PLoS ONE: Segmentering af billeddata fra Complex organotypisk 3D modeller af kræft væv med Markov Random Fields

Abstrakte

organotypisk, tre dimensional (3D) cellekultur modeller af epitel tumor typer såsom prostatakræft rekapitulere centrale aspekter af arkitektur og histologi af faste kræftformer. Morfometrisk analyse af flercellede 3D organoids er særlig vigtigt, når yderligere bestanddele, såsom den ekstracellulære matrix og tumor mikromiljø er inkluderet i modellen. Kompleksiteten af ​​sådanne modeller har hidtil begrænset deres vellykket gennemførelse. Der er et stort behov for automatiske, præcis og robust billede segmentering værktøjer til at lette analysen af ​​sådanne biologisk relevante 3D cellekultur-modeller. Vi præsenterer en segmentering metode baseret på Markov felter (MRFs) og illustrere vores metode ved hjælp af 3D stak billeddata fra en organotypisk 3D-model af prostata kræftceller co-dyrket med cancer-associerede fibroblaster (cafeer). 3D segmentering output tyder på, at disse celletyper er i fysisk kontakt med hinanden inden for modellen, som har stor betydning for tumor biologi. Segmentering ydeevne kvantificeres ved hjælp af jorden sandheden etiketter og vi viser, hvordan hvert trin i vores metode øger segmentering nøjagtighed. Vi leverer jorden sandheden etiketter sammen med billeddata og kode. Brug uafhængig billeddata viser vi, at vores segmentering metode er også mere generelt anvendelig til andre typer cellulære mikroskopi og ikke kun begrænset til fluorescens mikroskopi

Henvisning:. Robinson S, Guyon L, Nevalainen J, Toriseva M, Åkerfelt M, Nees M (2015) Segmentering af billeddata fra Complex organotypisk 3D modeller af kræft væv med Markov Random Fields. PLoS ONE 10 (12): e0143798. doi: 10,1371 /journal.pone.0143798

Redaktør: Olivier de Wever, Ghent Universitet, BELGIEN

Modtaget: Juli 3, 2015; Accepteret: November 10, 2015; Udgivet: December 2, 2015

Copyright: © 2015 Robinson et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. VTT Oy er en non-profit, fuldt statsejede forskningsinstitution, der officielt lykkes den tidligere organisation, der blev grundlagt i 1942, tidligere kendt som valtion Teknillinen Tutkimuskeskus eller VTT (The National Technical Research Centre i Finland). VTT Oy blev stiftet i 01.01.2015 og opretholder strukturen af ​​en storstilet forskningsinstitution. Den her beskrevne forskning er af udelukkende faglig karakter, ikke relateret på nogen måde til kommercielle produkter, tjenester eller igangværende kontraktforskning med tredjeparter udført på VTT Oy. Dette arbejde blev støttet af Finlands Akademi, giver tallene 284.619 (M A) og 267.326 (MN). SR er modtageren af ​​en CEA-Industri specialekontrakt og en VTT specialekontrakt. VTT ydet støtte i form af lønninger til forfattere SR, MA, og MN, men havde ikke nogen ekstra rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. MT har arbejdet som ekstern forsker tilknyttet VTT gennem forskergruppen (ledet af MN). De specifikke roller disse forfattere er formuleret i afsnittet forfatter bidrag

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklæret, at der ikke konkurrerende interesser findes relateret til deres tilhørsforhold med VTT. Dette tilhørsforhold ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Cellular processer forekommer naturligt i tre dimensioner (3D) og celler er typisk indlejret i ekstracellulær matrix , som er en vigtig del af den cellulære mikromiljø. Følgelig fysiologisk relevante cellekulturmodeller stigende grad designet i 3D-formater indlejret i ekstracellulær matrix for at indfange komplekse væv-lignende biologi mere trofast [1]. En fast tumor repræsenterer en forstyrret og kompleks væv med sin egen karakteristiske vævshomeostase og omgivende tumormikromiljøet. Tumor celle plasticitet og vigtige egenskaber, såsom differentiering versus tumorcelleinvasion er stærkt påvirket af tumormikromiljøet. For at rekapitulere funktionerne i solide tumorer

