PLoS ONE: normale fibroblaster Fremkald E-Cadherin Tab og øge lymfeknudemetastase i Gastric Cancer

abstrakt

Baggrund

En tumor betragtes som en heterogen kompleks i et tredimensionelt miljø, der flugter med patofysiologiske og biomekaniske signaler. Cell-stroma interaktioner styre udviklingen og generering af tumorer. Her vurderer vi bidragene fra normale fibroblaster til mavekræft.

Metodologi /vigtigste resultater

Ved at co-dyrkning normale fibroblaster i monolag af BGC-823 gastriske cancerceller, tumorceller sporadisk udviklet kort, spindel -lignende morfologiske egenskaber og vist bedre spredning og invasive potentiale. Endvidere er de transformerede tumorceller påvist nedsat tumordannelse og øget lymphomatic og intestinal metastatisk potentiale. Ikke-transformerede BGC-823 celler, i modsætning hertil demonstrerede primær tumordannelse og forsinket tarm og lymfeknude invasion. Vi observerede også E-cadherin tab og opregulering af vimentin ekspression i de transformerede tumorceller, som antydet, at stigningen i metastase blev induceret ved epitel-til-mesenchymal overgang.

Konklusion

Kollektivt , vores data viste, at normale fibroblaster tilstrækkeligt fremkalde epitel-til-mesenkymale overgang i kræftceller, hvilket fører til metastase

Henvisning:. Xu W, Hu X, Chen Z, Zheng X, Zhang C, Wang G, et al. (2014) normale fibroblaster Fremkald E-Cadherin Tab og øge lymfeknudemetastase i Gastric Cancer. PLoS ONE 9 (5): e97306. doi: 10,1371 /journal.pone.0097306

Redaktør: Elad Katz, AMS Biotechnology, England

Modtaget: December 10, 2013; Accepteret: 16. april, 2014 Udgivet: May 20, 2014

Copyright: © 2014 Xu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne forskning blev støttet af tilskud fra National Health Key Special Fund (https://program.most.gov.cn, No.200802112), National Science Fund Komité (https://www.nsfc.gov.cn; generel projekt nr .81372302 No.81272120), Health Department Fund (https://program.most.gov.cn, No.2007A093), Key Project i Zhejiang-provinsen (https://www.zjkjt.gov.cn; No. 2013C030445 2009C030125). The Natural Science Fund i Zhejiang-provinsen (https://www.zjnsf.gov.cn, No.Y2080001, Y12H160121, og Z2080514) og medicin Bureau Fund Traditional Chinese (https://wst.zj.gov.cn; No.2007ZA019). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Metastaser er ansvarlig for op til 90% af cancerassocieret dødelighed. Mange patienter, der demonstrerer ingen tegn på metastaser i den indledende diagnose vil med tiden udvikle metastaser. Selvom metastaser forårsager de fleste kræftdødsfald, denne proces er fortsat et af de mest gådefulde aspekter af sygdommen.

Metastatisk tumorceller ind væv via ekstravasation. Vævet imidlertid undergår uklare processer ved hvilket cellerne indlejret i vævet matrix og kommer i direkte kontakt med stromale celler, hvoraf de fleste er normale fibroblaster. Tumor celler har alle chancer for at komme i kontakt med stromale celler, herunder neoplastiske og metastatiske celler [1]. Dette fører til gensidig krydstale med normale fibroblaster i vævet. Salg

Fibroblaster er de mest udbredte stromaceller, og de stimulerer mikromiljøet og tjene som en rig kilde for parakrin reaktionsvej under tumorgenese og progression. Virkningerne af normale fibroblaster på tumorceller bestrides. Det er blevet rapporteret, at normale fibroblaster undertrykke malign omdannelse af immortaliserede prostata epitel [2], mens det i brysttumorer, fibroblasterne omdanne duktalt carcinom i invasive carcinom [3].

Denne uenighed indikerer, at indflydelsen af ​​fibroblaster på tumorceller er anderledes end for CAF (kræft tilknyttede fibroblaster). Til denne undersøgelse har vi dyrket sammen tumorceller med normale fibroblaster i petriskåle for at efterligne hvordan tumorceller kontakt fibroblaster. Vi fokuserede på bidrag normale fibroblaster til mavekræft. Dyrkede vi de normale fibroblaster til dannelse tætte monolag, som derefter blev formidlet med tumorceller for at efterligne metastatiske tumorceller. Vi antager, at det høje forhold af fibroblaster til tumorceller kan efterligne væv, hvor metastaseret tumorceller bor. Således blev dermale fibroblaster fra raske individer anvendes til fremstilling af det cellulære miljø. Den gastrisk cancer cellelinje, BGC-823, blev brugt her, fordi det er morfologisk forskellig fra fibroblaster.

