PLoS ONE: nanosekund pulserende elektrisk felt Forhindrer Cancer Growth Efterfulgt af Ændring i udtryk af NF-KB og Wnt /β-Catenin Signaling Molecules

Abstrakt

Kræft er fortsat en førende dødsårsag på verdensplan og samlede antal sager globalt er stigende. Nye behandlingsstrategier derfor desperat kræves til radikal behandling af kræft og lang overlevelse af patienter. En ny teknologi ved hjælp af høj pulserende elektrisk felt er fremgået af militær anvendelse i biologi og medicin ved at anvende nsPEF som et middel til at inhibere cancer. Men molekylære mekanismer i nsPEF om tumorer eller kræftformer er stadig uklart. I dette papir, fandt vi, at nsPEF havde omfattende biologiske virkninger i kræft, og afklaret dens mulige molekylære mekanismer

in vitro

og

in vivo

. Det kunne ikke blot inducere celleapoptose via afhængige-mitokondrier iboende apoptose pathway, der blev udløst af ubalance af anti- eller pro-apoptose-Bcl-2-familien proteiner, men inhiberer også celleproliferation gennem undertrykke NF-KB-signalvejen til at reducere udtryk for cyclin proteiner . Desuden kunne nsPEF også inaktivere metastaser og invasion i cancerceller ved at undertrykke Wnt /β-Catenin signalvejen til nedregulere udtryk for VEGF og MMP’er familiens proteiner. Endnu vigtigere, nsPEF kunne fungere sikkert og effektivt som en anti-cancer terapi gennem overtalelse tumor celle apoptose, ødelægge tumor mikromiljø, og deprimerende angiogenese i tumorvæv

in vivo

. Disse resultater kan give en kreativ og effektiv terapeutisk strategi for kræft

Henvisning:. Ren Z, Chen X, Cui G, Yin S, Chen L, Jiang J, et al. (2013) nanosekund pulserende elektrisk felt Forhindrer Cancer Growth Efterfulgt af Ændring i udtryk af NF-KB og Wnt /β-Catenin signalmolekyler. PLoS ONE 8 (9): e74322. doi: 10,1371 /journal.pone.0074322

Redaktør: Irina U Agoulnik, Florida International University, USA

Modtaget: May 10, 2013; Accepteret: 25 Juli 2013; Udgivet: 17 september, 2013 |

Copyright: © 2013 Ren et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National S T Major Project Kina (2012ZX10002-017, 2012ZX10002-004), NSFC for innovativt Group of China Research (81.121.002), Zhejiang Medical Research Funding (2008B079, LY13H180003), SRF for ROC’er, SEM (J20120279 ), og Xinjiang Videnskab og Teknologi Bureau Project (2013911131). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft er stadig en førende dødsårsag på verdensplan og tegnede sig for 7,6 millioner dødsfald (ca. 13% af alle dødsfald) i 2008 i henhold til WHO, og dødsfald som følge af kræft forventes at stige til over 11 millioner i 2030 [ ,,,0],1]. En betydelig del af cancere kan kureres ved kirurgi, strålebehandling eller kemoterapi, især hvis de opdages tidligt. Imidlertid kan nogle former for kræft ikke blive opdaget i tidligt stadium og har lidt reaktion på strålebehandling og kemoterapi, således patienter med sådanne cancerformer har en dårlig prognose. For eksempel, pancreascancer har ca. 23% 1-års overlevelse efter diagnose og 5% 5-års overlevelse i bedste [2]. Endvidere var der en anslået 43,140 nye tilfælde og 36, 800 dødsfald tilskrives bugspytkirtelkræft i USA [3,4]. Det er vigtigt at søge efter en ny terapi teknik til at forbedre prognosen og overlevelse af kræftpatienter.