in vitro

kræver cellebaserede assays, der samtidig efterligner den ekstracellulære matrix og tumor mikromiljø, homeotypic og heterotypisk celle-celle kontakter, og tillader dannelsen af ​​relevante celle-matrix interaktioner. Organotypiske 3D cellekultur teknikker i øjeblikket repræsenterer de mest biologisk relevante

in vitro

modeller til undersøgelse af epitelial kræft differentiering, polarisering og invasion [1-3]. Men manglen på egnede mikroskopi billede analysemetoder har hidtil begrænset den vellykkede gennemførelse og fortolkning af sådanne modeller.

Udover kræftceller, forskellige stromale celler repræsenterer den mest kritiske komponent af tumor mikromiljø. Kræft-associerede fibroblaster (CAFS) er den mest rigelige stromal celletype i de fleste karcinomer og spille en væsentlig rolle i tumor progression [4-6]. CAF udgør derfor et vigtigt mål for kræftbehandling. Samspillet mellem tumorceller og CAF er stadig dårligt forstået og mere pålidelige og robuste cellekultur modeller, bedre rekapitulere den komplekse histologi af

in vivo

tumorer er forpligtet til at studere tumor-stroma interaktioner.

vi anser multikanal 3D stack billeddata fra en kompleks organotypisk 3D cellekultur model af prostatacancer tumorceller co-dyrket med CAF. Vores 3D cellekultur model og billeddannelse protokol vedrører den flercellede niveau, hvori de samlede egenskaber af tumor organoids og CAF strukturer er mere kritiske end opfange individuelle celler eller cellekerner. Erhvervet med en relativ stor afstand mellem billeder i stakken, opløsningen af ​​billeddataene i et billede var op til 20 gange opløsningen mellem billeder i stakken.

Sunde prostata væv er dannet af acini, som er hule klynger af celler, der danner de mindste funktionelle enheder af en sekretorisk kirtel. I begyndelsen af ​​fase prostatacancer disse acini begynder at fylde op med præmaligne eller maligne celler til at blive solide sfæroider. Formen og størrelsen af ​​flercellede organoids indeholder værdifulde morfometrisk oplysninger [7] og vores interesse ligger i den flercellede tumor og CAF strukturer som særskilte informative objekter. Præcis segmentering af både flercellede tumor og CAF strukturer er det første skridt i at undersøge i hvilket format og skalere disse celletyper kan danne direkte celle-celle kontakter. Derfor er vores mål at producere en automatisk segmentering for begge typer af objekter uden at antage inden form eller overvejer enkelte celler.

Automatiseret computer vision typisk giver mulighed for langt større effektivitet og objektivitet end manuel menneskelig analyse [8]. Segmentering og identifikation af dele af billedet, der er af interesse, er det første skridt i mange computer vision applikationer. Simple tærsklingsparametre metoder danner grundlag for mange typiske segmentering metoder [9]. Populære freeware billede analyse platforme såsom Cell Profiler [10] og ImageJ /Fiji [11] give praktiske implementeringer af sådanne segmentering metoder specielt designet til cellulære mikroskopi data og muliggøre analyse ud over segmentering i specialiserede rørledninger til bestemte datasæt. Men sådan analyse er typisk fokuseret på høj opløsning mikroskopi data på enkelt celle eller endda sub-cellulære niveauer og er også hovedsagelig fokuseret på to dimensionelle (2D) monolag cellekulturer, selv om 3D volumen visning og rendering er muligt i ImageJ. Kommercielle softwareprodukter, der fokuserer på 3D cellulære mikroskopi billedanalyse såsom Imaris (Bitplane) og Volocity (PerkinElmer) er designet til meget detaljeret analyse af billeder i høj opløsning på enkelt celle niveau, hvor der kan være så lidt som 0,5

μ

m mellem billeder i 3D-stak. De specifikke behov hos de billeddata fra vores komplekse 3D cellekultur model, bliver multikanal 3D billeddata, hvor der er store afstande mellem billeder i 3D stak, kræver indgående manipulation af segmentering metode, der ikke er til rådighed inden for disse platforme.