Materialer og metoder

Etisk Statement

Primære humane dermale væv blev opnået fra børn, der gennemgik omskæring efter at have indhentet skriftligt informeret samtykke fra deres pedeller, som var inkluderet i deres journaler. Dette eksperiment blev gennemgået og godkendt af den institutionelle gennemgang bestyrelse Second Affiliated Sygehus af Zhejiang University School of Medicine (etisk vurdering kode: Forskning 2013-047). Patienterne i denne undersøgelse blev forsynet med en kopi af skriftligt informeret samtykke og gav tilladelse til at offentliggøre.

Alle forsøg blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne for Pleje og anvendelse af forsøgsdyr af Rådet for Videnskab og Teknologi Kina. Undersøgelsen protokol Den blev godkendt af Animal Care og brug Udvalg for Zhejiang University.

Reagenser og antistoffer

Penicillin G /streptomycin, phosphatpufret saltvand (PBS), Triton X-100, bovine serumalbumin, collagenase type I, og trypsin blev indkøbt fra Jinuo (Kina). Høj-glucose DMEM blev opnået fra Gibco (Kina), og føtalt bovint serum (FBS) blev indkøbt fra Gibco (SA). Cisplatin, 5-fluoruracil, puromycin, og collagen type I blev købt fra Sigma (USA). Cisplatin blev opløst i dimethylformamid (DMF), 5-fluoruracil i DMSO, og puromycin i PBS for at gøre stamopløsninger, som derefter blev opbevaret ved -20 ° C. Collagen type I (5 mg /ml) blev fortyndet til 1 mg /ml. DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindol · HCI) i PBS blev opnået fra Roche, og ged anti-mus og kanin IgG, sekundært antistof-TIRTC, og sekundære antistoffer blev opnået fra ZSGB-Bio (Kina). Antihumant-E-cadherin kanin (ab40772), antihuman-vimentin kanin (ab92547), og antihuman-β-catenin kanin-antistoffer (ab9274) blev opnået fra Abcam (UK). Antihumant-pan-CK museantistof (C11) og N-cadherin kaninantistof (C4061) blev opnået fra Cell Signaling Technology (Kina), og anti human-β-actin og sekundært gede-anti-kanin-antistoffer blev opnået fra Boster (Kina) . Antistoffer blev fortyndet med 5% FBS til at arbejde koncentrationer, medmindre andet er nævnt.

Cell Culture

Den etablerede cellelinie, menneskelig gastrisk kræft BGC-823 celler, der anvendes i vores eksperiment blev købt fra cellen bank Guangzhou Institute biomedicin og sundhed. Cellerne blev optøet og passeret i 4-5 gange og derefter blev anvendt i co-kultur eksperimenter. Primære hudfibroblaster blev indhentet fra de kirurgiske eksemplarer af børn, der havde gennemgået omskæring og forudsat informeret samtykke. Fibroblaster blev anvendt efter den tredje passage (inden for 50 passager), dyrket i høj-glucose DMEM indeholdende 10% FBS, og holdt i en befugtet inkubator (5% CO

2) ved 37 ° C. Cellemediet blev erstattet hver anden dag.

I genereringen af ​​TBGCs, fibroblasterne (FBS) og BGC-823-celler blev dyrket sammen i et forhold på 10:01 i yderligere 10 dage efter de dyrkede celler nået sammenløb. Dome-dannelse blev observeret i co-dyrkningssystemet. Celleblandingen blev derefter passeret ved trypsinisering med friske fibroblaster (1 × 10

6 celler /ml). Under det andet og efterfølgende passager, tilsyneladende doom dannelse og de suspenderede runde-formede celler optrådte, som udviste forskellige morfologiske træk og langvarig tilknytning efter passage. Efter den femte passage af de blandede suspenderede celler og tætte normale fibroblaster, uniform, korte, spindel-lignende celler betegnes “TBGCs” blev produceret og viste ikke morfologiske tilbagevenden til BGC-823 celler, indtil . 10-15 passager

proliferationsassav

Eksponentielt voksende celler blev podet i 96-brønds plader i yderligere 6 dages inkubation ved 37 ° C i en fugtig 5% CO

2 atmosfære. Celleproliferation blev målt i fem eksemplarer hver dag ved pipettering 20 pi CellTiter 96 Aqueous One Solution-reagens (Promega, USA) i hver brønd, der indeholdt 100 pi høj glucose DMEM, derefter blev cellerne inkuberet i yderligere 2 timer før bestemmelse af den relative absorbans ved 490 nm ved anvendelse af en mikrotiterpladelæser.