En ny teknologi ved hjælp af høj pulserende elektrisk felt er opstået fra militær anvendelse i biologi og medicin ved at anvende nanosekund puls elektrisk felt (nsPEF ) som et middel til at inhibere cancer [5]. Den vigtigste egenskab ved nsPEF er dens høj effekt og lav energi fører til meget lidt varme produktion og dens særlige evne til at trænge ind i cellen for at påvirke intracellulære organeller [6,7]. Helt forskellig fra klassisk plasmamembranen elektroporation, kan nsPEF producere meget komprimeret effekt (milliarder af watt), ultra korte puls varigheder (nanosekund), hurtige stigning gange (nanosekund) og høje elektriske felter (kV /cm). Den resulterende nanosekund puls kan trænge ind i cellen, inden plasmamembranen er fuldt opladet tillader nsPEF at have minimal indflydelse plasmamembranen derfor ikke forårsager elektroporering [8]. De seneste år, undersøgelser er blevet udført for at bestemme virkningerne af nsPEF i eksperimentelle og model research. Resultaterne viste, at nsPEF kunne inducere apoptose i forskellige cancer cellelinjer

in vitro

[9,10] og en fibrosarcom tumor

ex vivo

[7], og udrydde B16F10 melanom tumor

in vivo

[11,12,13]. Men molekylære mekanismer i biologiske effekter af nsPEF på tumorer eller kræftformer er stadig uklart.

I denne forskning, vi søgte at undersøge anti-cancer effekt af nsPEF og dens mulige molekylære mekanismer gennem

in vitro

og

in vivo

eksperimenter. Her viste vi, at nsPEF væsentlig grad kan hæmme væksten af ​​kræft

in vitro

in vivo

via induktion af apoptose, hæmme proliferation, inaktivere invasion og metastase, og ødelægge tumor mikromiljø, som vil give en roman og effektiv terapeutisk strategi til cancere.

Materialer og metoder Salg

Cellekultur

Humant pankreatisk carcinom cellelinje (PANC-1) og HCC cellelinie (Hep-3B) var købt fra Cell Bank of Chinese Academy of Science (Shanghai, Kina). Begge cellelinier blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM, Gibco-Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS, SAFC Biosciences, Lenexa, KS, USA), 100 enheder /ml penicillin og 100 mg /ml streptomycin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA).

Induktion af celledød ved nsPEF

som vores tidligere beskrivelse [11], nsPEF generator med varighed på 100 -NS blev vist i fig S1. Elektriske felter varierede fra 20kV /cm til 60kV /cm. Bølgeformer blev overvåget med en digital fosfor oscilloskop (fig S1 A B, DPO4054, Tektronix, USA) udstyret med en høj spænding sonde (P6015A, Tektronix, USA). PANC-1-celler blev høstet med trypsin og resuspenderet i frisk DMEM medium med 10% FBS til en koncentration på 5,0 × 10

6 celler /ml. 500 gi cellesuspension blev anbragt i et 0,1 cm mellemrum kuvette (fig S1 C, Biosmith, aluminium pladeelektroder) og eksponeret for 100 pulser ved 0, 20, 40 og 60 kV /cm elektrisk feltstyrke hhv. De fleste af påvisninger af cellereaktioner blev udført ved 1 h efter behandling, hovedsagelig herunder transwell assay celle TEM, DNA-stige-assay, celle TUNEL assay, flowcytometri og western-blot. Cellelevedygtighed og proliferativ inhiberingshastighed blev målt på forskellige tidspunkter efter behandling for at observere en gradvis aktiv proces. De hele forsøg blev gentaget tre gange.

Måling af cellelevedygtighed og proliferativ inhiberingshastighed

Panc-1-celler blev udsat for nsPEF og derefter dyrket. 2 × 10

5 celler blev udsat for nsPEF med forskellige intensiteter, og derefter dyrket i 0, 0,5, 1, 2, 24 og 48 timer hhv. Cellerne blev trypsiniseret og levedygtige celler blev talt ved et cellelevedygtighed analysator (Vi-celle, Backman). Efter inkubation i 24, 48 og 72 timer henholdsvis blev celler beregnet ved Cell Counting Kit-8 (CCK-8) assay (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan) ifølge producentens instruktioner, som afspejler celleproliferativ inhibering.

påvisning af celle metastase og invasion evne med transwell assay

1 time efter nsPEF behandling blev de behandlede overlevelse celler på samme tal, der fås til at udføre transwell assays baseret på transwell kamre (Millipore, USA), hvilket afspejler celle metastase og invasion evne, som tidligere beskrevet [14].

Observation af celle ultrastruktur af TEM

1 time efter nsPEF behandling, de behandlede celler blev opnået og fikseret med 2,5% glutaraldehyd at observere celle ultrastruktur ved transmission elektron mikroskopi (TEM) i Imaging Facility af Core Faciliteter, Zhejiang University School of Medicine, som tidligere beskrevet [15].