Markov felter (MRFs) anvendes til computer vision på mange forskellige områder og for en bred vifte af problemer [12]. Sådanne modeller er populære, fordi de Markov ‘nabo’ struktur giver mulighed for at der tages hensyn til de rumlige relationer pixels mens den stadig er beregningsmæssigt muligt. For cellulære mikroskopi billeddata, har MRF baserede metoder blevet anvendt til at spore de enkelte celler [13, 14], klassifikation [15], bevægelsesdetektering [16], billede restaurering og udfoldning [17, 18], og identifikation af mitose [19, 20]. MRFs har også været flittigt brugt til billedet segmentering i en bred række områder, med mange “naturligt billede ‘(ikke-mikroskopi) applikationer [21]. For

in vivo

cellulære mikroskopi billeder, MRFs har været anvendt til segmentering i specifikke histologiske applikationer [22, 23] og for at segmentere særlige funktioner såsom blodkar [24]. De er blevet brugt til

in vitro Salg cellulære mikroskopi billeder til at segmentere individuelle cellekerner [25], herunder anvendelse af en specifik kerner form forud [26, 27]. En MRF metode er også blevet brugt til segmentering og klassifikation af sub-cellulære strukturer i de enkelte celler [28].

Vi implementerer vores 3D segmentering metode baseret på MRFs og vise, at den udfører nøjagtigt på billeddata fra kompleks organotypiske 3D-modeller af prostatakræft. Styrkerne i vores segmentering metode demonstreret ved hjælp af forskellige, men nært beslægtede eksperimentelle billeddata og kvantitativt at sammenligne med andre segmentering metoder bruger jorden sandheden etiketter. Vi viser, at vores MRF metode præcist indfanger biologisk relevante, men ofte tyndere og svagere funktioner såsom komplekse CAF strukturer og sondringen tumor versus stroma celler i en 3D-indstilling. Vi viser også, at vores segmentering metode er mere generelt anvendelig for andre typer af cellulære mikroskopi billeddata og ikke kun begrænset til fluorescens mikroskopi.

Materialer og metoder

Cellular mikroskopi billeddata

vi udnytter 3D stak konfokale mikroskopi billeddata fra tre forskellige, men nært beslægtede organotypiske 3D cellekultur modeller, som vi refererer til som ‘IF billeddata “, den” LIVE billeddata “og” FAK billeddata’. Fuldstændige oplysninger om de eksperimentelle og billedbehandling protokoller er tidligere blevet offentliggjort [29] og er kort beskrevet nedenfor. Alle 3D-stakke af billeder fra både IF og LIVE billeddata blev manuelt segmenteret efter biologerne, der udførte forsøgene. Den manuelle segmentering blev udført i Adobe Photoshop (Adobe Systems) og resulterede i hver pixel får en grund sandhed etiket enten “i fokus tumorceller ‘,’ i fokus CAF” eller “ude af fokus /baggrund ‘. Disse jorden sandheden etiketter anvendes i valideringen af ​​vores segmentering metode.

Kommercielt tilgængelige ekstracellulære matrix præparater (vækstfaktor-reduceret Matrigel med en bestand koncentration på 8 mg /ml og kollagen type I med en bestand 3 mg /ml) blev indkøbt fra BD Invitrogen og anvendes til alle 3D co-kultur eksperimenter. En 25% eller 50% fortynding af Matrigel blev anvendt, og en 1: 1 blanding af begge præparater blev rutinemæssigt anvendt (2-4 mg /ml Matrigel, 1,5 mg /ml collagen). Både tumor og stromaceller blev podet som enkeltcelle-suspensioner, med indledende tætheder på 700-1500 celler /brønd. 3D co-kulturer blev fremstillet ved anvendelse af en “sandwich” -princippet, hvor alle celler, herunder stromale komponenter blev podet i samme plane lag for at lette billeddannelse. Under disse lokaler, indledende seeding tæthed var ca. 1800 celler /cm

2.