Drug inhiberingsassay

Fem overlapninger eksponentielt voksende celler blev podet i en 96-brønds plader og inkuberet i 24 timer. Efter 24 timer blev mediet erstattet med forskellige koncentrationer af lægemidler (0-80 um) og dyrket i yderligere 24 timer. Lægemiddeltoksicitet blev evalueret ved at måle antallet af levedygtige celler ved hjælp af proliferation assay beskrevet ovenfor.

ridser Assay

Celler podedes på plader med 24 brønde (5 x 10

4 celler /brønd) og dyrket til konfluens. Pipettespidser blev anvendt til frembringelse ridser. PBS blev anvendt til at fjerne cellerester, derefter erstattet med FBS-frit medium. Billeder blev opnået i 3 på hinanden følgende dage. Bredden af ​​bunden blev målt ved anvendelse ImageJ 1,47 software til Windows (https://rsb.info.nih.gov/ij/) og afbildet som den scratch distance per dag.

Migration og Invasion Assay

Cellemotilitet analysering blev udført under anvendelse Transwell skær (8 um porestørrelse) (Corning, USA). Celler-GFP (grønt fluorescerende protein) (1 × 10

5/500 pi) blev suspenderet i FBS-frit medium og placeret over indsatserne i tre eksemplarer, med 800 pi dyrkningsmedium indlæst nedenunder. Efter inkubation natten over blev inserterne vasket 3 × med PBS og tørres med en fugtet vatpind ovenfor, hvor fikseret med 4% PFA nedenfor og observeret ved anvendelse af et fluorescerende mikroskop (Olympus, Japan). Den samme fremgangsmåde blev anvendt til at udføre invasionen assay men skær, der blev belagt med Matrigel (BD, USA) blev anvendt. Begge assays blev kvantificeret som antallet af celler tælles i 5 tilfældige felter (200 ganges forstørrelse).

Apoptose Assay

apoptotiske celler blev målt under anvendelse af Annexin V-FITC apoptosis afsløring kit (Keygen, Kina) ifølge producentens instruktioner. Celler var enten ubehandlede eller behandles med lægemidler i 24 timer, og derefter høstet, vasket to gange med PBS, resuspenderet i bindingsbuffer indeholdende 5 pi FITC-Annexin V og 5 pi PE, og inkuberet ved stuetemperatur i 30 minutter. Analyse blev udført ved anvendelse af flowcytometri (FACSCalibur, Becton Dickinson, USA).

kvantitativ real-time PCR

Nukleare ekstrakter blev fremstillet under anvendelse af RNeasy mini-kit ifølge producentens instruktioner. Oprenset RNA-prøver (1 ug) i DEPC vand blev revers-transkriberet under anvendelse af PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Takara, Kina). RT-PCR og amplifikation blev udført under anvendelse af SYBR Premix Ex Taq II kit (Takara).

En 20 pi reaktion indeholdende 1 pi fortyndet cDNA prøver, 10 pi SYBR Premix Ex Taq II (2 x), 0,4 pi ROX referencenummer Dye (50 ×), 7 pi sterilt dobbelt destilleret H

2O, og 1 pi frem og reverse primere (se materialer og metoder S1) blev fremstillet og vurderet ved anvendelse smeltekurveanalyse og den komparative tærskelcyklus (Ct) metode. Følgende cykliseringsbetingelser blev anvendt: 95 ° C i 10 minutter, efterfulgt af 40 cykler ved 95 ° C i 15 sekunder og 58 ° C i 1 minut. GAPDH blev anvendt som kontrol-genet.

