PLoS ONE: Pathway-Based Evaluering i Early Onset Kolorektal Cancer foreslår Focal Vedhæftning og Immunosuppression sammen med Epithelial-Mesenchymale Transition

Abstrakt

Kolorektal cancer (CRC) har en af ​​de højeste forekomster blandt alle kræftformer. Hovedparten af ​​CRC’er er sporadiske kræftformer, der forekommer hos personer uden familie historier af CRC eller nedarvede mutationer. Desværre, hel-genom udtryk studier af sporadiske CRC’er er begrænsede. En nylig undersøgelse anvendte microarray teknikker til at identificere en prædiktor gensæt indikerer modtagelighed for tidlig debut CRC. Imidlertid blev de molekylære mekanismer i forudsigeren gensæt ikke fuldt undersøgt i den tidligere undersøgelse. For at forstå de funktionelle roller prædiktor gensæt, i den foreliggende undersøgelse har vi anvendt en subpathway-baseret statistisk model til microarray data fra tidligere undersøgelse og identificerede mekanismer, der er rimeligt forbundet med prædiktor gensæt. Interessant betydelige subpathways tilhører 2 Kegg veje (fokal vedhæftning; naturlige dræberceller cellemedieret cytotoksicitet) blev fundet at være involveret i de tidlige debut CRC patienter. Vi viste også, at de 2 veje var funktionelt involveret i prædiktor genet indstilles med en tekst-mining teknik. Indtastning af et enkelt medlem af prædiktor gen sæt udløste et samlingspunkt vedhæftning vej, som giver anti-apoptose i de tidlige debut CRC patienter. Desuden intensiv inspektion af prædiktor gen sat i forhold til de 2 veje foreslog, at nogle firmaer i prædiktor gen sæt blev impliceret i immunosuppression sammen med epitelial-mesenkymale overgang (EMT) i de tidlige debut CRC patienter. Desuden har vi sammenlignet vores subpathway-baserede statistiske model med et gen set-baserede statistisk model, MIT Gene Set Enrichment Analysis (GSEA). Vores metode viste bedre ydeevne end GSEA i den forstand, at vores metode var mere i overensstemmelse med et velkendt cancer-relateret pathway sæt. Således biologiske forslag genereret af vores subpathway tilgang virker ganske fornuftig og berettiger en yderligere eksperimentel undersøgelse af tidlig debut CRC i form af dedifferentiering eller differentiering, hvilket understreges i EMT og immunosuppression

Henvisning:. Nam S, Park T (2012) Pathway-Based Evaluering i Early Onset Kolorektal Cancer foreslår Focal Vedhæftning og Immunosuppression sammen med Epithelial-Mesenchymale Transition. PLoS ONE 7 (4): e31685. doi: 10,1371 /journal.pone.0031685

Redaktør: Christina Chan, Michigan State University, USA

Modtaget: Juli 3, 2011; Accepteret: 13 januar 2012; Udgivet: April 9, 2012 |

Copyright: © 2012 Nam, Park. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Arbejdet af TP blev understøttet af en Grundforskningsfonden Korea tilskud finansieret af Sydkorea regering (MEST) (20080062618). Arbejdet i SN blev støttet af K-10-L05-C01-S13 fra Sydkorea Institut for Videnskab og Teknologi Information. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

familiær adenomatøs polypose (FAP) og HNPCC (HNPCC) er autosomal dominant sygdomme, der skyldes arvelige genetiske mutationer i adenomatøs polypose coli (APC) og fejlparringsreparationsgener [1]. Men disse sygdomme tegner, for kun 25% af det samlede antal kolorektal tilfælde i USA i 2010 [2]. De resterende 75% af alle kræfttilfælde kan efter sigende sporadiske kolorektal kræft (CRC’er) uden slægtshistorie [2] (www.cancer.gov), for hvilke mekanismen er stadig ikke klart, [3].