I co-kultur indstilling IF 3D, LNCaP prostatacancerceller [30] var co-dyrket med PF179T CAF isoleret fra en prostatacancer patient [31], ved et indledende cellepodning forhold på 1: 2 i ekstracellulær matrix. Efter 14 dages dyrkning blev celler fikseret og indirekte immunfluorescensfarvning blev udført. Et antistof specifikt for pan-keratin blev anvendt til den specifikke farvning af tumor organoids, mens CAF blev farvet med et antistof mod human vimentin. CAF-celler til sidst fusioneret til store flercellede strukturer, der karakteristisk var omkring periferien af ​​tumor organoids.

I Live 3D co-kultur indstilling, variationer af de samme celler som for IF billeddata, der er anvendt. I dette eksperiment LNCaP-tumorceller der udtrykker DsRed protein blev co-dyrket med PF179T CAF udtrykker GFP. De samme forsøgsbetingelser, ekstracellulær matrix ekstrakter og andre indstillinger som ovenfor blev anvendt. Dannelsen, vækst, differentiering og morfogenese af tumor organoids, samt dannelsen af ​​multicellulære strukturer fra enkelte CAF blev overvåget over en periode på 14 dage, hvorefter billeddannelse blev udført. The FAK 3D co-kultur indstillingen var den samme som den LIVE indstilling med tilføjelse af fokal adhæsion kinase (FAK) hæmmere Y11 og PF-573.228 købt hos Tocris Bioscience. De tre betingelser var: DMSO kontrol (0,01%), 5

μ

M koncentration af Y11 og 5

μ

M koncentration af PF-573.228

Multikanal 3D konfokal digitalt. billeder blev erhvervet hvor tumorcellerne og CAF blev afbildet separat. Begge celletyper er præsenteret nedenfor i forskellige (falske) farvekanaler: rød for tumorceller og grønt til CAF. De data, IF og live-billede blev erhvervet med en Zeiss Axiovert-200M mikroskop, er udstyret med en Yokogawa CSU22 spinning-disk konfokal enhed ved hjælp af en Zeiss Plan-Neofluar 20 × objektiv (blændetal 0,17). IF billeddata består af 8 stakke af billeder, mens LIVE billeddata består af 12 stakke af billeder. Hvert billede har dimension 512 × 672 pixels og antallet af billeder i en enkelt stak spænder fra 9 til 22. For alle billeder fra begge datasæt, én pixel ≈ 0,5

μ

m i et billede, og afstanden mellem tilstødende billeder i en stak er 10

μ

m. De FAK billeddata blev erhvervet med samme mikroskop indstillinger ved hjælp af en Zeiss Plan-Neofluar 5 × mål (blændetal 0,16), og består af 24 stakke af billeder (8 for hver betingelse). En pixel ≈ 2,5

μ

m i et billede, og afstanden mellem tilstødende billeder i en stak er 40

μ

m. Hvert billede har dimension 512 × 672 pixels, og antallet af billeder i en enkelt stak er 18.

En uafhængig, lavere kompleksitet 2D-billede datasæt (BBBC003v1), forudsat i de overordnede BioImage Benchmark Collection [32] er også anvendes til segmentering validering. Dataene består af 15 billeder af enkelte flercellede musefostre, som hver især er en 640 × 480 pixel gråskalabillede fanget med differential interferens kontrast mikroskopi og med slebet sandhed segmentering af hele embryo struktur. Vi anser desuden segmentering ydeevne med 2D fasekontrast ‘Melanom «og» Tscratch’ billeddata (BBBC019), også fra de overordnede BioImage Benchmark Collection. De melanom billeddata består af 20 billeder med hver dimension 1024 × 1280 pixel, mens Tscratch billeddata består af 24 billeder med hver dimension 1028 × 1384 pixels. Begge datasæt er fra ‘sårheling eksperimenter med jorden sandheden segmentations også leveres.

