Abstrakt
Død signalering fra tumornekrosefaktor (TNF) relateret apoptose-inducerende ligand (TRAIL) kan inducere død i cancerceller med ringe cytotoksicitet for normale celler; denne celledød har været tænkt at involvere caspase-afhængig apoptose. Reaktive oxygenarter (ROS) er også mediatorer, der inducerer celledød, men deres roller i TRAIL-induceret apoptose ikke er blevet belyst fuldstændigt. I den aktuelle undersøgelse undersøgte vi ROS og caspaser i humane bugspytkirtelkræftceller undergår to forskellige typer TRAIL-induceret celledød, apoptose og necroptosis. TRAIL behandling øgede ROS i to TRAIL-følsomme bugspytkirtelkræft cellelinjer, MiaPaCa-2 og BxPC-3, men ROS var involveret i TRAIL-induceret apoptose kun i MiaPaCa-2 celler. Uventet inhibering af ROS ved enten
N
acetyl-L-cystein (NAC), et peroxid inhibitor eller TEMPOL, en superoxid-inhibitor, forøget annexin V- /propidiumiodid (PI)
+ tidlig nekrotisk befolkning i TRAIL-behandlede celler. Derudover både necrostatin-1, en inhibitor af receptor-interagerende protein kinase 1 (RIP1), og siRNA-medieret knockdown af RIP3 faldt annexin V
– /PI
+ tidlig nekrotisk befolkning efter TRAIL behandling. Endvidere blev en stigning i begyndelsen apoptose induceret i TRAIL-behandlede cancerceller under inhibering af enten caspase-2 eller -9. Caspase-2 arbejdede opstrøms for caspase-9, og blev ikke observeret nogen krydstale mellem ROS og caspase-2 /-9 i TRAIL-behandlede celler. Tilsammen indikerer disse resultater, at ROS bidrage til TRAIL-induceret apoptose i MiaPaCa-2-celler, og at ROS spiller en hæmmende rolle i TRAIL-induceret necroptosis af MiaPaCa-2 og BxPC-3-celler, med caspase-2 og -9 spille regulerende roller i denne proces
Henvisning:. Zhang M, Harashima N, Moritani T, Huang W, Harada M (2015) roller ROS og Caspaser i TRAIL-induceret apoptose og Necroptosis i human bugspytkirtelkræftceller. PLoS ONE 10 (5): e0127386. doi: 10,1371 /journal.pone.0127386
Academic Redaktør: Ajay Pratap Singh, University of South Alabama Mitchell Cancer Institute, UNITED STATES
Modtaget: Januar 23, 2015; Accepteret: April 15, 2015; Udgivet: May 22, 2015
Copyright: © 2015 Zhang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres
Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer
Finansiering:.. Denne undersøgelse blev støttet delvist af tilskud fra Ministeriet for uddannelse, videnskab, sport, kultur og teknologi of Japan (nr 25.430.150 til NH, og nr. 24501331 til MH) og fra Shimane University “SUIGANN” Projekt. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser
Introduktion
medlemmer af tumornekrosefaktor (TNF) cytokin familie, såsom TNFa og Fas-ligand (FasL), spiller en vigtig rolle i inflammation og immunitet [1]. Skønt TNF-relateret apoptoseinducerende ligand (TRAIL) er et medlem af denne familie, kan dette molekyle inducere celledød, men samtidig gør næsten ingen cytotoksicitet for normale celler [2]. Der er positive og negative receptorer; dødsreceptor (DR) 4 og DR5 leverer pro-apoptotisk signalering, mens decoy receptor (DCR) 1 og DcR2 inhiberer apoptotiske signalering [3]. Normale celler er rapporteret at vise TRAIL-modstand med deres fortrinsret udtryk for DCR’er [4]. Derfor TRAIL og dens DR forventes at være nyttige anti-cancer molekyler og mål og er blevet brugt og målrettet i flere kliniske undersøgelser [5, 6]. Binding af TRAIL til DR på cancerceller præsenterer caspase-8-afhængig dødssignalering og udløser “extrinsic” apoptosecyklus [7]. Aktivering af caspase-8 forvandler Bud til tBid og dermed fremme mitokondrier-medierede caspase-9-afhængige “intrinsic” apoptosecyklus [8]. Alternativt ROS (reaktive oxygenarter) spiller også en vigtig rolle i celledød og signaler [9]. ROS inducerer iboende apoptose ved at udløse DNA-beskadigelse [10]. Omvendt DNA skader inducerer ROS produktion [11]. DNA-beskadigelse og /eller ROS-produktion kan udløse caspase-9-afhængig apoptose. Derudover nogle rapporter foreslog, at ROS er involveret i apoptose i TRAIL-behandlede humane cancerceller [12-14]. Imidlertid roller ROS i TRAIL-induceret celledød er endnu ikke undersøgt til fulde.
