleste PCA patienter tilbagefald i løbet af 1-3 år og udvikle kastrationsresistent (CR) PCa som ikke responderer på ADT [2,3,4 ]. I 2004 blev en kombination af docetaxel og prednison vist sig at øge patient median overlevelse på 2-3 måneder, hvilket gør det til standard-of-care behandling for CR PCa [5]. For nylig har FDA godkendt yderligere forbindelser såsom roman taxan kemoterapeutiske cabazitaxel [6], androgen syntese inhibitor abirateronacetat [7], AR signalering inhibitor enzalutamide [8], immunterapeutiske sipuleucel-T [9], og knogle mikro-miljø målrettede radiofarmaceutiske alpharadin (Radium-223) til behandling af CR PCa [10]. Men disse behandlingsmuligheder er kun i stand til at forlænge overlevelsen af ​​et par måneder, og den gennemsnitlige periode CR PCa patientens overlevelse, forbliver mindre end to år [11]. Trods fremskridt i post-ADT behandlingsstrategier, CR PCa fortsat en uhelbredelig sygdom; der er således et stort behov for alternative behandlingsmuligheder

Mens androgen ufølsomhed kan manifestere på flere måder.; en foreslået alternativ mekanisme er den øgede aktivering af Akt signalering under androgen berøvet betingelser. Akt er kendt for at regulere cellecyklus, metabolisme, angiogenese, og celleoverlevelse i PCa og dets aktivering kan bidrage til tumor resistens mod ADT og anti-androgener [12,13]. En mekanisme, gennem hvilken Akt kan bidrage til PCa overlevelsesevne er via modulering af androgen receptor (AR) signalering. Ud over at inducere cellevækst, AR har også en rolle i reguleringen af ​​apoptose. Efter phosphorylering af AR ved Ser-210 og Ser-790 ved Akt, er AR-medieret apoptose undertrykt. Gennem denne mekanisme, kan øget Akt aktivitet i PCa bidrage til PCa overlevelsesevne på ADT [13]. Faktisk kan genetiske tab og /eller mutationer i det phosphotidylinositol-3-kinase (PI3K) /Akt pathway, der fører til signal deregulering stede i op-til 42% af primære prostatatumorer og over 90% af metastatiske tumorer, hvilket gør det til en prioritet næste -in-line terapeutisk mål [14]. For nylig, undersøgelser af imidazopyridiner, en hidtil ukendt klasse af forbindelser indeholdende aromatiske aldehyder og en pyridingruppe, har vist disse forbindelser har kraftig Akt kinase inhibitorisk aktivitet [15-17]. Dataene viser disse forbindelser har en anti-proliferativ virkning mod CR PCA-celler med evnen til samtidigt at inhibere AR og PI3K /Akt /mTOR signalveje, hvilket gør dem lovende terapeutiske midler [18].

At undersøge imidazopyridiner ‘effekt til PCA terapi, LNCaP progressive celle model, oprindeligt kendetegnet ved Lin et. al.