Segmentering metode

Inden for Markov random felt (MRF) rammer, hver pixel i et digitalt billede er givet en etiket fra nogle foruddefinerede sæt (klassisk “forgrunden” og “baggrund” for segmentering). Vi finder mærkningen, der optimerer en tilsvarende energi funktion, så etiketten på hver pixel svarer til den observerede pixelværdi og så, at der er en “glat” mærkning i hele billedet. For hver pixel

jeg

i et digitalt billede, lad

X

jeg

og

Z

i

være tilfældige variabler for pixel label (ubemærket) og pixel intensitet (observeret) hhv. Lad indsamling af stokastiske variable for alle pixels har den betingede uafhængighed grafen givet i figur 1. Derefter indsamling af stokastiske variable er en betinget MRF med tilsvarende energi-funktion (1) for pixels

jeg

og tilstødende par af pixels (

jeg

,

j

) med etiketter

l

k

, og hvor

jeg

er indikator funktion, ( 2)

Vi finder de mindstekrav energimærker (segmentering)

de monadiske potentialer

u

jeg

;

l

er defineret til at være (3) hvor

z

jeg

er den observerede pixel værdi og π

l

er sandsynligheden tæthed funktion svarende til at mærke

l

. De parvise potentialer

w

ij

;

lk

er defineret til at være (4), hvor

z

i

z

j

er de observerede pixelværdier,

λ

0,

λ

1 og

β

er parametre der skal indstilles, og dist (

jeg

,

j

) er afstanden mellem pixels

jeg

og

j

. Bemærk, at afstanden kan være forskellige for nabolandet pixels i et billede i forhold til de omkringliggende pixels mellem billeder, afhængigt af opløsningen på billeddataene i hver dimension.

De knudepunkter og kanter af en betinget uafhængighed graf indkode den betingede uafhængighed egenskaber af det tilsvarende sæt af tilfældige variable. I den betingede MRF graf (figur 1), hver kant svarer til enten en unary (

X

jeg

,

Z

i

) eller parvis (

X

jeg

,

X

⋅) potentiale i den tilsvarende energi funktionen Eq (1). Figur 1 viser en 6-nabo betinget MRF (6 parvise potentialer for hver pixel), som vi bruger til vores 3D segmentering metode. Hver pixel har 4 naboer inden et billede og 2 naboer mellem billeder i 3D-stak, med mindre naboer til pixels på grænsen af ​​stakken.

monadiske og parvise potentialer etablere korrespondance og “glathed” af samlede pixel mærkning hhv. Parametrene

λ

0,

λ

1 og

β

bestemme mængden af ​​indflydelse, at de parvise potentialer har gennem monadiske potentialer i minimering af energien funktion (1). Afvejningen er, at vi har brug for en mærkning med “glat” sammenhængende segmenterede regioner (omkringliggende pixels har den samme etiket), men ønsker også at bevare diskontinuiteter til stede i billedet (S1 Fig). Formen af ​​de monadiske og parvise potentialer er standard for MRF segmentering problem [33]. Potentialerne tilfredsstille sub-modularitet tilstand, som garanterer, at der findes et minimum energiløsning i den binære label sagen og giver mulighed for en tilnærmelse af den mindste energiløsning i multi-label tilfælde [34].