Western blot-analyse

Proteiner blev ekstraheret fra eksponentielt voksende celler og primære væv. Ekstrakterne blev kogt i påsætningsbuffer, resolveret på 10% Tris-HCI SDS-polyacrylamidgeler og overført til nitrocellulosemembraner (Millipore, USA) under anvendelse af standardmetoder. Membranerne blev blokeret ved anvendelse af 5% fedtfri mælk i Tris-bufret saltvand med Tween-20 (TBST) i 30 minutter ved stuetemperatur. Membraner blev vasket med TBST og inkuberet natten over ved 4 ° C med primære antistoffer mod E-cadherin (1:5000), vimentin (1:5000), β-catenin (1:5000), N-cadherin (1:1000), og β-actin (1:1000). Efter vask 3 × med TBST blev sekundært gede-anti-kanin (1:1000) tilsat og inkuberet i 2 timer ved stuetemperatur. Endelig blev immunkomplekser visualiseret ved kemiluminescens under anvendelse af ECL (Electro Chemical Luminescence) (Millipore). Proteinkoncentrationen blev normaliseret til p-actin.

Histologisk og Immunohistokemiske Analyser

Prøver blev hurtigt nedfrosset i flydende nitrogen, lagret ved -80 ° C, faste i 4% PFA, og sektioneret til en tykkelse på 10 um (LEICA, Tyskland).

i hematoxylin og eosin (HE) -farvning blev afparaffinerede objektglas farvet med hæmatoxylin i 15 minutter, vasket 3 x med PBS, syre alkohol i 5 sekunder, og derefter eosin i 5 minutter (Boster, Kina).

i immunhistokemisk farvning blev objektglassene rehydreret og varme epitopgenfinding blev udført i citratpuffer ved anvendelse af en trykkoger (20 minutter ved 80 PKA), blokeret med 3 % H

2O

2 i 15 minutter, og derefter normalt gedeserum blev anvendt (30 minutter ved stuetemperatur). Slides blev inkuberet i de følgende primære antistoffer: anti-E-cadherin (1:250), anti-vimentin (1:250), anti-β-catenin (1:250), og anti-pan-CK (1:250 ). Prøver blev inkuberet natten over ved 4 ° C, skyllet to gange med PBS og inkuberet med det sekundære antistof i 2 timer ved 37 ° C. DAB Plus Chromogen kit (Boster) blev anvendt til at detektere alle antigener. Objektglassene blev modfarvet med hematoxylin, dehydreret, og monteret med dækglas under anvendelse neutral balata. Begge analyser blev separat udført af patologer og klinikere, der var blind for de prøvegrupperne. Tvister blev løst ved konsensus.

Immunofluorescens og konfokalmikroskopi

Celler blev udsået på kammer dias, og de frosne sektioner blev fikseret med 4% PFA og permeabiliseret med 0,5% Triton X-100. Objektglas blev blokeret med normalt gedeserum i 1 time ved 37 ° C, skyllet og inkuberet natten over med primære antistoffer ved 4 ° C, derefter overført og inkuberet med gede-anti-mus og anti-kanin-TIRTC antistoffer i 1 time ved 37 ° C i mørket. Objektglas blev vasket under anvendelse af glycerol og monteret med dækglas. Kerner blev modfarvet med DAPI. Fluorescens blev detekteret ved anvendelse af et konfokalt laser-scanning-mikroskop (Olympus). De afparaffinerede kryosnit blev farvet med DAPI og analyseret ved hjælp af en immunfluorescent mikroskop.

Animal Model

Firs fire uger gamle BALB /c mus blev indkøbt fra Animal Research Center i Shanghai og vedligeholdes på det eksperimentelle dyr midt på Zhejiang Academy of Medical Science. Ifølge retningslinjerne for Pleje og anvendelse af forsøgsdyr af Rådet for Videnskab og Teknologi i Kina blev alle dyr, der holdes under aseptiske sterile forhold og administreres autoklaveret mad og vand i overensstemmelse med principperne for Laboratory Animal Care of Zhejiang University. Fireogfyrretyve mus blev anvendt i det subkutane model, og blev fordelt ligeligt i kontrol- og eksperimentgrupper. De BGC-GFP’er blev brugt som kontrol, hvor TBGC-GFP’er var anvendelser som eksperimentet. Tumorcellerne blev høstet under vækstfasen og suspenderet i FBS-frit medium (1 x 10

6 celler /ml). Celler blev pipetteret til encellede suspensioner, og hver 500 pi opløsning blev subkutant inokuleret på begge sider af brystet. Mus blev aflivet hver 2. uge indtil 10 uger, og patologiske undersøgelser blev udført. Alle mus blev vejet hver 3 dage. Alle operationer blev udført under 1% natrium pentobarbital, og blev gjort alle bestræbelser på at minimere lidelse.