Udover apoptose, er necroptosis nu anerkendt som en anden form for programmeret celledød [15, 16]. Necroptosis er programmeret nekrose der kan aktiveres ved stimulering af TNF, FasL eller TRAIL. Rollerne og mekanismer apoptose og nekrose er blevet veletableret, mens de necroptosis har været i fokus i de seneste undersøgelser [16-18]. Necroptosis har fået megen opmærksomhed som en type af celledød, der inducerer inflammation [17]. Under caspase-8-inhibering, receptor-interagerende protein kinase 1 (RIP1) og RIP3 danner et kompleks og trigger necroptosis [19, 20]; yderligere nylige rapporter har vist, at RIP3 spiller en central rolle i processen [18, 21]. Selv om nogle rapporter tyder på, at TRAIL kan fremkalde necroptosis i cancerceller [22-24], har de mekanismer ikke blevet belyst fuldt ud.
Dette studie undersøgte roller ROS og caspaser i TRAIL-induceret apoptose og necroptosis af menneskelig bugspytkirtelkræftceller. Blandt fire humane bugspytkirtelkræft cellelinier blev ROS-niveauer forhøjet i kun to TRAIL-følsomme linjer: MiaPaCa-2 og BxPC-3. Imidlertid ROS spillede en pro-apoptotisk rolle kun i MiaPaCa-2-celler, men ikke i BxPC-3-celler. I disse forsøg fandt vi, at TRAIL behandling under ROS inhibering øget populationen af annexin V
– /propidiumiodid (PI)
+ tidlige nekrotiske celler i MiaPaCa-2 og BxPC-3-celler, hvilket antyder, at ROS spillede en inhiberende rolle i TRAIL-induceret necroptosis i begge cellelinier. Desuden necrostatin-1 (a RIP1 inhibitor) nedsætter annexin V
– /PI
+ -populationen i disse TRAIL-behandlede celler, og siRNA-medieret knockdown af RIP3 viste lignende resultater i BxPC-3-celler, hvilket indebærer at celledød observeret var forårsaget af necroptosis. Endelig necroptosis blev fremmet af TRAIL behandling under hæmning af enten caspase-9 eller -2, med sidstnævnte betragtes som en “orphan” caspase hvis rolle i celledød er ikke blevet belyst fuldt ud [25, 26]. Tilsammen indikerer disse resultater, at ROS forøges i TRAIL-følsomme MiaPaCa-2 og BxPC-3-celler, men at ROS er involveret i apoptose kun TRAIL-behandlede MiaPaCa-2-celler. Vores resultater viste også, at ROS og caspase-9 /-2 play regulatoriske roller i TRAIL-induceret necroptosis af humane bugspytkirtelkræftceller.
Materialer og metoder
Cellelinjer
To humane bugspytkirtelkræft cellelinier (aSPC-1 og BxPC-3) blev købt fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). To andre menneskelige bugspytkirtelkræft cellelinier (MiaPaCa-2 og Panc-1) blev venligst stillet til rådighed af Dr. K. Takenaga (Shimane University Faculty of Medicine) [27]. Disse cellelinier blev opretholdt i DMEM (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) suppleret med 10% føtalt kalveserum (Invitrogen, Grand Island, NY, USA) og 20 ug /ml gentamicin (Sigma-Aldrich). Prec er en normal prostata epitelcellelinie købt hos Lonza (Walkersville, MD, USA) og blev opretholdt i PrEBM (Lonza).