Bestemmelse af DNA fragmentering med DNA stigen assay

på en t efter nsPEF behandling blev de behandlede celler opnået at undersøge celle DNA fragmentering ved DNA-stige-assay ifølge fabrikantens instruktioner som tidligere beskrevet [11].

Måling af enkelt-celle apoptose med TUNEL-assay

Ved 1 time efter nsPEF behandling blev de behandlede celler opnået til bestemmelse encellede apoptose under anvendelse af assayet ifølge TdT-dUTP Terminal Nick-endemærkning (TUNEL) med

In situ

Celledød Detection Kit (Millipore, USA) ifølge fabrikantens instruktioner som tidligere beskrevet [14].

påvisning af celleapoptose med flowcytometri

1 time efter nsPEF behandling blev de behandlede celler opnået at detektere celle apoptose ved annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit (BD Biosciences) som tidligere beskrevet [16].

Analyse af cellecyklus med flowcytometri

1 time efter nsPEF behandling, de behandlede celler blev opnået til bestemme cellecyklus forandring. Celle cyklus assay og analyse blev udført som tidligere beskrevet [17].

Western blotting-analyse

1 time efter nsPEF behandling blev de behandlede celler opnået at udvinde protein. Protein ekstraktion og Western blotting-analyse blev udført som tidligere beskrevet [18]. Primære antistoffer og detaljer er angivet i tabel S1.

Tumor induktion i nøgne mus med Hep-3B celler

De 5 uger gamle nøgne mus blev købt fra Shanghai Experimental Animal Centre, Chinese Academy of Science . Forsøgsdyr blev holdt i den centrale dyr facilitet i Zhejiang University School of Medicine og har til huse i laminar- fl ow kabinetter under speci fi kke patogenfrie forhold ved 22 ° C med en 12 timers lys /mørke cyklus. Alle mus blev bedøvet med ketamin (100 mg /kg intraperitoneal). Tumorbærende mus modeller blev etableret via injektion af 2 x 10

6 Hep-3B-celler i højre abdomen hos mus. Ved 1 uge efter celle injektion, tumor var typisk 3 mm bred og havde udstillet angiogenese. Når tumorerne voksede til 10 mm brede eller mere — typisk ca. 4 uger efter celleinjektion blev 50 tumorbærende musemodeller succes etableret og opdelt i to grupper: Kontrolgruppe (n = 17) og nsPEF gruppe (n = 33) . Musene i nsPEF gruppe blev eksponeret for nsPEF (fig S1 D 0.05.

Resultater og Diskussion

På trods af en intensiv indsats i kræft behandling praksis, overlevelsesrater for nogle former for kræft ikke er blevet væsentligt forbedret i de seneste år, såsom kræft i bugspytkirtlen [2], prostata carcinom [20] og lungekræft [21]. Hidtil ukendte behandlingsstrategier er derfor desperat nødvendig til behandling af cancere og lang overlevelse af patienter. Under flertrins udvikling, menneskelige kræftformer erhverve ti biologiske kendetegn, herunder modstå celledød, opretholdelse proliferativ signalering, aktivering invasion og metastase, så replikativ udødelighed, unddrage vækst undertrykkere, overtalelse angiogenese, omprogrammering af energi metabolisme, unddrager sig immun ødelæggelse, tumor-fremmende inflammation, og genom ustabilitet og mutation [22,23]. Disse kendetegn udgør en organiserende princip for rationalisering af kompleksiteten af ​​neoplastisk sygdom og også bliver store mål for kræftforskning og terapeutiske strategier. Som en relativt ny teknologi til at fortolke kræft, nsPEF er effektiv i forskellige cellelinjer

in vitro

[5,9,10], og B16F10 melanom og hepatocellulært carcinom [11,24], samt menneskets bugspytkirtel carcinom [25]

in vivo

, viser potentiel anvendelse udsigten til nsPEF for kræftbehandling. Men indtil nu er det stadig uklart, om molekylære mekanismer i nsPEF på kræft.

I denne undersøgelse anvendte vi kræftmodeller både

in vitro

og

in vivo

eksperimenter til søgning efter mulige molekylære mekanismer.