Hong et al. [3] identificeret 7 meget opreguleres gener (

Cyr61

,

EGR1

,

fosB

,

FOS

,

VIP

,

UCHL1

,

KRT24

) i tidlig debut sporadiske CRC patienter, der blev brugt som en prædiktor gen sæt vurderes med microarray teknik. For deres eksperimenter blev normalt udseende slimhinde støder op til tumor opnået fra CRC patienter og normal slimhinde blev opnået fra raske kontroller. De gav også en diskussion om signalveje (MAP-kinase (MAPK) signalering, NFAT-immun signalering, hypoxi signalering, insulin signalering, PI3K-AKT signalering, Wnt signalering, G-protein-koblet receptor (GPCR) signalering).

i den foreliggende undersøgelse, vi yderligere udforsket microarray datasæt for at tilføje en potentiel opstrøms regulator af nogle af de opregnede signalveje i tidlig debut CRC patienter vurderes i Hong et al. undersøgelse [3]. Konkret har vi udført avanceret statistisk analyse for at forbedre den molekylære forståelse af prædiktor genet sæt ved hjælp af tekst-mining og væsentlige subpathways relateret til de tidlige debut CRC sager.

Vores tilgang involverer offentlige tekst-mining [4] ved hjælp af en ny statistisk model, der håndterer regulering (f.eks hæmning, aktivering) blandt biologiske poster, og udfører en permutation test til subpathway identifikation af en given sti. Vi først identificeret statistisk signifikante subpathways relateret til de tidlige debut CRC’er fra Kegg veje [5] med modellen, og efterfølgende anvendes tekst-mining [4] for at bekræfte litteratur foreninger blandt prædiktor genet sæt og nogle repræsentative betydningsfulde subpathways.

Vores foreslåede model antyder, at tidlig debut CRC er involveret i delkomponenter omdrejningspunktet vedhæftning vej og naturlige dræberceller (NK) cellemedieret cytotoksicitet vej. NK cellemedieret cytotoksicitet pathway navnlig antyder tilstedeværelsen af ​​immunceller i de tidlige debut CRC patienter, hvilket indebærer parakrin kommunikation mellem immunceller (f.eks, NK-celler, T-celler, NK T-celler) og forskellige andre celler [6 ]. Desuden er vores resultat indikerer, at den tidligere rapporterede signalveje (Wnt, PI3K-AKT, MAPK) [3] er sandsynligvis kaskader gennem deres opstrøms fokal adhæsion kinase (FAK), [7], der hører til den fokale vedhæftning pathway. Derfor FAK [7] kan være et værdifuldt terapeutisk target kandidat til tidlig debut CRC prædiktor gen sæt diagnose. Desuden er vores tekst-mining analyse af de 2 veje sammen med prædiktor gen sæt underforstået, at nogle af elementerne i prædiktor gen sæt er involveret i celle overlevelse og epitelial-mesenkymale overgang (EMT) [8], [9], [10] gennem omdrejningspunktet vedhæftning vej og immunosuppression [8], [10], [11].

Resultater

Oversigt

det vigtigste begreb i vores statistiske model var at lokalisere statistisk betydelige subpathways hvis udtryk (f.eks microarray) aftalt med forordningen oplysninger (f.eks, aktivering, hæmning) (figur 1A) i Kegg pathway databasen. Vores tilgang er kort beskrevet her.

A. Regler for at matche en kant af to tilstødende enheder i Kegg veje med deres genekspression ændringer. Givet en kant, er gen 1 kaldes en kilde node hvilken kanten går ud, og gen 2 a sink knudepunkt af hvilken kanten kommer i. B. Skematisk diagram af den statistiske model. Givet en subpathway blev den længste segment (veldefineret subpathway) fra blad node identificeret. En statistik S for veldefinerede subpathway blev beregnet. Den null fordeling af S blev opnået via 1.000.000 prøve label permutationer og p-værdien for den observerede S blev endeligt opgjort (se

Materialer og metoder

for detaljer). Røde ovaler er opreguleret i kræftpatienter, og grønne ned-reguleret.