For at indstille monadiske potentialer ligning (3) vi har brug for en tæthedsfunktion π

l

over pixel værdier svarende til hver etiket

l

. Standarden metode er at ansætte en “interaktiv segmentering« procedure, og har brugeren manuelt “frø” områder af billedet for hver etiket [33]. Derefter er de empiriske fordelinger af de seedede regioner brugt til at beregne unære potentialer. I stedet for manuelt at podning af billedet, vi passer en univariat Gaussisk blanding model med tre komponenter til tætheden af ​​de observerede pixelværdier i de røde og grønne kanaler separat. De tætheder anvendes til segmentering etiketterne derefter todimensionale blandinger af de univariate komponenter opnået i hver farvekanal (figur 2) Salg

De tre mærker er:. »I fokus ‘tumorceller med en blanding af’ ude af fokus »CAF og” baggrund “i den anden dimension (rød),” i fokus “CAF med en blanding af ‘ude af fokus’ tumorceller og” baggrund “i den anden dimension (grøn) og en blanding af ‘ude af fokus’ og “baggrund” i begge dimensioner (stiplet).

parametrene

λ

0,

λ

1 og

β

er indstillet baseret på fordelinger af de monadiske potentialer for at afbalancere afvejning mellem korrespondance og glathed i segmentering output. Selv om der er fremgangsmåder til at lære disse parametre under anvendelse af et træningssæt af formalet sandhed mærkede billeddata, disse metoder er meget beregningsmæssigt dyre og så ikke ofte anvendes i praksis [35]. Desuden en grund sandhed mærkning er sjældent tilgængelige i de fleste programmer. For hver stak billeder setandso vi, at de monadiske og parvise potentialer deler samme interval. Værdien af ​​

β

indstilles manuelt på en kandidat stak af billeder og den samme værdi bruges til alle andre stakke fra samme eksperiment.

Som en forbehandling trin, bruger vi en lokal entropi filter [9] at kvantificere lokal tekstur (indbygget funktion entropyfilt i Matlab Image Processing Toolbox). Den lokale entropi filter anvendes på både de røde og grønne kanaler separat. De rå gråtonebilleder er ned-samplet til 8-bit, således at hver pixel direkte svarer til en intensitet værdi i sættet {0, 1, …, 255}. For hver pixel

i

, den lokale entropi filtrerede værdi iswhere

s

j

er andelen af ​​pixels i nabolaget, der har samme intensitet til pixel

j

. Kvarteret af hver pixel

i

er 9 × 9 firkantede centreret om pixel

i All Inclusive med symmetrisk polstring omkring grænsen af ​​billedet.

Vores 3D segmentering metode er sammenfattet i de følgende trin (fig 3):

Process 3D-stak af billeder ved hjælp af den lokale entropi filteret i det røde (tumor celler) og grønne (CAFS) kanaler separat,

Tilpas univariate Gaussisk blanding modeller til de filtrerede pixelværdier i det røde (tumor celler) og grønne (CAF) kanaler separat,

Kombiner blandingen tætheder (fig 2), og beregne monadiske og parvise potentialer,

Find den mindste energimærkning.

Konfokal mikroskopi anvendes til at afbilde 3D co-kultur-modeller resulterer i en 3D stak billeder. Vores 3D segmentering metode anvendes til 3D stak billeder resulterer i 3D segmentering output.

Vi implementerede vores segmentering metode i MATLAB og brugte

α

-expansion algoritme til at finde den minimum energimærkning [34, 36, 37].

Validering metode

Ingen enkelt værktøj er til rådighed til at udføre den nødvendige segmentering for eventuelle givet datasæt. Hver metode har sine egne fordele og ulemper og er ofte skræddersyet til specifikke anvendelser såsom anvendelse inden form, når segmentering enkelte celler eller cellekerner [25-27]. Selv om der findes mange avancerede segmentering metoder, vi er ikke bekendt med nogen, der ville være egnet til at gælde for de 3D stak billeddata fra vores komplekse 3D cellekultur-model. Derfor bruger vi til sammenligning en serie af standard segmentering metoder, der kan anses for at “opbygge” til vores MRF tilgang:

intOtsu Brug Otsu metode [38] for at tærsklen de røde og grønne intensitet kanaler separat og kombinere etiketterne, så ‘tumor celle “eller” CAF “overskriver” baggrund’, eller hvis en pixel er mærket både ‘tumor cell «og» CAF “det er tilfældigt tildelt én af disse etiketter.