NsPEF induceret kræft celler død og proliferativ hæmning

in vitro

for at løse effekt af nsPEF i Panc-1 celler, cellerne blev udsat for nsPEF med elektriske felt ved 0, 20, 40 og 60 kV /cm (figur 1A). Hastigheden af ​​levedygtige celler /kontrol blev detekteret ved at tælle trypanblåt negative celler ved 0h, 0,5H, 1 h og 2 h efter puls (figur 1B). Vi fandt, at levedygtige celler skrive puls var betydeligt reducerede sammenlignet med kontrolgruppen (p 0,001), men tidsafhængig måde og dosisafhængig måde af denne reducerede tendens blev ikke observeret i en kort tid efter impuls, i det mindste inden 2 timer. Desuden behandlede celler blev dyrket i 24 timer og 48 timer, og derefter beregnet henholdsvis. Vi fandt, at de levedygtige celler blev også bemærkelsesværdigt reduceret i forhold til kontrollen (både p 0,001) (Figur 1C 0,001. (C og D) antallet af levedygtige celler blev beregnet efter udsættelse for nsPEF med forskellige intensiteter i 24 timer og 48 timer henholdsvis. * P 0,05, *** p 0,001. (E) Ifølge CCK-8-assayet, blev påvist hæmning satser af celleproliferation induceret af nsPEF med forskellige intensiteter. ** P. 0,01

NsPEF induceret celle apoptose via den afhængige-mitokondrier iboende apoptosecyklus

in vitro

For det første at undersøge død egenskaber induceret af nsPEF i pancreas carcinomceller, vi har registreret morfologi ændringer i celler efter behandling ved TEM (figur 2A). Apoptotiske karakteristika for celler blev sjældent observeret i kontrolgruppen (0kV /cm). Men behandlede celler med 20kV /cm nsPEF begyndte at præsentere cellemorfologi ændring af tidlig apoptose: nuklear krympning, nuklear hak, kromatin kondensering og marginering, og mindre mitokondrier degeneration. Under effekt af 40 kV /cm nsPEF, blev observeret yderligere ændringer, hovedsagelig herunder kromatin sammenklumpning, cytoplasma kondenserende og nogle celleblærer optræder på cellemembranen eller i cytoplasma. I mellemtiden blev kernefragmenter og cytoplasma bestanddele pakkes i apoptotiske legemer, og mitokondrier viste vakuolær degeneration. Når elektriske felter øges op til 60kV /cm, behandlede celler præsenterede membranlyse, blæredannelse kernemembranen, nuklear lyse og fragmentering samt mitokondrier skader, der typisk blev betragtet som nekrose.

(A) Morfologi ændringer for kræft celler udsat for nsPEF med forskellige intensiteter blev observeret ved celle transmissionselektronmikroskopi (TEM). N: nukleare ændringer, herunder nuklear krympning, blebbing kernemembranen og nuklear lysis. M: mitokondrier degeneration eller vakuolær degeneration. (B) Enkelt celle apoptose af cancerceller udsat for nsPEF med forskellige intensiteter blev beregnet ved celle TUNEL assay. Original forstørrelse, 400 ×. *** P 0,001. (C) Cell DNA-fragmentering af cancerceller udsat for nsPEF blev observeret ved apoptose DNA-stige-assay. (D) Apoptosis satser af cancerceller udsat for nsPEF med forskellige intensiteter blev testet med PI og Annexin-V-farvning-assay ved flowcytometri. Resultater blev analyseret ved FlowJo 7.6.1 Software. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001. (E) Protein udtryk for anti- /pro-apoptose Bcl-2-familien, cytochrom C og caspase-3 i cancerceller efter udsættelse for nsPEF med forskellige intensiteter blev påvist ved Western-blot-assay. Relative intensitet af hvert protein blev analyseret ved Photoshop CS4-software. * P 0,05, ** p 0,01, *** p. 0,001

Efterfølgende vi studerede DNA-skader og fragmentering af TUNEL assay og apoptose DNA stigen assay. I TUNEL-farvning, etiketterne kombineret beskadigede steder af DNA og apoptotiske celler blev farvet brunlig-gul. Vi observerede, at TUNEL-positive rater var naturligvis stiger op i PANC-1-celler også puls ved 20, 40 og 60 kV /cm sammenlignet med kontrollen, henholdsvis (alle p 0,001) (Figur 2B). I overensstemmelse med TUNEL resultater, DNA-fragmentering præsenteret i PANC-1-celler udsat for nsPEF ved 20 og 40 kV /cm sammenlignet med positiv kontrol og negativ kontrol fra DNA-stige-assay (figur 2C).