De ikke-metaboliske Kegg veje blev reduceret til lineære subpathways, som beskrevet i de

Materialer og metoder

(figur 2). I denne undersøgelse anvendes udtrykket “lineær subpathway” anvendes lig med “subpathway”. Vi derefter udvalgt veldefinerede subpathways hvor genekspressionen aftalt med forordningen oplysninger efter fastsatte regler (Figur 1A) som kandidater til at måle deres statistiske signifikans (se

Materialer og metoder

). En statistik

S

for hver veldefineret subpathway blev beregnet og dens betydning vurderes ved at beregne den empiriske

s

-værdi via prøve label permutationer (Figur 1B).

i alt 90 Kegg veje blev opdelt i mere end 130 millioner omfattende lineære subpathways der betragtes alle multiple gen opgaver. Blandt disse subpathways blev 4,644 veldefinerede subpathways identificeret og deres betydning vurderes via permutation tests. Efterfølgende blev foreningen tekst-mining analyse udført for de valgte betydelige veldefinerede subpathways; yderligere drøftelser om deres funktionelle roller gives herefter.

Væsentlige veldefinerede subpathways

Vi udførte flere sammenligning tests ved at kontrollere den falske opdagelse sats (FDR) [12]. Den FDR

q

-værdier blev beregnet ved hjælp af

s

-værdier ved at udføre 1 million permutation tests (Figur S1).

s

-værdi, der svarede til en FDR på 5% var 0,01386, hvilket gav 1.289 signifikante veldefinerede subpathways. Da vi har valgt ikke at give detaljerede biologiske fortolkning af alle disse væsentlige veldefinerede subpathways, vi fokuseret på undersøgelse af den top 30% af disse veldefinerede subpathways at give en mere detaljeret biologisk beskrivelse.

De fleste af de udvalgte subpathways vi diskuterer tilhører 6 Kegg veje (Figur S2): Focal vedhæftning (Kegg hsa04510), veje i kræft (Kegg hsa05200), NK cellemedieret cytotoksicitet (Kegg hsa04650), MAPK signalvej (Kegg hsa04010), Wnt signalvejen (Kegg hsa04310), og Neutrophin signalvejen (Kegg hsa04722). For den funktionelle diskussion og visualisering, vi kortlagt funktionelt interessante veldefinerede subpathways (tabel S1) i 6 Kegg veje ind Kegg pathway diagrammer (figur 3 og 4, Tal S3, S4, S5, og S6). Især fokuserede vi på 3 baner (Focal vedhæftning, NK cellemedieret cytotoksicitet, veje i kræft), som ikke var blevet udtrykkeligt nævnt i den tidligere Hong et al. undersøgelse [3]. Gen registreringer under veldefinerede subpathways, som den funktionelle diskussion og visualisering af de 3 veje er opsummeret i tabel 1.

Hvis fold-change af kræftpatient gruppe over den raske kontrolgruppe er større end én genet er rød, ellers grøn. Se tabel 1 og tabel S1 for detaljerede oplysninger.

Samme beskrivelse som figur 3.

Validering af den betydelige veldefinerede subpathways

Vi valideret posterne i tabel 1 ved hjælp af en uafhængig MedLine tekst-mining værktøjet [4], PubGene. Formålet med dette var at bekræfte, om litteraturen støttede direkte co-forekomster mellem udtrykket “kolorektal cancer”, og posterne i tabel 1. Vi fandt, at 79% af posterne i tabel 1 havde direkte interaktioner i PubGene analyse (Tabel S2 ). Konkluderede derfor vi, at vores modelresultater forudsat en fornuftig aftale med den undersøgte litteratur.

Veje i kræft (hsa05200)

Kegg vej hsa05200 (veje i kræft, figur S3) er selv- indlysende. Vækstfaktorsignalering, Wnt-signalering, og MAPK signalering, som er placeret i den venstre del af fig S3, blev aktiveret i prøverne fra CRC patienter. Signalerne er almindelige drivende kræfter under carcinogenese [8], [13]. Tilsyneladende normal slimhinde i CRC patienter har en iboende potentiale for yderligere transformation.

Focal vedhæftning vej (hsa04510)

Figur 3 viser omdrejningspunktet vedhæftning vej. Dette resultat viser, at den nederste del af omsætningsvejen er stærkt involveret med CRC patienter, og FAK (pTk2-, tabel 1) er ikke blot en vask node fra sine upstream receptorer, men også en kilde node mod sin nedstrøms signalering transduktioner (Wnt, PI3K -Akt /PKB og MAPK signaler) for overlevelse. PTEN (tabel 1) [14], en tumorsuppressor og antagonizer af PI3K-AKT /PKB signalvej, blev nedreguleret i fokal adhæsion pathway i analysen af ​​CRC patienternes prøver sammenlignet med de raske kontroller ‘prøver.