Tredive-seks mus blev anvendt i vene injektion gruppe for vurderingen af ​​kræft distribution (18 mus i BGC-GFP kontrolgruppe og 18 mus i TBGC-GFP eksperiment gruppe). 500 pi cellesuspension (5 x 10

5 celler) blev injiceret i halevenen hos nøgne mus. Mus blev aflivet ved 2

nd, 5

th, 8

th og 10

th uger for patologisk undersøgelse.

Statistisk analyse

Eksperimentelle data blev indsamlet og trådte i regneark. Normalitet tests blev udført før sammenligning af data. Sammenligninger mellem grupper blev udført ved hjælp af Students

t

test. Envejs variansanalyse blev anvendt til at sammenligne 3 grupper, og Tukeys metode blev anvendt til

post hoc Salg sammenligninger af grupper. I denne undersøgelse,

s

0,05 betragtes statistisk signifikant. SPSS 20,0 til Windows (IBM SPSS Statistics, https://www-01.ibm.com/support/docview.wss?uid=swg24029274) blev anvendt til at udføre alle statistiske analyser. R (ggplot2) (https://www.r-project.org/; https://www.r-project.org/) blev anvendt til at generere alle grafiske præsentationer

Resultater

1. Morfologiske ændringer i BGC-823 Cells mimick stromacellers

fibroblaster (FBS) og BGC-823-celler blev dyrket sammen i et forhold på 10:01 i yderligere 10 dage efter de dyrkede cellerne nåede konfluens. Celleblandingen blev derefter passeret ved trypsinisering med friske fibroblaster (1 × 10

6 celler /ml) (figur 1.1). Dome-dannelse i BGC-823-celler blev observeret efter den første passage. Under den anden og efterfølgende passager, suspenderede rund-formede celler dukkede op i dyrkede systemet: nogle samlet i klynger eller klumper og blev løst forbundet til overfladen af ​​fibroblaster. De parallelle-dyrkede BGC-823 celler viste kun få runde-formede celler i bunden, når kulturen blev overfyldte. De blandede suspenderede celler udviste forskellige morfologiske træk og langvarig tilknytning efter passage. Disse celler viste enten en brosten udseende ligner BGC-823 celler eller korte spindel-lignende funktioner. Ensartet blev korte, spindel-lignende celler fremstillet ved passage af de blandede suspenderede celler og tætte normale fibroblaster. I modsætning hertil passage af supernatanten af ​​BGC-823-celler kun påvist rester efter 24 timers dyrkning, hvor små mængder af celler overlevede til dannelse brosten-lignende kloner svarende til parentale BGC-823 celler (figur 1.3A-H).

Figur 1.1. Skematisk af forsøgsprotokollen. Figur 1.2. Oprindelse af supernatanten celler. (A) GFP-mærkede BGC-823-celler (grøn). (B) BGC-823 celler, der blev dyrket sammen med fibroblaster (rød). (C) BGC-823 celler voksede i klumper og demonstreret runde former i suspension. (D) TBGCs blev induceret ved co-dyrkning. Forstørrelse 100 ×. Figur 1.3. Transformation fra BGC-823 celler til TBGCs under et fasekontrastmikroskop. (A-D) BGC-823 celler i en tæt dyrkningssystem kan danne klynger og kaste ud celler i suspensionen. (E-H) Passage af suspenderede tumorceller. Figur 1.4. Immunfluorescensfarvning af pan-CK (rød), E-cadherin (rød), vimentin (rød) og N-cadherin (rød). BGC-823 celler (ovenfor) og TBGCs (nedenfor) blev mærket med GFP (grønt). Kernen blev farvet med DAPI (blå). Figur 1.5. Heat plot af genekspressionsprofiler analyseret under anvendelse af fluorescens kvantitativ RT-PCR. Dybden af ​​farve angiver relativ genekspression. Figur 1.6. Western blots af proteiner. Figur 1.7. Bar plot af proteinekspression bestemt ved anvendelse af Western blot-analyse. Bars angiver de relative ekspressionsniveauer målt under anvendelse IOD. Lodrette linjer angiver standard forskelle. ** P. 0,01