JBC

1998 blev anvendt som den primære celle model i denne undersøgelse. LNCaP C-81 celler androgen-uafhængig (AI), udtrykker prostata-specifikt antigen (PSA) i fravær af androgener, og få mulighed for at syntetisere testosteron fra kolesterol under steroid-reduceret (SR) betingelser [19-22]. C-81 celler også har forbedret proliferation, evnen til at danne kolonier, og vandrende potentiale [21,23]. Vigtigst er det, LNCaP C-81-celler bevarer AR ekspression og svarer til ekspressionen af ​​AR i flertallet af PCa samt avancerede CR PCa [19]. Dette gør dem en overlegen celle model for terapeutiske studier sammenlignet med mange andre PCA cellelinier. Andre cellelinjer der er udvalgt til denne undersøgelse omfatter MDA PCa2b-AI, PC-3, og RWPE1. Ved passage, MDA PCa2b celler opfører sig på lignende til LNCaP-celler og skifte fra androgen-sensitive (AS) ved lav passage til AI ved høj passage. MDA PCa2b-AI (MDA-AI) celler også beholde AR udtryk og besidder forbedret tumorgenicity; dette gør MDA-AI og LNCaP C-81 foretrukne celle modeller til at studere prostataadenokarcinom. Yderligere, på grund af evnen hos imidazopyridinderivater at målrette både Akt og AR pathways, er det klogt at undersøge stoffernes virkninger på AR-negative PC-3-celler for at bestemme deres effektivitet i celler, som mangler klassiske androgen signalering mekanismer. Derudover PC-3 cellelinier er mere repræsentative for småcellet neuroendokrine karcinom end mere klinisk fremherskende adenocarcinom [24]; derfor denne cellelinie bør anvendes sammen med modeller som LNCaP og MDA PCa2b cellelinjer at udvide kliniske anvendelighed. Endelig udødeliggjort godartet prostata epithel RWPE1 celler virker som en kontrol for at måle selektiviteten af ​​imidazopyridin afledte forbindelser. vores cellemodeller klart Således udgør størstedelen af ​​de molekylære begivenheder observeret i kliniske implementeringer af moderne PCA terapier.

Vores resultater viser disse imidazopyridinderivater kan undertrykke human PCa celleproliferation i en dosis- og tidsafhængig måde. Vigtigere, Forbindelse M-Mel udviste selektiv potensering over CR PCa celleproliferation i sammenligning med benign prostata-epitelceller. Endvidere var dette sammensatte sig også at inhibere cellemigrering, adhæsion, og

in vitro

tumorigenicitet. Vores data er den første til at demonstrere antitumorvirkningen af ​​hidtil ukendte imidazopyridinderivater HIMP, M-Mei, OMP, og EtOP på CR PCA-celler og indikerer M-Mel at være en lovende bly terapeutisk middel til fremtidige undersøgelser.

Materialer og metoder

Materialer

RPMI 1640-medium, keratinocyt SFM medium, gentamicin og L-glutamin blev indkøbt fra Invitrogen (Carlsbad, CA). Føtalt bovint serum (FBS) og trækul-behandlet FBS blev opnået fra Atlanta Biologicals (Lawrenceville, GA). Molekylærbiologi-grade agarose blev indkøbt fra Fisher Biotech (Fair Lawn, NJ). Protein molekylvægt standard markører, acrylamid, og Bradford protein assay kit blev indkøbt fra Bio-Rad (Hercules, CA). Polyklonale antistoffer (ABS) genkender alle tre isoformer af Shc-protein (# 29.807, 1: 4000) blev indkøbt fra Upstate (Lake Placid, NY). Anti-AR (# C1411, 1: 400), anti-cyclin B

1 (# K1907, 1: 1000), anti-cyclin D

1 (# A2712, 1: 1000), anti-Bcl

XL (# F111, 1: 1000), anti-Bax (# G241, 1: 1000), anti-PCNA (# G261, 1: 3000), anti-p53 (# K2607, 1: 1000), anti PSA (# E1812, 1: 2000), anti-survivin (# C271, 1: 2000), og peberrodsperoxidase-konjugeret anti-muse (# C2011, 1: 5000), anti-kanin (# D2910, 1: 5000) , anti-ged (# J0608, 1: 5000) IgG Abs blev alle opnået fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Anti-phospho-Akt (Ser473) (# GA160, 1: 1000), anti-Akt (# C1411, 1: 2000), anti-phospho-Stat5 (Y694) (# 9351S, 1: 4000), og anti-Stat5 (# 9363, 1: 2000) Abs var fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Anti-β-actin (# 99H4842, 1: 10000) Abs og 5α-dihydrotestosteron (DHT) blev anskaffet fra Sigma (St. Louis, MO). Imidazopyridinderivater HIMP (3-phenyl-1- (pyridin-2-yl) imidazo [1,5

en

] pyridin), M-Mel (1- (pyridin-2-yl) -3- (

m

tolyl) imidazo [1,5

en

] pyridin), OMP (1- (pyridin-2-yl) -3 – (

o

tolyl) imidazo [1,5

en

] pyridin), og EtOP (3- (4-ethoxyphenyl) -1- (pyridin-2-yl) imidazo [1,5

a

] pyridin) blev syntetiseret og leveret af Dr. Xiu Bu som beskrevet tidligere [18,25], og deres strukturer er vist i figur 1. for at lette læsningen anvendes kemiske forkortelser i hele teksten.