Hong et al. [3] foreslog, at Wnt signalvejen er involveret i CRC patienter. Vores resultat vedrørende omdrejningspunktet vedhæftning vejen (figur 3) støtter den opfattelse, at GSK-3β (GSK3b, tabel 1) reguleret af PI3K-AKT /PKB signalering af FAK nedstrøms blev nedreguleret i CRC patienter, og også, at β-catenin (CTNNB1 , tabel 1) blev højt udtrykt ved nedregulering af Wnt signalering inhibitoren GSK-3β i CRC patienter. Ved at kigge længere ind i oplysningerne i figur S5, vi bestemt, at genekspression af forskellige aktivatorer og inhibitorer relateret til Wnt signalering aktivering er i overensstemmelse med forordningen strømme. En anden vej, MAPK signalering (fig S4), som blev opreguleret i CRC patienter er også placeret nedstrøms for FAK (figur 3).

Da de 3 aktiverede signaler (Wnt, PI3K-AKT /PKB og MAPK signaler ) er placeret nedstrøms for FAK tilhører omdrejningspunktet vedhæftning vej, FAK [7], [15] kan være et terapeutisk mål for tidlig debut CRC prædiktor gen sæt diagnose. På grund de afgørende roller Wnt, PI3K-AKT /PKB og MAPK signalering kaste lys over EMT [9], der er blevet gradvist stigende betydning placeret på FAK.

Interessant, Cyr61, som var indeholdt i forudsigeren gensæt, er en ligand af ITGB5 (αVβ5 integrin, betegnet ITGB i figur 3), i henhold til Kegg Brite databasen [5]. Figur 3 viser, at Cyr61 er et af de langt opstrøms signaler, der udløser FAK, hvilket indebærer, at FAK efterfølgende aktiverer 3 signaler: Wnt, PI3K-AKT /PKB og MAPK signalering. For nylig blev Wnt, PI3K-AKT /PKB og MAPK signaler vist at være involveret i EMT [9], og tilsyneladende normal slimhinde i CRC patienter kunne undergå fænotypisk transformation ved disse 3 signaler via Cyr61-FAK-aksen. Med andre ord kan nogle celler i normalt udseende slimhinde i CRC patienter være tæt på atypiske celler ved anvendelse EMT. Vi vil beskrive beviserne for EMT i form af genekspression niveau og udforske enhver mulig sammenhæng mellem prædiktor gen sæt og EMT i

Diskussion

.

En anden finde relevant for nedstrøms region af fokal adhæsion vej er, at anti-apoptose-proteinet c-IAP (BIRC3, tabel 1) [16], som er en negativ regulator af caspaser (f.eks CASP3, CASP8, CASP9), blev også opreguleret i CRC patienter. Således har vi yderligere undersøgt de forskellige nedstrøms c-IAP (cellulær inhibitor af apoptose) i omdrejningspunktet vedhæftning vej, hvor c-IAP sammen med survivin (BIRC5) er også vigtige anti-apoptotiske proteiner. Af note, er det også blevet vist, at c-IAP og survivin inhiberer også downstream caspaser både ydre og indre apoptotiske veje [16]. Vi fandt, at størstedelen af ​​c-IAP blev opreguleret i CRC-patienter (tabel 2). Således kan omdrejningspunktet vedhæftning pathway giver hæmning af caspase aktivitet på tumorigenese af potentielle atypiske celler i tilsyneladende normal slimhinde.

NK cellemedieret cytotoksicitet vejen (hsa04650)

Vores statistisk analyse indikerede signifikant aftale mellem genekspressionen af ​​CRC patienter og en del af immun-vejen (hsa04650, figur 4), hvilket medfører tilstedeværelse af andre immunceller samt NK-celler i CRC patienternes prøver.