For yderligere at undersøge apoptotisk grad i kræftceller skrive puls, vi testede apoptotiske satser for behandlede celler med Annexin-V /PI-farvning ved flowcytometri (figur 2D). Sammenlignet med den kontrol, satsen for Annexin V

PI

– celler (levedygtige celler) var signifikant faldt efter udsættelse for nsPEF, men hastigheden af ​​Annexin V

+ PI

– celler (tidlig apoptose) blev bemærkelsesværdigt forøget ved 20kV /cm (p 0,001), og derefter faldt betydeligt på 40 kV /cm (p 0,05) og 60kV /cm (p 0,01). I skarp kontrast, blev hastigheden af ​​Annexin V

+ PI

+ celler (sen apoptose eller nekrose) konstant stigende dosis-afhængighed på 20, 40 og 60 kV /cm (alle p 0,01). Disse data foreslåede celler død som følge af nsPEF præsenteret fra tidlig apoptose til sen apoptose eller nekrose med øgede intensiteter af nsPEF, med andre ord, dosis-afhængighed. Disse resultater var identiske med vores resultater via celle TEM.

Seneste undersøgelser viste, at apoptose spiller en vigtig rolle i celledød induceret af nsPEF [11,26]. I overensstemmelse med disse undersøgelser, fandt vi apoptotisk krop og mitokondrier degeneration af TEM efter nsPEF behandling. Endvidere resultater af TUNEL-assay, apoptose DNA-stige-assay og Annexin-V /PI-farvning viste sig også apoptose induceret af nsPEF i PANC-1-celler. Nogle undersøgelser [5,9], at kræft celledød induceret af nsPEF hovedsageligt blev tilskrevet apoptose, og fortolket denne forhøjelse på Annexin V

+ PI

+ celler i dosis-afhængighed kan tilskrives en særlig “efterligne nekrose “at højdosis puls induceret større huller i cellemembraner og derefter indtastede PI pletten celler. vores yderligere bevis via celle TEM viste sig imidlertid, at celledød præsenteret fra tidlig apoptose til sen apoptose eller nekrose med øgede intensiteter af nsPEF, ikke bare-apoptose.

Den indre apoptose induceret af stress-fremkaldende stimuli og ydre apoptose via død receptoraktivering er to primære veje for apoptose. Mitokondrier funktion og anti /pro-apoptose Bcl-2 proteiner familie spiller væsentlige roller i indre apoptose pathway [27]. Anti- /pro-apoptose Bcl-2-proteiner familiemedlemmer er oprindeligt integrale membranproteiner findes i mitokondrier, endoplasmatiske reticulum (ER) eller nuklear membran [28]. En vigtig aktiverende site af Bcl-2-proteiner er mitochondriemembran [27]. At udforske mulige mekanismer apoptose induceret af nsPEF, opdaget vi relative proteiner udtryk for den iboende apoptosecyklus, såsom pro-apoptose Bcl-2 familie proteiner (Bad, p-Bad, Bax, Bik, Bim, BID, Bak og Puma) , pro-overlevelse Bcl-2-familien proteiner (p-Bcl-2, Bcl-2, Bcl-xL og Mcl-1), og apoptose direkte relative proteiner (cytochrom-C og caspase-3) (Figur 2E). Sammenlignet med kontrollen, var udtryk for anti-apoptose-Bcl-2-familien proteiner, hovedsagelig herunder p-Bcl-2, Bd-XL og MCL-1, reduceres betydeligt ved forskellige grader, mens udtryk for pro-apoptose-Bcl-2-familien proteiner , hovedsagelig herunder Bax, Bim og BID, var signifikant forhøjet ved forskellige grader med øgede intensiteter af nsPEF. I mellemtiden, udtryk for cytochrom-C og caspase-3 var naturligvis forøget efter udsættelse for nsPEF. Vi konkluderede, at apoptose induceret af nsPEF blev udløst ved at regulere ubalance af anti- eller pro-apoptose-Bcl-2-familien proteiner på den mitokondriske membran. Disse resultater var i overensstemmelse med mitokondrier degeneration og skader i celle ultra-struktur. Kollektivt, disse apoptotiske data viste, at nsPEF induceret apoptose i Panc-1-celler via afhængige mitokondrier iboende apoptose pathway, der blev udløst af ubalance af anti- eller pro-apoptose-Bcl-2-familien proteiner.