entOtsu Brug Otsu metode til tærsklen for lokale entropi filtreret røde og grønne kanaler separat og kombinere etiketterne efter samme procedure som ovenfor.

blandinger tærskling de lokale entropi filtrerede billeder ved hjælp af bivariate blandingen tætheder (fig 2).

MRF metoden præsenteres i dette papir.

Otsu metode finder den globale tærskel, der maksimerer inter-klassen varians af de resulterende grupper, og er en udbredt teknik til grundlæggende gråskalabillede segmentering [ ,,,0],9]. Blanding modeller er selv også i vid udstrækning anvendes til mange billede segmentering applikationer [39]. Da de bivariate blandinger bruges til at beregne de monadiske potentialer i vores MRF baseret segmentering metode, de »blandinger« metode svarer til MRF metode præsenteres i dette papir med

λ

0 =

λ

1 = 0.

Resultaterne af de fire segmentering metoder sammenlignes med de jorden sandheden etiketter ved hjælp af den overordnede makro F

1-score, det harmoniske gennemsnit af præcision klassifikation og huske [40]. Derfor F

1-score = 1 for en perfekt mærkning. IF og LIVE billeddata samt anvendes de uafhængige mus embryo billeddata til validering.

Resultater og Diskussion

Vi præsenterer en række resultater for at drøfte fordelene ved vores MRF metode til vores særligt komplekse biologiske ansøgning, navnlig multikanal 3D billeddata med store afstande mellem billeder i stakken. Brug af 3D segmentering output, er det muligt at undersøge om tumorceller og CAF danner celle-celle-kontakter eller er fysisk adskilt i vores 3D co-kulturmodel, som har vigtige konsekvenser for tumor biologi. Vi viser desuden anvendeligheden af ​​den lokale entropi filter og at vores MRF tilgang opnår de mest nøjagtige segmentering resultater. Koden for vores segmentering metode, billeddata og jorden sandhed etiketterne leveres alle som supplerende materiale (S1, S2 og S3-filer).

Segmentering output foreslår fysisk kontakt af flercellede tumor og CAF strukturer

produktionen af ​​vores 3D segmentering metode kan bruges til at undersøge, om multicellulær tumor organoids og CAF strukturer er i direkte kontakt.

Brug konfokal mikroskopi af billedet 3D cellekultur resulterer i en 3D stabel af billeder svarende til en række parallelle brændplaner. En maksimal intensitet projektion kan opnås ved at projicere de maksimale intensitet pixelværdier i (

x

,

y

) planet. Selv om en betydelig mængde information kan gå tabt, den potentielle 2D-billede analyse er langt mere udviklet og mindre beregningsmæssigt billigere end at overveje hele 3D stak billeder. Af disse grunde er de nuværende billede analyse rammer for 3D-cellekultur modeller af prostatakræft baseret på maksimale projektioner intensitet [41, 42]. Selvom maksimale projektioner intensitet kan være egnet til at analysere monokultur modeller for visse applikationer, er de ikke egnede til mere komplekse organotypiske modeller som co-kultur-modeller. Eftersom alle strukturelle information projiceres ind i (

x

,

y

) plan, ville det ikke være muligt at bestemme, om tumor organoids og CAF er i direkte kontakt eller fysisk adskilt under anvendelse af en 2D analyse .

fig 4 (a) viser den maksimale intensitet fremskrivning af både de røde og grønne kanaler (falsk farve) for et eksempel 3D stakken. Det er fortsat uklart, om den centrale tumor og CAF strukturer er i direkte kontakt. CAF strukturer synes at være placeret i tumor struktur (blå pil), som er biologisk relevant. I kliniske tumorprøver, er fibroblaster ikke typisk findes inden tumor organoids, men karakteristisk kun surround epiteliale (tumor) aggregater. Kun lejlighedsvis kan CAF komme i kontakt med tumorceller på overfladen af ​​tumor strukturer.