FAS i målcellerne af NK-celler og dets ligand (FASLG), som er produceret af NK-celler, blev højt udtrykt i CRC patienternes prøver. Høj FASLG udtryk i CRC patienter overholder tidligere kliniske observationer [6], [17], i hvor høj FASLG udtryk var korreleret med høj forekomst af metastaser og dårlig overlevelse i kolorektal carcinom patienter og i andre carcinoma patienter.

i det tilsyneladende normal slimhinde CRC patienterne kan forskellige target celler, herunder potentielt atypiske celler overlever fra FASLG-FAS død receptor signalering ved at undslippe enten ydre eller indre apoptotiske signalering. Faktisk blev de apoptotiske signaler inhiberet i CRC patienter, fordi den c-IAP [16], der inhiberede caspaser blev opreguleret i CRC patienterne med hensyn til genekspression (tabel 1 og 2). En anden mulighed er, at FASLG opregulering af target-celler, herunder potentielt atypiske celler, kunne indlede brodermord og selvmord blandt de immunceller med FAS gavnligt for transformation af potentielt atypiske celler.

Men eksistensen af ​​høj interferon-gamma ( IFN-γ) udtryk udskilles af NK-celler eller immunceller i CRC patienter forbliver kontroversielt, fordi NK-celle cytotoksicitet er traditionelt menes at styre immunosurveillance over kræften og atypiske celler. For nylig er en signifikant sammenhæng mellem anti-tumor immunitet og overlevelse af cancerceller blevet rapporteret [6], [18]. Desuden er IFN-γ vides at være involveret i immunosurveillance mod cancerceller, i multiple fænotypiske virkninger på somatiske celler (f.eks cellecyklusprogression, proliferation, celledifferentiering, transformation), og i cancerceller escape [11], [18] [19], [20]. Således, i

Diskussion

beskriver vi andre roller IFN-γ, især hvad angår den måde, kræftceller eller potentielt atypiske celler i CRC patienterne kunne justere det lokale immunsystem via immunosuppression for at flygte fra immunosurveillance .

Association blandt fokal vedhæftning, NK cellemedieret cytotoksicitet, og tidlig debut CRC prædiktor gen sat

Som nævnt i teksten ovenfor, Hong et al. [3] rapporterede, at tidlig debut modtagelighed blev tilskrevet den opreguleret gen sæt kaldet “prædiktor gen set” i CRC patienter, der består af

Cyr61

,

EGR1

,

fosB

,

FOS

,

VIP

,

UCHL1

, og

KRT24

. Vi inspicerede foreninger blandt de gener, der er anført i tabel 1 og prædiktor gen sæt med værktøjet tekst-mining, PubGene [4] (www.pubgene.org) (Figur S7). Inputtet i værktøjet bestod af forudsigeren gensæt, fokal adhæsion (FAK, ITGB5), og NK cellemedieret cytotoksicitet (INFG, FAS, FASLG). Figur 5 viser en forening netværk for input gener i CRC. Vi har allerede nævnt, at β-catenin (CTNNB1, Wnt vej i figur 5) blev reguleret af FAK i fokal vedhæftning. Forudsigeren gensæt, fokal adhæsion, og NK cellemedieret cytotoksicitet blev stærkt forbundet med hinanden i CRC.

De tre grønne kasser repræsenterer gensæt (Cyr61, FOS, fosB, UCHL1, VIP, EGR1, KRT24), NK-cellemedieret cytotoksicitet (IFNg, FAS, FASLG), og fokal adhæsion (pTk2-) fra venstre til højre. Valgmulighederne, der anvendes i netværket, er beskrevet i figur S7. De lyseblå fyldt kasser repræsenterer Mesh (www.nlm.nih.gov/mesh/~~number=plural) Sygdomme vilkår for generne. Det bemærkes, at ITGB5 foreninger ikke vises i PubGene resultat.

Sammenligning af vores metode med Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) i Hong et al. datasæt

Vi sammenlignede Kegg veje indeholder betydelige veldefinerede subpathways identificeret ved vores metode med disse Kegg veje opnået fra GSEA JAVA web start-program (standardindstillinger med 5.000 permutationer). I vores metode, signifikansniveauet (

s

-værdi) var 0,05 for cutoff af de veldefinerede subpathways. Det samme

s

-værdi på 0,05 blev anvendt til GSEA metoden. Vores metode rapporterede 1.966 signifikante veldefinerede subpathways der svarede til 78 Kegg veje. Den GSEA program rapporterede 2 brede typer af væsentlige pathway lister: 10 aktiverede veje og 30 undertrykte veje i CRC patienter. Antallet af overlappende overgange mellem de 2 metoder var 6, hvilket ikke er overraskende, når man overvejer forskellene mellem 2 metoder. Ikke desto mindre er det interessant, at de 2 metoder identificeret 6 almindelige cancer-associerede veje.