Der blev udført Efterfølgende eksperimenter for at fastslå kilden til de suspenderede celler i dyrket sammen system. BGC-823-celler og fibroblaster blev transficeret med GFP-puro kassette og RFP-puro kassette henholdsvis og navngivet BGC-GFP og FB-RFP hhv. Efter co-dyrkning, BGC-GFP voksede i multilag og dannede en kuppel-lignende struktur. I mellemtiden blev de runde-formet eller sfæroide celler, som blev suspenderet i medierne overført til dyrkningsplader og mærket med grøn fluorescens, hvilket viser, at langvarig co-dyrkning med fibroblaster inducerer BGC transformation. Runde og sfæroide celler, som blev suspenderet i mediet blev også observeret ved anvendelse af grøn fluorescens og kunne passeres uden tilsætning af fibroblaster (figur 1.2A-D). Efter flere på hinanden følgende runder af co-dyrkning, forvandlet BGC-823 celler (TBGCs) blev opnået, der dukkede mere ensartet, korte, og spindel-lignende. Disse celler blev derefter passeret uden tilsætning af fibroblaster. Interessant, disse celler var mere tilbøjelige til at danne kugleformede strukturer end de celler, der voksede til konfluens og viste ikke morfologiske tilbagevenden til BGC-823 celler indtil . 10-15 passager

En tidligere undersøgelse rapporterede, at fibroblaster hæmmer væksten af ​​andre celler, når samdyrket

in vitro

efter den mekanisme af kontaktinhibering [4]. I vores eksperimenter, dog normale fibroblaster ikke kontakte-hæmmer udbredelsen af ​​BGC-823 celler. I stedet FB-RFP’er gradvist omkom med BGC-GFP spredning, når dyrkningen blev udvidet til 10 dage. Derfor blev i træk FB tilskud kræves for at passage og opretholde stabil produktion af TBGCs. Vi observerede også, at når en lille mængde TBGCs blev tilsat til konfluente fibroblast ark blev tumorceller, som voksede uden skubbet væk af fibroblasterne. I centrum af tumoren koloni blev cellerne rund, med blot løse vedhæftede filer til basen (figur 1.3A-H).

2. Epiteliale-mesenchymale Overgang fra BGC-823 Cell at TBGC

Real-time PCR blev anvendt til at analysere mRNA-ekspression. Resultaterne viser, at E-cadherin ekspression bemærkelsesværdigt blev nedreguleret sammen med opregulering af vimentin i TBGCs. I mellemtiden udtrykkene for twist, snegl, slug, og N-cadherin blev alle opreguleret (Figur 1.5). Immunofluorescens-farvning og Western blot bekræfter E-cadherin tab og den øgede ekspression af vimentin, N-cadherin, og β-catenin (Figur 1.4), hvilket bekræfter, at langvarig epithelial-mesenchymal overgang (EMT) forekommer i TBGCs. E-cadherin er en gennemprøvet kendetegnende for EMT og vedligeholder celle-celle vedhæftning i epitel. E-cadherin tab kan føre til tumoren kaste flere celler ud fra tumormassen.

3. Proliferation blev Invasion, og mobilitet TBGCs

TBGC spredning analyseres ved hjælp af MTS-analysen. TBGCs demonstrerede en fremskyndet spredning sats (

s

0,01) (Figur 2.1). Flowcytometri (se materialer og metoder S1) viser, at 13% af TBGCs blev tilbageholdt i S-fasen, i modsætning til kun 7% af BGC-823 celler (figur S1.3). Det skrabe analysen indikerer, at TBGC motilitet steg i forhold til fædrene BGC-823 celler (Figur 2.2-2.3A-H). TBGC anastomose krævede 3 dage efter indledningen af ​​ridser, mens 4 dage var nødvendige for BGC-823 celler (

s

0,05). (Figur 2.2)

Figur 2.1. line plot af proliferation assay. Lodrette linjer angiver standard forskelle. ** P 0,01. Figur 2.2. Line plot af skrabe assay. Lodrette linjer angiver standard forskelle. ** P 0,01. Figur 2.3. Skrabe assay af BGC-823 celler (ovenfor) og TBGCs (nedenfor) under en fase-kontrast mikroskop. (A-D, E-H) Tid fra første til 72 timer. Figur 2.4. Box plot af de invasive og migration assays. Forskelle mellem BGC-823 celler og TGBCs er signifikant (p 0,01). Figur 2.5. De øverste 2 billeder viser resultaterne af den invasive modificerede transwell assay med Matrigel. Repræsentative billeder af Transwell invasion assays for (A) BGC og (B) TBGC. Celler invaderer undersiden af ​​Transwell insert er vist. De nederste 2 billeder er repræsentative billeder af transwell migration analyser for (C) BGC og (D) TBGC. Celler migrerer til undersiden af ​​Transwell insert er vist.