NsPEF inhiberede celleproliferation via undertrykke NF-KB-signalvejen

in vitro

Udover apoptose, nsPEF havde en bemærkelsesværdig indflydelse på celledeling fra vores CCK-8 assay at hæmning på celledeling bemærkelsesværdigt blev øget på en måde, af dosis-afhængighed og tid-afhængighed efter 48 timer efter puls. I cellecyklus, at oversættelsen fra fase G1 fase S og procentdelen af ​​fase G2 /M afspejler typisk celle proliferativ evne. Vi undersøgte celle cyklus af behandlede celler, og fundet, at procentdelen af ​​fase G1 tydeligvis blev forøget (p 0,01), mens procentdelen af ​​fase G2 /M blev reduceret (p 0,05) efter udsættelse for nsPEF (figur 3A), hvilket indikerer, at nsPEF kunne standse fase G1 af cellecyklus at inhibere celleproliferation.

(A) Cell cyklus af cancerceller udsat for nsPEF med forskellige intensiteter blev undersøgt med PI-farvning-assay ved flowcytometri, og resultaterne blev analyseret ved FlowJo 7.6 0,1 Software. * P 0,05, ** p 0,01. (B) Protein udtryk for NF-KB-signalering pathway herunder IKK-α, IKK-β IKB-α, p65 og p-p65 i cancerceller efter eksponering for nsPEF med forskellige intensiteter blev påvist ved Western-blot-assay. (C) Protein udtryk for Cyclin proteiner, herunder cyclin D1 og cyclin A i cancerceller efter udsættelse for nsPEF med forskellige intensiteter blev påvist ved Western-blot-assay. Relative intensitet af hvert protein blev analyseret ved Photoshop CS4-software. * P 0,05, ** p 0,01, *** p. 0,001

NF-KB-signalvejen spiller en vigtig rolle i celleproliferation [29]. Cancer vækstinhibering via inhibering NF-KB-vejen er for nylig blevet rapporteret i adskillige humane carcinomer, såsom colon [30], lunge [31] og bryst [32]. De målrettede gener, der regulerer celleproliferation via NF-KB-vejen indbefatter c-Myc, CyclinD1, cyclin E og CDK2 som spiller en væsentlig rolle i positiv eller negativ regulering af cellecyklus [33,34]. For yderligere at undersøge mulige mekanismer af proliferativ inaktivitet af pulserende celler, vi har registreret udtryk for NF-KB-signalvejen proteiner og cyclin proteiner i PANC-1 celler. Vores resultater viste, at udtryk for NF-KB pathway proteiner, herunder IKK-α, IKK-β, IkB-α, NF-KB p-65 og p-p65 var naturligvis faldt efter udsættelse for nsPEF versus kontrollen (alle p 0,01 eller 0,001) (figur 3B). Højere intensitet af nsPEF førte til meget lavere udtryk for disse proteiner sammenlignet med kontrollen. I mellemtiden udtryk for Cyclin proteiner, herunder CyclinD1 og cyclin A blev også signifikant reduceret efter eksponering for nsPEF versus kontrolgruppen (p 0,01, 0,001, eller 0,05) (figur 3C). Så vi mente, at nsPEF kunne trykke NF-KB signalvejen at reducere udtryk for Cyclin proteiner.

Disse data antydede, at nsPEF hæmmede celledeling gennem undertrykke NF-KB signalvejen at reducere udtryk for Cyclin proteiner og derved arrestere fase G1 af cellecyklus.

NsPEF inaktiverede celle migration og invasion via undertrykke Wnt /β-Catenin signalvejen

in vitro

Aktivering af metastaser og invasion er en vigtig kendetegnende for cancer [22,23]. Graden af ​​metastase og invasion er en standard til at klassificere fase af malign tumor, og også direkte bestemmer terapeutiske strategier for kræft og overlevelse af patienter [35]. , Så vi opdaget evne migration og invasion af kræftceller efter behandling. I vores undersøgelse, migration evne cancerceller skrive puls blev kraftigt skåret ned sammenlignet med kontrollen af ​​Trans-brønd assay (p 0,001) (figur 4A). Endvidere fandt vi, at cancerceller udsat for nsPEF besad en signifikant svag evne til at invadere sammenlignet med kontrollen ved hjælp matrigel invasion assay (p 0,001) (figur 4B). Disse resultater viste, at nsPEF kunne nedsætte celle metastase og invasion i kræft.