For at sammenligne de 78 veje identificeret ved vores metode med de 40 veje identificeret af GSEA, vi brugte de kræftrelaterede veje rapporteret af Vogelstein et al. [13] som en gold standard. Det vil sige, vi inspicerede hvilken metode forudsat flere veje i overensstemmelse med de kræftrelaterede veje identificeret af Vogelstein et al. De kræftrelaterede veje fra Vogelstein et al. Undersøgelsen blev manuelt kortlagt til deres tilsvarende Kegg veje fordi Kegg pathway id’er svarende til de kræftrelaterede veje ikke var udtrykkeligt nævnt i undersøgelsen. Vi derefter inspiceret de overlappende veje mellem Vogelstein kræftrelaterede Kegg veje og dem identificeret ved de 2 metoder. Som vist i tabel S3, vores metode forudsat mere konsistente resultater med kræftrelaterede veje identificeret i Vogelstein et al. end gjorde GSEA metoden. Yderligere oplysninger om denne del er beskrevet i tillægget S1.

Sammenligning mellem vejen underkonstruktion af Hong et al. datasæt og at den anden datasæt

For at bestemme, hvor tæt vejen underkonstruktion af Hong datasæt overlapper en ekstra kolorektal datasæt, søgte vi efter en ekstra kolorektal datasæt fra Gene Expression Omnibus (GEO). Selv om der er flere datasæt for CRC, synes ingen datasæt er til rådighed vedrørende en sammenligning af tidlig debut colorectale cancerpatienter med raske kontroller, som udføres i Hong et al. studere. Heldigvis fandt vi datasættet GSE4183 [21], som sammenligner forskellige kolorektale sygdomme (kolorektal cancer, kolorektal adenom, inflammatoriske tarmsygdomme) med normale kontroller i en mere generel indstilling (www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi? acc = GSE4183). Fra GSE4183 datasæt, vi opnåede normale, raske kontrolpersoner (

n

= 8) og kolorektale karcinomer (

n

= 15). Den GSE4183 datasæt blev analyseret med vores metode, som afslørede 3.669 veldefinerede subpathways (identificeret fra ~130 millioner subpathways) ved at bestemme deres betydning baseret på 100.000 prøve permutation tests. Desuden sammenligningen mellem GSE4183 datasæt og datasættet fra Hong et al. (GSE4107) viste, at 250 veldefinerede subpathways overlappede mellem de 2 datasæt. For at bestemme, hvor godt disse 2 resultater faldt sammen med hinanden, udførte vi også Fishers eksakte test baseret på randomisering model.

s

-værdien fra den hypergeometriske fordeling var mindre end 2.2E-16, hvilket indebærer, at de 2 resultater faldt sammen godt med hinanden. Vi konkluderer derfor, at vores konklusion er relevant for Hong s vej underkonstruktion er godt understøttet af vores fund fra den anden uafhængige datasæt. Yderligere oplysninger om denne del er beskrevet i tillægget S1

Diskussion

Vores roman analyse foreslår følgende resultater:. 1) De delmængder fra fokal vedhæftning, veje i kræft og NK cellemedieret cytotoksicitet er stærkt involveret i tidlig debut sporadiske CRC patienter; og 2) Overraskende tekst-mining analyse foreslog, at den molekylære funktion af prædiktor gensæt for tidlig debut sporadisk CRCs er forbundet med fokal adhæsion og NK cellemedieret cytotoksicitet. I teksten nedenfor, diskuterer vi de potentielle molekylære mekanismer i denne sammenhæng i form af immunosuppression og EMT.