HIMP, 3-phenyl-1- (pyridin-2-yl) imidazo [1,5

en

] pyridin; M-Mei, 1- (pyridin-2-yl) -3 – (

m

tolyl) imidazo [1,5

en

] pyridin; OMP, 1- (pyridin-2-yl) -3 – (

o

tolyl) imidazo [1,5

en

] pyridin; EtOP, 3- (4-ethoxyphenyl) -1- (pyridin-2-yl) imidazo- [1,5

en

] pyridin.

Cell Culture

humant prostataspecifikt carcinoma cellelinier LNCaP, MDA PCa2b, PC-3 og immortaliserede benign prostata epitelceller RWPE1 celler blev oprindeligt opnået fra American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA). LNCaP og PC-3-celler blev rutinemæssigt opretholdt i RPMI 1640 medium indeholdende 5% FBS, 2 mM glutamin og 50 ug /ml gentamicin [19,21]. MDA PCa2b celler blev holdt i BRFF-HPC1 medium indeholdende 20% FBS, 2 mM glutamin og 50 ug /ml gentamicin [26,27]. Som tidligere rapporteret, var LNCaP progressive celle model etableret i hvilken LNCaP celler på eller under passage 33 er betegnet som C-33 og dem på eller større end passagen 81 som C-81. Mens C-33-celler er følsomme for androgen-induceret vækst, C-81 celler er AI, udtrykke højere basale niveauer af PSA, og få mulighed for at syntetisere testosteron fra cholesterol [19-22]. Svarende til LNCaP model, ved passage, MDAPCa2b celler bliver AI og besidder mange biokemiske egenskaber af klinisk CR PCa, herunder ekspressionen af ​​funktionelt AR PSA sekretion, og hurtig celleproliferation i androgen-berøvet vej [19,21,22,27 , 28]. RWPE1 celler blev dyrket i keratinocyt-SFM suppleret med bovin hypofyse (25 ug /ml) og rekombinant epidermal vækstfaktor (0,15 ng /ml) sammen med 50 ug /ml gentamicin.

For at efterligne betingelserne for klinisk ADT blev cellerne opretholdt i SR betingelser, dvs. phenolrødt-frit RPMI 1640 medium indeholdende 5% trækul /dextran-behandlet FBS, 2 mM glutamin og 50 ug /ml gentamicin plus 1 nM DHT. Imidazopyridinderivater HIMP, M-Mei, OMP, og EtOP blev opløst i dimethylsulfoxid (DMSO) ved 20 mM stamkoncentrationer, opbevaret ved -20 ° C og fortyndet efter behov for eksperimentelle betingelser i de respektive medium.

celleproliferationsassays Salg

i celleproliferation eksperimenter under regelmæssige forhold, blev LNCaP C-81 og MDA PCa2b-AI-celler podet i regulært dyrkningsmedium og fik lov til at vokse i 3 dage, derefter ændret til medium indeholdende den respektive forbindelse og dyrket i yderligere 3 dage. For at bestemme celleproliferation under SR betingelser, LNCaP C-81, MDA PCa2b-AI, PC-3, og RWPE1 celler blev podet i regelmæssige forhold og lodes vokse i 3 dage. Celler blev derefter steroid udsultet i 48 timer i SR medium og ændret til frisk SR medium indeholdende den respektive forbindelse, dernæst dyrket i yderligere 3 dage. Kontrolgrupper modtog DMSO opløsningsmiddel alene. På det angivne tidspunkt blev cellerne trypsiniseret og levende celletal blev talt via trypanblåtudelukkelse under anvendelse en Cellometer Auto T4 Image-baserede celletæller (Nexcelom, MA, USA).