Cellelevedygtighed assay
Cellelevedygtighed blev analyseret under anvendelse af WST- 8 assay (Nacalai Tesque, Kyoto, Japan). Ved slutningen af inkubationsperioden blev 10 pi WST-8-opløsning tilsat til hver brønd, og pladerne blev inkuberet i yderligere 3 timer. Absorbans i hver brønd blev målt ved 560 nm under anvendelse af en mikropladelæser (Beckman Coulter, Brea, CA, USA).
Reagenser
I inhiberingsassays, følgende inhibitorer blev tilsat 1 time før tilsætning af TRAIL: pan-caspaseinhibitor Z-VAD-FMK (Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, USA), caspase-8-hæmmer Z-IETD-FMK (R . Thermo Scientific, Rockford, IL , USA) indeholdende en protease-inhibitor cocktail (Nacalai Tesque). Lige store mængder protein blev opløst på 4-12% gradient eller 12% SDS-PAGE geler og overført til polyvinylidenfluorid membraner. Membranerne blev blokeret, og blottene inkuberet med de følgende primære antistoffer: anti-RIP3 (13.526; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), anti-caspase-3 (9668; Cell Signaling Technology), anti-caspase-8 ( M032-3, Medicinsk og Biological Laboratories, Nagoya, Japan), anti-caspase-9 (9508; Cell Signaling Technology), anti-caspase-2 (2224; Cell Signaling Technology), anti-β-actin (BioLegend, San Diego , CA, USA), eller anti-α-tubulin (Santa Cruz Biotechnology). Efter vask blev stuetemperatur inkubation af membraner i 30 minutter med enten gede-anti-kanin eller gede-anti-muse alkalisk phosphatase-konjugeret sekundære antistoffer (Invitrogen) anvendes til påvisning af primære antistoffer. Protein bands blev visualiseret ved hjælp af CDP-star chemiluminescens og filmede med en ImageQuant LAS-4000-system (FujiFilm, Tokyo, Japan).
Transfektion af små interfererende RNA (siRNA)
Transfektion af siRNA blev udført under anvendelse af Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner. RIP3 siRNA (sc-61482) blev købt fra Santa Cruz Biotechnology. Styringen siRNA (6568) blev købt fra Cell Signaling Technology. Tre dage efter siRNA transfektion blev cellerne anvendt til efterfølgende eksperimenter.
Statistiske analyser
Data blev evalueret statistisk under anvendelse uparret to-halet Students
t
-tests. En
P
værdi på mindre end 0,05 blev anset for at indikere statistisk signifikans.
Resultater
Produktion af ROS i TRAIL-følsomme bugspytkirtelkræftceller
Vi først undersøgt følsomheden af fire humane kræft i bugspytkirtlen cellelinjer og en normal prostata epitelial cellelinje Prec til TRAIL behandling. Vi valgte disse kræft cellelinjer, fordi de er blevet godt karakteriseret for deres mutationer i
K-ras
og
p53
[28], og fordi vi tidligere har undersøgt deres TRAIL følsomhed [29]. Som følge heraf levedygtighed både MiaPaCa-2 og BxPC-3-celler faldt i nærvær af TRAIL på en dosis-afhængig måde, mens de andre tre linjer (Panc-1, aspC-1, og Prec) viste ingen klar følsomhed mod TRAIL (fig 1A). Vi undersøgte dernæst ekspressionen fra TRAIL-receptorer på disse celler (Fig 1B). Ekspressionen af DR4 var næsten upåviselig i alle cellelinjer. Selv DR5 udtryk på Panc-1 og Prec var lav, alle cellelinjer var positive for DR5. Med hensyn til lokkefugle receptorer, MiaPaCa-2 og Prec celler var delvist positive for DcR2. Vi næste afgøres, om ROS blev produceret i disse cellelinjer og fandt, at TRAIL behandling signifikant forøget ROS-niveauer kun i MiaPaCa-2 og BxPC-3 celler (
P
0,05 for MiaPaCa-2,
P
0,01 for BxPC-3) (fig 1C og 1D). Prec celler reducerede niveauet af ROS efter TRAIL behandling. Disse resultater viste, at ROS produceres kun i TRAIL-følsomme bugspytkirtelkræft cellelinier (MiaPaCa-2 og BxPC-3).