Immunosuppression

Den seneste litteratur [6], [11], [18], [ ,,,0],19], [22], [23], [24] har oprettet en begrebsramme, hvor interaktioner mellem tumor og immunitet menes at hjælpe en række kræftceller flygte fra immun-raiding ved at gennemgå de følgende 3 faser i en lineær eller blandet måde: elimination (immunosurveillance), ligevægt (tumor vækstdvale), og flygte (immunosuppression). Især cancercelle undslippe ved immunsuppression [6], [8], [11], [19], [25], [26] er blevet grundigt undersøgt, og 2 typer immunsuppressive celler menes at negativt regulere anti-tumor immunrespons: regulatoriske T-celler (T

Reg) og myeloide afledte suppressorceller (MDSCs) [8], [11], [27], [28]. Vi diskuterer nedenfor roller IFN-γ, andre cytokiner, og indikator genet sæt i form af disse 2 typer af immunosuppressive celler i tidlig debut CRC patienter.

Det er påvist tidligere, at IFN-γ kan fremkalde aktivering og udvidelse af MDSCs i tyktarmskræft [28], og at aktiverede MDSCs ikke kun hæmme effektor T-celle-aktivitet /spredning, men også fremkalde immunosuppressive CD4

+ CD25

+ Foxp3

+ T

Reg celler fra CD4

+ CD25

– T-celler [6], [11], [28]. T

Reg celler, som også udtrykker CTLA-4, PD-1, og PD-L1 på deres celleoverflader, positivt regulerer immunosuppressive cytokiner interleukin (IL) -10 og tumor vækstfaktor-beta (TGF-β), som kan også inducere T

Reg differentiering [6], [11], [29]. Da T

er Reg celler findes i tumorinfiltrerende lymfocytter (TIL’er) i forskellige cancertyper [6], [11], [29], den tilsyneladende normal slimhinde i CRC patienter kan have tils stede med immunsuppressiv aktivitet. ARG1 er også en vigtig metabolisk enzym til MDSCs negativt regulere lymfocytfunktioner ved at indtage eller udskille aminosyren arginin, der er afgørende for T-celle funktion. Således har vi inspiceret genekspressionsniveauer af de undersøgte gener (CD4, CD25, Foxp3, TGF-p, IFN-y, IL-10, CTLA-4, PD-1, PD-L1, ARG1) i CRC patienter og bekræftede de var alle opreguleret i de kræftpatienter (tabel 3).

at give genekspression-niveau bevis for tilstedeværelsen af ​​MDSCs i CRC patienter, vi inspicerede (direkte eller indirekte) flere MDSC overflademarkører : CD11c (ITGAX), CD11b (ITGAM), CD33, CD34, og CD15 [6]. Notatet undersøgte vi FUT4 og FUT9 stedet for CD15 fordi CD15 er ikke et protein, men et antigen syntetiseret af FUT4 og FUT9 [30]. Vi fandt, at alle de markører, bortset FUT4 blev opreguleret i cancerpatienter (tabel 3).

Det er tidligere blevet vist, at cancerceller, der udtrykker PD-L1 på deres overflade udskiller immunosuppressive cytokiner galectin-1, IL- 6, IL-10, og TGF-β, hvilket kan hæmme cytotoksiske CD8

+ T-celler [11]. Endvidere kan de kræftceller, der producerer højere niveauer af indolamin 2,3-dioxygenase (IDO) forhindre invasion af NK-celler og effektor T-celler ved at nedbryde tryptophan afgørende for T-cellefunktion [6], [11]. I den foreliggende undersøgelse, bekræftede vi et højere ekspressionsniveau af de undersøgte gener (for PD-L1, galectin-1, IL-6, IL-10, IDO, og TGF-β) i cancerpatienter (tabel 3).

genekspressionsanalyse vist i tabel 3 viser, at immunosuppressive aktivitet er stærkt observeret i tilsyneladende normal slimhinde. Dette fund kunne give yderligere oplysninger om en “feltet forandring” [31], som henviser til spredning og anti-apoptotisk aktivitet i tilsyneladende normal slimhinde støder op til tumor. Med andre ord kunne anti-apoptose af feltet forandring også drage fordel af immunosuppression ved at undslippe den immun-raid.