Cell Growth Kinetic og Dosering Bestemmelsen Salg

Dosisafhængige assays blev udført på LNCaP C-81-celler på samme måde som celleproliferationsassays og brugt medium indeholdende 0, 1, 5 eller 10 uM af specificerede forbindelse. For at bestemme den kinetiske virkning HIMP og M-Mel på væksten af ​​LNCaP C-81-celler blev celler podet i seks-brønds dyrkningsplader ved en tæthed på 2 x 10

3 celler /cm

2 og opretholdes i regelmæssige dyrkningsbetingelser for 3 dage. Celler blev derefter ændret til SR medium og holdes i 2 dage. En plade af vedhæftede celler blev høstet og talt som dag 0, og de resterende celler blev ændret til deres respektive behandlingsmedium: Kontrol (DMSO), HIMP, og M-Mel (10 uM). På hvert tidspunkt blev celler høstet til celleantal optælling og de resterende celler blev fodret med friske medier indeholdende respektive behandling forbindelse. Efter celle nummer tælling blev cellelysater forberedt til Western blot-analyse.

flowcytometrianalyse

For at bestemme forbindelsernes effekt på cellecyklus, blev LNCaP C-81 celler seedede i T25 kolber på en densitet på 2 x 10

3 celler /cm

2 i regelmæssig medium i 3 dage, skiftede til SR medium i 48 timer, og derefter fodret med frisk SR medium indeholdende 10 uM af specificerede forbindelse. Et sæt af celler blev høstet efter 3, 5, og 7 dages behandling, henholdsvis ved trypsinisering. Efter celletal optælling blev en alikvot af celler pelleteret ved centrifugering, resuspenderet i 70% ethanol og inkuberet ved 4 ° C i 30 minutter, derefter vasket med PBS og spundet ned igen ved centrifugering. DNA’et fra ethanol-fikserede celler blev farvet ved anvendelse Telford Reagent (PBS, pH 7,4, indeholdende 0,1% Triton X-100, 0,1 mM EDTA-dinatriumsalt, 0,05 mg /ml RNase A (50 U /mg) og 50 mg /ml propidiumiodid) ved 4 ° C i 4 timer [29]. Bestemmelse af cellecyklusfordeling blev udført under anvendelse af et Becton-Dickinson fluorescensaktiveret cellesorteringsapparat (FACSCalibur, Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) ved UNMC Flowcytometri Core Facility.

celleadhæsionsassay

for at bestemme virkningen af ​​imidazopyridinderivater på PCa celleadhæsion til plast-ware overflader, blev LNCaP C-81 celler suspenderet i 5% FBS 1640 RPMI-medium indeholdende 10 uM af respektive forbindelser og inkuberet i 30 minutter. Celler blev derefter udpladet i plader med 6 brønde in triplo med en tæthed på 3×10

3 celler /cm

2 i respektive behandling medium og inkuberet i yderligere en time. Ikke-bundne celler blev omhyggeligt vasket bort, og de resterende vedhæftede celler blev farvet med en 0,2% krystalviolet opløsning indeholdende 50% methanol. Det samlede antal celler i fem områder på 40x forstørrelse per brønd blev talt.

Klonogene og blød agar-kolonidannelse Analyser

klonogene cellevækst assay på overfladen af ​​plast-bagværk blev gennemført som beskrevet tidligere [23,26]. Kort fortalt blev LNCaP C-81-celler udpladet i plader med 6 brønde under regelmæssig dyrkningsbetingelser til tre densiteter: 20, 200 og 2000 celler per brønd. Celler blev inkuberet natten over, hvorefter fastgjorte celler blev fjernet og de vedhæftede celler blev fodret med frisk regelmæssig medium indeholdende 10 uM af behandling forbindelse. Celler blev dyrket i 9 dage med et skift af frisk medium hver tredje dag. På den 10

th dag blev mediet fjernet, og cellerne blev vasket med iskold HEPES-bufret saltvand, blev derpå bundne celler farvet med en 0,2% krystalviolet opløsning indeholdende 50% methanol. Forsøget blev udført i to eksemplarer.