Resultaterne af Matrigel invasion assays viser, at TBGCs er mere aggressive end BGC-823 celler. I alt 683.67 ± 170,83 TBGCs infiltreret Matrigel i forhold til 188.33 ± 58,62 BGC-823 celler i kontrolgruppen (

s

0,01) (Figur 2.4, figur 2.5A, B). Imidlertid TBGCs påvist en signifikant reduktion i migrerede celler: 2 gange mindre end BGC-823 celler ifølge Transwell migration assay (

s Restaurant 0,01) (Figur 2.4, figur 2.5C, D). Den suspenderede karakter af TBGCs kunne redegøre for denne reduktion, vedhæftningen lå kun 68,33 ± 10,41% i TBGCs på Matrigel mens 99,77% ± 6,25% i BGC-823 celler, viste langsom binding til Matrigel overflade i TBGCs (tabel S1) .

for bedre efterligner

in vivo

tumor adfærd blev collagen type i-gel bruges til at fastslå forholdet mellem fibroblaster og de invasive kapacitet BGC-823 celler og TBGCs. Collagen type I gel blev fremstillet på Transwell skær med fibroblaster (se Materialer og metoder S1). Fibroblast-loaded geler blev dyrket i 7 dage, og derefter GFP-mærkede cancerceller blev podet på gelen og dyrket i de næste 7 dage. Inspektion af de høstede geler afslørede, at tumorcellerne var trængt ind i kollagengeler. Når gelerne blev fyldt med fibroblaster, TBGCs udviste mere forstærket invasiv kapacitet end BGC-823-celler, som angivet ved antallet af celler, der infiltrerede gelerne (figur S1.2).

4. TBGCs Udstillet Cisplatin Resistance

Dernæst vurderede vi følsomhed TBGCs til standard mavekræft kemoterapeutika. blev bestemt levedygtige BGC-823 celler og TBGCs efter 24 timers udsættelse for cisplatin (0, 20, 40, 60, 80 pM) ved at måle inkorporeringen af ​​MTS. Resultaterne viser, at TBGCs udstillet bemærkelsesværdige modstand mod cisplatin, hvorimod få BGC-823 celler overlevede når koncentrationen cisplatin blev ophøjet til 40 pM (

s

0,001) (Figur 3.1). kunne endda detekteres levedygtige TBGCs når koncentrationen cisplatin var forhøjet op til 200 uM (data ikke vist). Vi udførte celle-apoptose-analyse ved anvendelse af flowcytometri at validere cisplatin modstand. Resultaterne viser, at overlevelsesraten for TBGCs var omkring 42.40% sammenlignet med 13,80% for BGC-823-celler efter behandling med 40 pM cisplatin i 24 timer (figur 3,3-3,4). Men når de behandles med 5-FU, var der ingen signifikante forskelle i tumor hæmning mellem TBGCs og BGC-823 celler i henhold til MTS analysen (Figur 3.2). Begge tumorceller demonstrerede kemoresistens til 5-FU (figur 3.2).

Figur 3.1. Fireogtyve timers line plot af cisplatin-hæmning test. ** P 0,01. Figur 3.2. Fireogtyve-timers linje plot af 5-FU inhibitionstest. Figur 3.3. Flowcytometri blev anvendt til at vurdere apoptose i BGC og TBGC celler efter eksponering for forskellige koncentrationer af cisplatin (20, 40 uM) i 24 timer. Celler blev farvet med Annexin V-FITC (markør af apoptose) og propidiumiodid (PI) (markør af døde celler). Figur 3.4. Bar plot af cisplatin-induceret apoptose i BGC-823 celler og TBGCs. Søjlediagram, som viser procentdelen af ​​apoptotiske celler ifølge flowcytometri. ** P. 0,01 vs celler i dimethylsulfoxid (DMSO) kontrolbrønde