(A) Fire humane pancreas cancer linjer og Prec celler blev dyrket i nærvær af TRAIL . Efter 48 timer blev cellelevedygtighed bestemt ved WST-8 assay. De viste data repræsenterer middelværdien af tre brønde. (B) Ekspression af DR4, DR5, DcR1, og DcR2 i fem cellelinier blev undersøgt ved flowcytometri. Den linje repræsenterer farvning med mAb specifik for enten DR4 eller DR5, efterfulgt af et FITC-konjugeret sekundært antistof. Solid grå betegner farvning med FITC-konjugeret anti-muse-IgG alene. Med hensyn til ekspression af DcR1 og DcR2, linien betegner farvning med mAb specifik for DcR1 og DcR2; solid grå betegner farvning med isotype-matchet FITC-konjugeret anti-muse-IgG. (C) Fem cellelinier blev dyrket med TRAIL (50 ng /ml). Efter 6 timer for MiaPaCa-2 og 12 timer for de øvrige fire linier, disse celler blev dyrket med carboxy-H
2DCFDA (50 uM) i 30 minutter og undersøgt for deres ROS-niveauer ved flowcytometri. Tallet repræsenterer den gennemsnitlige fluorescensintensitet. (D) De viste data repræsenterer middelværdien af tre brønde. MFI: betyder fluorescensintensitet. *
P
0,05, **
P
. kun 0,01, NS, ikke signifikant
Hæmning af ROS faldt TRAIL-induceret apoptose i MiaPaCa -2 celler
Vi næste undersøgt virkningerne af to ROS inhibitorer, NAC og TEMPOL [30], på TRAIL-induceret apoptose fra TRAIL-følsomme MiaPaCa-2 og BxPC-3-celler. TRAIL steget markant de procentsatser for annexin V
+ celler blandt begge cellelinier (
P
0,01). Tilføjelsen af NAC, et peroxid-hæmmer, faldt betydeligt procentdelen af annexin V
+ TRAIL-behandlet MiaPaCa-2-celler (
P
0,05), men undlod at mindske apoptose i TRAIL-behandlet BxPC- 3-celler (fig 2A og 2B). Alternativt tilsætning af TEMPOL, en superoxid-inhibitor, havde ingen virkning på TRAIL-induceret apoptose af MiaPaCa-2-celler, men steg det i TRAIL-behandlede BxPC-3-celler (
P
0,01) (Fig 2C og 2D). Disse resultater viser, at ROS, peroxid og superoxid, udøver modsatte virkninger på de to TRAIL-følsomme cellelinier; peroxid spiller en pro-apoptotisk rolle i TRAIL-behandlede MiaPaCa-2-celler, men superoxid er anti-apoptotisk i TRAIL-behandlede BxPC-3-celler.