Virkningen af ​​imidazopyridinderivater på forankringsuafhængig vækst af LNCaP C-81-celler blev vurderet ved blød agar-assay. Kort fortalt, 5×10

4-celler blev podet i en 0,25% agarose toplag med et basislag indeholdende 0,3% agarose i 6-brønds plader. Dagen efter såning blev celleklynger indeholder mere end én celle udelukkes fra undersøgelsen. Celler blev derefter fodret med 0,5 ml frisk regelmæssig medium indeholdende respektive forbindelse hver 3. dag i 4 uger. Efter forsøgsperioden blev kolonier farvet med en 0,2% krystalviolet opløsning indeholdende 50% methanol og talt.

cellemigrationsassay

For at bestemme virkningen af ​​imidazopyridinderivater på PCa celle mobilitet, LNCaP C-81 cellemigration blev vurderet via Boyden kammer assay. Celler blev udpladet ved en densitet på 5 x 10

4 celler ind i det øvre kammer 24-brønds plade transwell inserts. Medium indeholdende 10 uM af behandling forbindelse (opløsningsmiddel alene til kontrol) blev anbragt i både øvre og nedre kamre i transbrøndene. Celler blev derefter inkuberet i 24 timer, hvorefter de blev farvet med 0,2% krystalviolet opløsning i 50% methanol, og celler, der forbliver i det øvre kammer blev fjernet via vatpind. Celler, som var migreret gennem til det nedre kammer, blev talt ved 40x forstørrelse under et mikroskop.

immunoblotanalyse

Alle celler blev skyllet med iskold HEPES-bufret saltvand, pH 7,0, høstet via skrabning, og lyseret i iskold lyseringsbuffer indeholdende protease og phosphataseinhibitorer. Totale cellelysater blev fremstillet som beskrevet tidligere [19,30]. Proteinkoncentrationen af ​​supernatanten blev bestemt under anvendelse af et Bio-Rad Bradford protein-assay. For immunoblotting blev en alikvot af den samlede cellelysat elektroforese på SDS-polyacrylamidgeler (7,5% -12%). Efter at være blevet overført til nitrocellulosemembran blev membraner blokeret med 5% fedtfri mælk i Tris-bufret saltvand (TBS) indeholdende 0,1% Tween-20 i 30 minutter ved stuetemperatur. Membraner blev inkuberet med den tilsvarende primære Ab natten over ved 4 ° C. Membraner blev derefter skyllet og inkuberet med den passende sekundære Ab i 60 minutter ved stuetemperatur. Proteiner af interesse blev detekteret ved en forøget kemiluminescens (ECL) reagens kit og β-actin blev anvendt som en loading kontrol.

Statistical Analysis

Hvert sæt af eksperimenter blev udført to eller tre gange så angivet i figurteksterne, og forsøg blev gentaget uafhængigt mindst to eller tre gange. Middelværdien og standardfejlen fejlværdier for alle resultater blev beregnet og to-halet Student-t-test blev anvendt til at bestemme signifikans af resultaterne.

s

0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

dosisafhængig Effekt af imidazopyridinderivater på CR PCa celledeling

LNCaP C-81. celler udviser mange biokemiske egenskaber som det ses i klinisk CR PCa, herunder funktionel AR ekspression, AI PSA sekretion, og proliferation med intracrine vækstregulering [19,21-23] og således blev anvendt som det primære celle modelsystem til testning imidazopyridin forbindelser. I første omgang blev de dosisafhængige virkninger af HIMP, M-Mei, OMP, og EtOP på LNCaP C-81 celler testet under almindelige dyrkningsbetingelser. Celler blev behandlet med 0-10 uM af hver forbindelse i 72 timer og cellevækst blev analyseret via trypanblåt udelukkelse assay. Under regelmæssige dyrkningsbetingelser blev dosisafhængig inhibering af celleproliferation observeret for alle forbindelser med anslåede IC

50 værdier på 6,1 uM (M-mei), 6,6 pM (EtOP), 7,3 pM (OMP) og 9,3 pM ( HIMP) (fig 2A).