For at se yderligere til funktionel forfinelse af prædiktor gen sat i form af immunosuppression, vi fodres prædiktor genet sat i PubGene [4] med MeSH (www.nlm.nih.gov/mesh) udtrykket “immunosuppression” (deskriptor ID: D007165). Resultatet (data ikke vist) opnået på tidspunktet for manuskriptet forberedelse viste, at 4 gener (

EGR1

,

FOS

,

UCHL1

, og

VIP

) har en forening med immunosuppression ifølge litteraturen. Baseret på en gennemgang af Ganea et al., Som blev foreslået af PubGene, VIP (en velkendt immunregulerende neuropeptid) hæmmer udskillelsen af ​​proinflammatoriske cytokiner og inducerer T

Reg celler [32]. Andre nyere undersøgelser støtter også immunosuppressive roller VIP [33], [34], fordi VIP lindrer kollagen-induceret arthritis og sarkoidose ved at inducere CD4

+ CD25

+ Foxp3

+ T

Reg celler fra CD4

+ CD25

– T-celler. VIP er også involveret i immune privilegier i øjet ved at inhibere T-lymfocyt-aktivering og proliferation [35]. Således kan høj VIP ekspression i CRC patienter lokalisere et andet stort immunregulerende cytokin i vores analyse.

EMT

Vi også inspiceret ekspressionsniveauet af EMT-beslægtede gener [9], [36], herunder matrix proteaser, invasion molekyler, epitelial /mesenkymale markører og E-cadherin repressorer. Vi fandt, at størstedelen af ​​dem blev opreguleret i cancerpatienter (tabel 4). Derfor EMT [9] proces kan finde sted i cancerpatienter, i det mindste hvad angår genekspression. Dette fund er uventet i, at atypiske eller forstadier celler kunne eksistere selv i normalt udseende slimhinde ved cellemorfologi ændringer (f.eks, EMT).

For at udforske de potentielle roller prædiktor gen sæt, vi input den prædiktor genet sat i PubGene [4] med MeSH udtrykket “Epithelial-Mesenchymale Transition” (deskriptor ID: D058750). På tidspunktet for manuskriptet forberedelse, 3 gener (

EGR1

,

FOS

,

Cyr61

) ud af prædiktor genet sæt blev fundet i litteraturen at have en forening med EMT.

i særdeleshed, vi opmærksom på genet

Cyr61

fordi Cyr61 er en ligand, der kan udløse et knudepunkt vedhæftning vej. Monnier et al. [37] viste, at Cyr61-αVβ5 integrin-induceret metastaser var involveret i tumor sengen effekt efter strålebehandling på at udnytte HCT116 CRC cellederivater i hypoxiske betingelser. Yderligere nylige undersøgelser af cyr61-drevet udvikling af cellemotilitet i pancreas duktal adenokarcinom og i gastriske epitelceller [38], [39] viser, at Cyr61 er et af de vigtigste molekyler til EMT, der kunne bibringe metastatisk evne og cellemotilitet til en primær tumor . Således kan Cyr61 være en af ​​de drivende molekyler til forøgelse EMT-relaterede pathways (Wnt og PI3K /AKT signaler) [9], [40] i tidlig debut CRC patienter via cyr61-FAK akse (figur 3).

Et andet interessant fund vi gjort ved at undersøge forholdet mellem EMT og prædiktor gen sæt var VIP, som for nylig blev rapporteret at inducere EMT med stimulering af matrix proteaser matrixmetalloproteinase (MMP) -2 og MMP-9 i prostata tumorigenese [41]. Vi fandt, at genekspression af disse 2 proteaser blev faktisk opreguleret i cancerpatienter (tabel 4).

Cytokiner almindeligvis involveret i både EMT og immunosuppression

Fordi vi fundet VIP er et cytokin, der indgår i både EMT og immunosuppression, vores fund indebærer parakrin signalering mellem immunceller og forskellige målceller er involveret i begge processer. Vi fandt også en ekstra cytokin involveret i de 2 processer, idet immunsuppressiv TGF-β (TGFB1; Tabel S5) [22], [29], [36], [42] er en velkendt EMT inducer [9], [43]. Fandt Faktisk vi, at flertallet af TGF-P’er og deres receptorer blev opreguleret i CRC patienter.

Konklusion

Vores genekspression dataanalyse tyder på, at mindst 2 indgange (

VIP

,

Cyr61

) i prædiktor gen sæt funktionelt involveret i fænotypisk EMT induktion af fokal vedhæftning nedstrøms (Wnt, PI3K /AKT, MAPK) og immunosuppression (figur 6).