(A) MiaPaCa-2 og BxPC-3-celler blev dyrket med TRAIL (50 ng /ml) med eller uden NAC (10 mM) i 24 timer. Efter farvning med annexin V-FITC /PI, flowcytometrisk analyse blev udført. Tallene repræsenterer andelene af hver delmængde. (B) De procentdele af annexin V
+ celler er vist. (C) Begge cellelinier blev dyrket med TRAIL (50 ng /ml) med eller uden TEMPOL (1 mM) i 24 timer og analyseret ved flowcytometri. (D) Procentdelen af annexin V
+ celler er vist. Alle datapunkter er vist repræsenterer middelværdien af tre dyrkningsbrønde. *
P
0,05, **
P
0,01, NS, ikke signifikant
RIP1- og RIP3-afhængige necroptosis i TRAIL-behandles. bugspytkirtelkræftceller under ROS hæmning
under undersøgelse af virkningerne af ROS hæmning på TRAIL-induceret apoptose af MiaPaCa-2 og BxPC-3 celler, fandt vi, at de procentsatser af annexin V
– /PI
+ tidlige nekrotiske celler blev forøget med TRAIL behandling under ROS hæmning (fig 2A og 2C). Resultaterne af annexin V
– /PI
+ tidlige nekrotiske celler beregnes og præsenteres i fig 3A. Tilføjelsen af NAC øgede procentdele af annexin V
betydeligt – /PI
+ TRAIL-behandlede celler (
P
0,01 for MiaPaCa-2,
P
0,05 for BxPC-3). Et lignende resultat blev observeret, når TEMPOL blev tilsat i TRAIL-behandlede BxPC-3-celler (
P
0,01 for BxPC-3), men ikke i MiaPaCa-2-celler. Da annexin V
– /PI
+ -celler repræsenterer tidlige nekrotiske celler, antyder disse resultater, at TRAIL induceret programmeret nekrose (necroptosis) under ROS inhibering, især peroxid inhibering. Vi næste spurgt, om tilsætningen af necrostatin-1, en inhibitor af RIP1 og nekrose [31], kunne sænke disse tidlige nekrotiske celler. Som vist i fig 3B og 3C, kombinationen af TRAIL og NAC væsentligt forøget andelene af annexin V
– /PI
+ MiaPaCa-2 og BxPC-3-celler (
P
0,01 for MiaPaCa-2 og BxPC-3), hvorimod tilsætning af necrostatin-1 faldt betydeligt dem (
P
0,01 for MiaPaCa-2,
P
0,05 for BxPC-3 )
(A) Procentdelen af annexin V
-. /PI
+ celler blev beregnet på grundlag af resultaterne af figur 2. (B) Begge cellelinjer blev dyrket med TRAIL (50 ng /ml) og NAC (10 mM) med eller uden necrostatin-1 (20 uM) i 24 timer. Efter farvning med annexin V-FITC /PI, flowcytometrisk analyse blev udført. Tallene repræsenterer andelene af hver delmængde. (C) De procentdele af annexin V
– /PI
+ celler blev beregnet. Alle datapunkter er vist repræsenterer middelværdien af tre dyrkningsbrønde. *
P
0,05, **
P
. 0,01
RIP1 og RIP3 er kritiske molekyler til necroptosis [18-21]. Derfor undersøgte vi ekspressionen af RIP1 og RIP3 i fire bugspytkirtelkræft cellelinjer og fandt, at alle var positive for RIP1, mens MiaPaCa-2 og Panc-1 var negative for RIP3 (Fig 4A). Vi undersøgte yderligere effekten af siRNA-medieret knockdown af RIP3 om necroptosis induceret af co-inkubation med TRAIL og NAC. Transfektion af RIP3 siRNA nedsatte RIP3 proteinekspression i BxPC-3-celler, men viste ingen effekt på ekspressionen af RIP1 (Fig 4B). Knockdown af RIP3 lidt, men betydeligt, faldt cellen levedygtighed som respons på TRAIL (
P
0,05 ved 25 ng /ml,
P
0,01 ved 50 ng /ml) ( fig 4C). Som vist i fig 4D og 4E, selektiv knockdown af RIP3 faldt betydeligt andelene af annexin V
– /PI
+ -celler efter TRAIL behandling af BxPC-3-celler dyrket med enten NAC eller TEMPOL (
P
0,01 for NAC,
P
0,05 for TEMPOL). Interessant, hæmning af peroxid ved NAC signifikant øget andelen af annexin V
+ apoptotiske celler i RIP3 siRNA-transficerede og TRAIL-behandlet BxPC-3 celler (
P
0,01). Disse resultater antydede, at RIP1 afhængige necroptosis fremmes i TRAIL-behandlet MiaPaCa-2 og BxPC-3 celler under hæmning af peroxid, og at TRAIL behandling under hæmning af ROS (peroxid og superoxid) fremmer RIP3-afhængig necroptosis i BxPC-3 celler .