(a) Maksimal projektion af et repræsentativt 3D stak. (B) – (d) Forskellige synspunkter på den tilsvarende 3D-segmentering output ved hjælp af vores MRF metode. Den blå pil viser hvor CAF synes at være inde i svulsten organoide i maksimal intensitet projektion, men kan ses at være udenfor i 3D segmentering output. Se S1 Video til en video af 3D segmentering output.

3D segmentering af tumorcellerne (rød) og CAF (grøn) er illustreret i figur 4 (b) og 4 (d). Segmenteringen output specifikt fremhæver de segmenterede regioner svarende til CAF strukturer, der er i direkte kontakt med de segmenterede regioner svarende til flercellede tumor struktur. Navnlig de CAF der dukkede blive placeret inde i tumoren struktur i den maksimale intensitet fremspring (figur 4 (a)) kan nu ses at være uden for, men er i kontakt med begge sider af den centrale tumor organoide (blå pil). S1 Video giver ekstra synspunkter på 3D-segmentering.

3D afsmeltet segmentering output (Fig 4 (b) og 4 (d)) ser snarere ‘blokformede «, især i

z

hvor tumor organoide har en ‘flad top’. Dette er en funktion af billeddata og skyldes den relative sparsomme data i

z

. Det ville ikke være hensigtsmæssigt at ekstrapolere rendering så tumor organoids ligner mere “runde sphæroider” i 3D, da dette ville potentielt forvirre vigtig strukturel information og vil ikke blive understøttet af løsningen af ​​billeddata.

det er muligt manuelt at identificere, om og som segmenteret CAF regioner er i direkte kontakt med de segmenterede tumor organoids med visualisering leveres af vores 3D segmentering output. For at demonstrere en proof of concept for automatisk at kvantificere tumor-stroma kontakt med segmentering output, mener vi de FAK billeddata (S2 Fig). Med vores MRF segmentering, mener vi, at kontakten mellem de “tumorceller ‘og’ cafeer ‘segmenterede regioner vil give et skøn over tumor-stroma kontakt i modellen.

Figur 5 viser scatter plots af totalvolumen , samlede areal og det samlede kontakt til de segmenterede ‘tumorceller’ og ‘cafeer regioner i FAK billeddata. Samlet volumen er det samlede antal af mærkede pixels, samlede overfladeareal er det samlede antal af mærkede pixels støder op til en pixel med en anden etiket og total kontakt er det totale antal af mærkede tumorceller ‘og’ cafs ‘pixler, der er tilstødende. Samlet volumen og samlede overfladeareal af både tumor organoids og CAF strukturer er generelt mindre ved FAK inhibering (figur 5 (a) og 5 (b)), og dette er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser [29]. DMSO kontrol viser en baseline af tumor-stroma kontakt (figur 5 (c)) og FAK hæmmere klart forstyrre denne kontakt. Med inhibitoren Y11, synes der at være mindre kontakt i gennemsnit, men kontakten er også mere variabel. Der er to billedstakke der har højere samlede volumen, areal og kontakt især (angivet med blå asterisk i S2 Fig). Det er klart, at PF-573.228 inhiberer tumor organoide vækst (figur 5 (a) og 5 (b)), og derfor er der kun få fysiske kontakt mellem de to celletyper (figur 5 (c)). En Kruskal-Wallis test blev udført på total kontakt (figur 5 (c)), og nulhypotesen, at de forskellige prøver er alle realiseringer af samme fordeling blev afvist (p-værdi = 2,6 × 10

-4). Tilsvarende parvise sammenligninger blev udført under anvendelse af Mann-Whitney

U

test.