(A) Dosering virkning imidazopyridinderivater på LNCaP C-81-celler. Celler blev udpladet i seks-brønds plader med 2 x 10

3 celler /cm

2 i regelmæssig medium og dyrket i 72 timer. Et sæt af celler blev derefter tilført frisk regelmæssig medium indeholdende 0,1,5, eller 10 um imidazopyridinderivater med opløsningsmiddel alene til styring og dyrket i yderligere 72 timer. Et andet sæt af celler blev første steroid sultet i SR medium i 48 timer, derefter behandlet med respektive forbindelser i ferske SR medier indeholdende 1 nM DHT i 72 timer. Alle celler blev trypsinbehandlet og levende celletal blev talt. Eksperimentet blev udført i dobbelte brønde med 3 sæt uafhængige forsøg. Resultaterne præsenteret er gennemsnit ± SE; n = 2×3. *

s

0,05 **

s

0,005 ***

s

0,0005. (B) Virkninger af imidazopyridinderivater på væksten af ​​forskellige PCA-celler og immortaliserede prostata epitelceller. Alle celler blev udpladet i seks-brønds plader ved den anførte densitet i deres respektive medium i tre dage, steroid-udsultet i to dage, derefter fodret med frisk SR medium med 1 nM DHT indeholdende 10 uM imidazopyridinderivater og dyrket i yderligere tre dage. Celler blev trypsinbehandlet og levende celletal blev talt. LNCaP C-81-2 x 10

3 celler /cm

2, MDA PCab2b AI-3 x 10

3 celler /cm

2, PC-3-2 x 10

3 celler /cm

2, RWPEI- 7.5 x10

3 celler /cm

2. Alle eksperimenter blev udført i tredobbelte brønde med 3 sæt uafhængige forsøg. Resultaterne præsenteres er gennemsnit ± SE; n = 3×3. *

s

0,05; **

s

0,001; ***

s

. 0,0001

Vi derefter undersøgt effekten af ​​forbindelserne i SR betingelser, efterligne adt betingelser. Forbindelserne inhiberede cellevækst efter doseringen reaktion med anslåede IC

50 værdier på 10,2 um (M-mei), 10,5 um (OMP), 11,6 um (HIMP) og 16,0 um (EtOP) (Fig 2A). Interessant, M-Mei havde den største hæmmende aktivitet under begge vækstbetingelser. Selvom EtOP havde sammenlignelig hæmning til M-Mei i regelmæssige forhold, det havde den mindste effekt under SR betingelser. HIMP og OMP blev også påvist at være mindre effektive end M-Mel under begge behandlingsbetingelser.

Selektiv antiproliferativ virkning af forbindelser på PCa vs. udødeliggjort Normale Prostata epitelceller

undertrykkende virkning af hver inhibitor på proliferation blev undersøgt under anvendelse af et panel af cancerøse og godartet prostata epiteliale cellelinjer. AI PCA celler, herunder AR-positive LNCaP C-81 og MDA PCa2b-AI samt AR-negative PC-3-celler blev valgt som repræsentanter for avanceret CR PSA. RWPE1 celler, en udødeliggjort benign prostata epitelial cellelinje, blev anvendt til at bestemme forbindelsernes selektivitet. Efter tre dage med 10 pM behandling under SR betingelser, HIMP, M-Mei, og EtOP alle viste selektiv hæmning af spredning af kræftceller med betydeligt mindre effekt på ikke-kræft RWPE1 celler (Fig 2B). Selvom OMP var effektiv mod C-81 og PC-3 celler, det var forholdsvis potent mod RWPE1 celler. Samlet set viser resultaterne HIMP og M-Mel var den mest selektive, inhibering PCa cellevækst signifikant flere end RWPE1 celler med M-Mel vise større inhibering i alle cellelinjer analyseret.