(A) Migration evne cancerceller udsat for nsPEF blev testet af trans-brønd assay. De migrerede celler udsat for nsPEF blev farvet lilla med 0,1% krystalviolet opløsning, observeret under lysmikroskop i 40 eller 400 forstørrelser, og talt for statistisk analyse. Original forstørrelse, 40 × 400 ×. *** P 0,001. (B) Invasion evne af cancerceller udsat for nsPEF blev påvist under anvendelse matrigel invasion assay. Efter nsPEF behandling, de celler, der besad invasion evne trængt gennem matrigel, blev farvet lilla med 0,1% krystalviolet opløsning og blev talt til statistisk analyse. Original forstørrelse, 40 × 400 ×. *** P 0,001. (C) Protein udtryk for Wnt /β-Catenin signalvejen herunder hDPR1, β-Catenin og c-myc i cancerceller efter eksponering for nsPEF med forskellige intensiteter blev påvist ved Western-blot-bestemmelse. (D) Protein udtryk for MMP’er familie og VEGF i cancerceller efter udsættelse for nsPEF med forskellige intensiteter blev påvist ved Western-blot-assay. Relative intensitet af hvert protein blev analyseret ved Photoshop CS4-software. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001

Akkumuleret beviser har vist, at Wnt /β-Catenin signalvejen spiller en kritisk rolle i fosterudviklingen og menneskelige forskellige maligniteter. [36]. Handlinger Wnt /β-Catenin signalvejen på målceller omfatter hovedsagelig ændringer i genekspression, celle polarisering, migration og invasion gennem regulering af distinkte downstream responsive molekyler [37]. Som nedstrømseffektor af Wnt /β-Catenin signalvej, MMP’er familie proteiner og VEGF spiller en kritisk rolle i tumorinvasion og metastase [38]. Således opdaget vi protein udtryk for Wnt /β-Catenin signalvejen, MMP familie og VEGF. Vi fandt, at udtryk for Wnt /β-Catenin signalvejen proteiner hovedsagelig herunder hDPR1, β-Catenin og c-myc i cancerceller udsat for nsPEF blev bemærkelsesværdigt reduceret med dosis-afhængighed i forhold til kontrollen (p 0,05 ved 20kV /cm, p 0,01 ved 40 kV /cm, s 0,001 på 60kV /cm) (figur 4C). Desuden resultater viste også, at udtryk for VEGF og MMP’er familie proteiner hovedsagelig herunder MMP1, MMP2, MMP9, MMP11, MMP12, MMP14 og MMP21 blev væsentligt reduceret ved forskellige grader med forskellige intensiteter af nsPEF versus kontrolgruppen (figur 4D). Så vi tænkte, at nsPEF kunne undertrykke Wnt /β-Catenin signalvejen at nedregulere gen udtryk for VEGF og MMP’er familiens proteiner.

Disse resultater kraftigt antydet, at nsPEF kunne inaktivere metastase og invasion evner af kræftceller ved at hæmme Wnt /β-Catenin signalvejen at nedregulere gen udtryk for VEGF og MMP’er familiens proteiner.

NsPEF fungerede sikkert og effektivt som en anti-tumor terapi

in vivo

på baggrund af

in vitro

eksperiment, kunne nsPEF fremkalde celle apoptose, hæmme celledeling, og inaktivere metastaser og invasion. For yderligere at identificere anti-tumor funktion af nsPEF udførte vi nsPEF eksperiment i ektopisk tumorbærende mus model. Den ektopisk tumor model er en pilotundersøgelse for mere dybdegående ortotopisk model, der i højere grad afspejler kliniske anvendelser.

Under hele dyreforsøg, 2 mus i nsPEF gruppen døde af over-doseret anæstesi og en i Kontrol døde af tvetydige årsager. Vi observerede overlevelse tilstand resten 47 tumor-bærende mus (16 i Control og 31 i nsPEF gruppe), og bemærkede, at nsPEF opretholdt mus normal fysisk aktivitet og havde ingen indflydelse på mus vægt (figur 5A), hvilket indikerer, at anti- tumor funktion nsPEF var sikkert for kroppen selv

in vivo

.