5. TBGCs Exhibit

In vivo

lymfeknuder Tilbøjelighed

For at bestemme den

in vivo

distribution af TBGCs, 5 × 10

5 BGC-823 celler eller TBGCs blev injiceret i halevenen på BALB /c-mus. To uger efter injektion, varians i hjælpemotor og cervikal lymfeknuder metastase blev observeret i begge grupper, som angivet ved vurdering af et fluorescerende sporstof (figur 4.3A-F). GFP-positive celler blev fundet i den ekstra og inguinale lymfeknuder i begge grupper (fig 4.3a, B, D, E). Imidlertid GFP-positive celler syntes kun i lungerne hos musene i BGC gruppe (figur 4.3C, F).

Figur 4.1. Kumulativ risiko for lymfeknuder metastaser i forskellige grupper, der fik hale vene injektioner. Figur 4.2. HE farvning (ved 10 uger) af organer i gruppen, der modtog vene injektioner. Positivitet blev observeret i tarmene af begge grupper, og i lungerne hos BGC grupper. Ingen indlysende lever eller nyre metastaser blev fundet. Figur 4.3. Fluorescerende sporing af tumorceller ved uge 2 i de grupper, der fik haleveneinjektioner. Tumorceller blev mærket med grøn fluorescens som angivet ved de gule pilespidser. Kernen blev farvet med DAPI (blå). Forstørrelse 100 ×. Figur 4.4. Immunohistokemisk farvning for E-cadherin og β-catenin i lymfeknuderne i de grupper, der fik haleveneinjektioner på hvert tidspunkt. Forstørrelse 200 ×. Figur 4.5. Bar plot af de relative ekspressionsniveauer af E-cadherin og β-catenin i lymfeknuderne i de grupper, der fik haleveneinjektioner på hvert tidspunkt. ** P 0,01; * P. 0,05

I uge 5, i tillæg til omfattende invasion ind i lymfeknuder, orgel infiltration blev også observeret. Mere lymfeknude invasion blev observeret i TBGC gruppen end i BGC kontrolgruppen ved hvert tidspunkt (Figur 4.1, Video S1). Disse lymfeknuder blev bestemt til at være pan-CK positive (figur S2.1). Vi observerede også forskellige TBGC og BGC fordeling i organerne. TBGCs var begrænset til de gastroenteriske væv, mens BGCs bosatte i lungerne og tarme (Figur 4.2A-H). I uge 5 blev tarm metastaser først observeret i 3/4 mus, som blev injiceret med TBGCs, mens kun 25% mus viste synlige tarm metastaser efter BGC injektion (figur S2.3).

Som tumorer udviklede, det gennemsnitlige antal af intestinale TBGC metastaser steget (5,6 ± 3,911

vs

3,5 ± 1,914 BGCs i uge 8, 6,33 ± 1,52

vs

5,6 ± 1,342 i uge 10) (figur S4.2) . Interessant, 3 af 5 mus i TBGC gruppe demonstrerede megascopic neoplasmer i Gastrum efter 10 uger, som ikke blev observeret i BGC gruppen. Megascopic lungemetastaser blev fundet i 3 ud af 4 BGC mus ved uge 8. Imidlertid blev der ikke observeret synlige TBGC lungemetastaser i uge 10 (figur 4.2A-H). Mikroskopisk undersøgelse afslørede infiltration af TBGCs i livmoderhalskræft og aksillær lymfeknuder så tidligt som en uge efter haleveneinjektion, mens BGCs krævede mere tid (3 uger) for at indtaste disse lymfeknuder (Figur 4.1). Fem uger efter celle injektion blev lungeinfiltration observeret i BGC gruppen. Men der blev ikke konstateret TBGCs i organer indtil 10 uger efter injektion (figur 4.2b, F, figur S2.3).

immunhistokemisk farvning indikerede gradvis forøgelse af E-cadherin i lymfeknuderne i TBGC gruppen , mens E-cadherinekspression faldet lidt i BGC gruppen (

s

0,01) (Figur 4.4A-P). Forskelle var signifikante ved 8 og 10 uger, når E-cadherinekspression var meget højere i TBGC gruppen sammenlignet med BGC gruppe (figur 4.5). Udtrykket af β-catenin også steget med tiden i TBGC gruppen, der toppede på 8 uger, og derefter faldt en smule (Figur 4.5).