Undertrykkelse af PCa Tumorigenicitet af imidazopyridinderivater

forbindelsernes evne til at undertrykke kolonidannelse i LNCaP C-81-celler blev indledningsvis adgang klonogene in vitro assays for forankringsafhængige cellevækst. LNCaP C-81-celler blev podet med 20, 200 og 2000 celler per brønd i plader med 6 brønde og derefter behandlet med 10 pM af hver forbindelse. Efter 10 dages behandling var alle forbindelser inhiberede signifikant klonogenisk vækst ved 2000 celler per brønd, som vist i fig 3A til 2000 celler per brønd. Mens M-Mel og EtOP stærkt hæmmet kolonivækst, HIMP og OMP var forholdsvis mindre potent. Minimal kolonidannelse blev observeret ved densiteter på 20 og 200 celler per brønd.

(A) klongenicitetsassayet på plast bagværk. LNCaP C-81-celler blev udpladet i seks-brønds plader ved densiteter på 20, 200 og 2000 celler /brønd. Efter 24 timer blev vedhæftede celler behandlet med respektive forbindelser ved 10 pM koncentrationer af imidazopyridinderivater eller opløsningsmiddel alene som kontrol. Celler blev fodret på dag 3, 6, og 9 med friske dyrkningsmedier indeholdende respektive inhibitorer. På dag 10 blev cellerne farvet, og antallet af kolonier optalt. Fotografierne af repræsentative koloni plader blev taget fra plader podet med 2,000cells /brønd, og antallet af kolonier blev talt vist også fra plader podet med 2,000cells /brønd. Minimal kolonidannelse blev observeret ved densiteter på 20 og 200 celler /brønd. Resultaterne præsenteres er gennemsnit ± SE; n = 2×3. ***

s

0,0001. (B) forankringsuafhængig blød agar-assay. LNCaP C-81-celler blev udpladet ved en densitet på 5 x 10

4 celler /35 mm skål i 0,25% blød agar plader. Den følgende dag blev celler i dubletter eller større mærkes og udelukket fra studiet. Medier blev tilsat hver tredje dag, og i slutningen af ​​5 uger blev dannede kolonier farves og tælles. Repræsentative billeder af kolonier er vist (ovenfor), og antallet af kolonier blev talt (nedenfor). Forsøgene blev udført dobbelt med 3 sæt uafhængige forsøg. Resultaterne præsenteres er gennemsnit ± SE; n = 2×3. *** P 0,0001. (C). Celleadhæsionsassay på plast bagværk. Celler blev suspenderet i behandling medier i 30 minutter før udpladet i plader med 6 brønde ved 3 x10

3 celler /cm

2 under anvendelse af samme behandling medier. Cellerne fik lov at klæbe i en time, fikseret og farvet med 0,2% krystalviolet-opløsning (50:50, vand: MeOH). Det samlede antal celler i fem felter ved 40x forstørrelse for hver brønd blev talt. Forsøgene blev udført in triplo med 3 sæt uafhængige forsøg. Resultaterne præsenteres er gennemsnit ± SE; n = 3×3. *

s

0,05; **

s

0,01. (D). Cellemigrering Transwell assay. Cellemigrering vurderet via Boyden kammer. En portion på 5 x 10

4 C-81-celler blev podet i indsatsen af ​​plader med 24 brønde i medier indeholdende 10 uM respektive forbindelser med opløsningsmiddel alene til kontrol i både øvre og nedre kamre. Efter 24 timers inkubering blev de migrerede celler farvet og de celler, der forbliver i det øvre kammer blev fjernet via vatpind. Celler, som var migreret gennem til det nedre kammer, blev talt. Repræsentative billeder vises på 40x forstørrelse. Forsøgene blev udført in triplo med 3 sæt uafhængige forsøg, og resultaterne præsenteret er middelværdi ± SE; n = 3×3, *

s

0,05; **

s

. 0,005

Den bløde agar kolonidannelse assay blev derefter udført for at bestemme forbindelsernes effekt på forankringsuafhængig vækst i en 3-dimensionelle miljø. Som vist i fig 3B, celler dyrket ved en densitet på 5.000 celler pr 35 mm skål i fire uger producerede langt færre kolonier med mindre koloni størrelse, når de behandles med imidazopyridinderivater. Sammenlignet med kontrolceller behandlet med opløsningsmiddel alene, M-Mel undertrykt koloni vækst i størst omfang, at reducere antallet af kolonier med 90 procent med knap synlig koloni størrelse (Fig 3B). Til sammenligning EtOP og OMP reduceret koloni vækst med 80 og 70 procent inhibition henholdsvis og HIMP havde den mindste effekt på omkring 50 procent hæmning.

For at afklare, om disse forbindelser effekt på kolonidannelse er til dels skyldes til inhibering af celleadhæsion, kapacitet HIMP, M-Mel, OMP, og EtOP at påvirke PCa celleadhæsion på plastoverfladen af ​​6-brønds plader blev derefter undersøgt. Mens disse forbindelser havde varierende grader af undertrykkelse på evnen hos LNCaP C-81-celler til at klæbe ved en densitet på 50.000 celler per brønd blev en lignende inhiberende tendens til den for klonogene og blød agar-assays (fig 3C vs. 3A 3B). M-Mei havde den største effekt og var i stand til at reducere celle vedhæftning med omkring 40 procent. Mens HIMP og EtOP var også i stand til signifikant at hæmme celle vedhæftning, de gjorde det i mindre grad; OMP viste sig at have en minimal effekt på C-81 cellernes evne til at knytte til plast overflade. Derfor, selvom alle forbindelser tilhører den samme klasse af molekyler, de har indflydelse PCa celle koloni dannelse og vedhæftning forskelligt.

For at undersøge hæmmende evne disse forbindelser på tumor metastase, blev deres aktivitet på cellemigration analyseret af transwell migration assay. Interessant nok blev disse forbindelser sig at have varierende grader af undertrykkelse på PCa cellemigrering. Fig 3D viste, at både M-Mel og EtOP kunne reducere LNCaP C-81 cellemigration via Boyden Chamber assayet over et tidsrum på 24 timer ved omkring 30 procent. Forholdsvis, HIMP og OMP undladt at reducere celle migration. Samlet set blev M-Mei fundet at udvise den mest potente hæmmende aktivitet på CR PCa celle tumorgenicity.

Effekt af imidazopyridin forbindelser på proliferativ og Apoptotisk signalering i CR PCA Celler

Det er velkendt, at størstedelen af ​​CR PCA celler udtrykker funktionel AR der er stadig behov for deres vækst og overlevelse [22,31,32]. For at bestemme, hvordan de forbindelser undertrykker PCa celleproliferation, vi analyserede deres virkninger på proliferativ og apoptotisk signalering i AR-positive LNCaP C-81 og MDA PCa2b-AI celler under SR betingelser. Fig 4A og 4B viste, at efter 3-dages behandlinger, 10 um af hver forbindelse undertrykte signifikant LNCaP C-81 og MDA PCa2b-AI-celleproliferation.

(A) LNCaP C-81-celler blev udpladet i tre eksemplarer i T25 kolber ved 4 x 10

3 celler /cm

2 i regelmæssig medium, der dyrkes i 72 timer og derefter steroid sultede i 48 timer. Celler blev derefter behandlet med 10 pM imidazopyridinderivater eller DMSO som kontrol i yderligere 72 timer under SR betingelser. Celler blev trypsinbehandlet og levende celletal talt via trypanblåt assay. Forsøgene blev udført in triplo med 3 sæt uafhængige forsøg. ***

s

0,0005. (B) MDA PCa2b-AI-celler blev dyrket, behandlet og talt under betingelser som beskrevet ovenfor i (A) for LNCaP C-81-celler. Resultaterne præsenteres er gennemsnit ± SE; n = 3×3. *

s

0,05; **

s

0,005; ***

s

0,0005. (C) LNCaP C-81 total cellelysat proteiner blev opsamlet fra (A) efter celletal optælling. *

s

0,05;