(A) udtrykket af RIP3 og RIP1 protein blev undersøgt i fire kræftceller. p-actin blev anvendt som kontrol. (B) MiaPaCa-2 og BxPC-3-celler blev transficeret med kontrol siRNA eller RIP3 siRNA. Tre dage efter transfektion blev cellerne høstet og undersøgt for RIP3 og RIP1 proteinekspression. (C) BxPC-3-celler transficeret med enten kontrol siRNA eller RIP3 siRNA 3 dage før blev dyrket med TRAIL. Efter 48 timer blev cellelevedygtighed bestemt ved WST-8 assay. (D) BxPC-3-celler transficeret med enten kontrol siRNA eller RIP3 siRNA 3 dage før blev dyrket med TRAIL og med enten NAC (10 mM) eller TEMPOL (1 mM) i 24 timer. Efter farvning med annexin V-FITC /PI, flowcytometrisk analyse blev udført. Tallene repræsenterer andelene af hver delmængde. (E) De procentdele af annexin V
– /PI
+ celler og annexin V
+ celler blev beregnet. Alle datapunkter er vist repræsenterer middelværdien af tre dyrkningsbrønde. *
P
0,05, **
P
. 0,01
roller caspaser i TRAIL-induceret apoptose og necroptosis
Vi næste undersøgte roller caspaser i apoptose og necroptosis i TRAIL-behandlede MiaPaCa-2 og BxPC-3 celler. TRAIL behandling aktiveret caspase-3, -8 og -9 i begge cellelinier (figur 5A). Da rollen af caspase-2 i celledød ikke er godtgjort fuldt [25, 32], monitorerede vi dette caspase og fandt, at TRAIL behandling også aktiveret caspase-2. Vi yderligere undersøgt virkningerne af et panel af caspaseinhibitorer på TRAIL-induceret apoptose (fig 5B og 5C). Tilsætningen af den pan-caspase inhibitor Z-VAD dybt inhiberede TRAIL-induceret apoptose i begge cellelinier, og inhibitorer af caspase-8, -9, eller -2 også signifikant inhiberede TRAIL-induceret apoptose (
P
0,01). Vi undersøgte virkningen af disse inhibitorer på annexin V
– /PI
+ tidlige apoptotiske celler (Fig 5D). Interessant, hæmmere af enten caspase-9 eller -2 signifikant øget andelen af tidlige apoptotiske celler i TRAIL-behandlet MiaPaCa-2 og BxPC-3 kulturer (
P
0,05 eller
P
0,01). Disse resultater indikerer, at et panel af caspaser deltage i TRAIL-induceret apoptose i disse linjer, og antyder, at caspase-9 og -2 spille en inhiberende rolle i TRAIL-induceret necroptosis.
(A) MiaPaCa-2 og BxPC -3 celler blev dyrket med TRAIL (50 ng /ml) i 12 timer, og protein ekspressionsniveauer af caspase-3, caspase-8, caspase-9, og caspase-2 blev evalueret ved immunoblot. a-tubulin blev anvendt som kontrol. (B) MiaPaCa-2 og BxPC-3-celler blev dyrket med TRAIL (50 ng /ml) i nærvær af et panel af caspaseinhibitorer (20 uM) i 24 timer. Efter farvning med annexin V-FITC /PI, flowcytometrisk analyse blev udført. Tallene repræsenterer andelene af hver delmængde. Procentdelene af annexin V
+ -celler (C) og annexin V
– /PI
+ -celler (D) blev bestemt ved flowcytometri. Alle datapunkter er vist repræsenterer middelværdien af tre dyrkningsbrønde. *
P
0,05, **
P
0,01. panCi, pan-caspaseinhibitor; C9i, caspase-9-inhibitor; C8i, caspase-8 inhibitor; C2i, caspase-2-inhibitor. vehikelkontroller modtog et tilsvarende volumen DMSO.
nr krydstale mellem caspase-2 /-9 og ROS i TRAIL-behandlede cancerceller
Vi næste undersøgte forholdet mellem caspase-9 , -2, og ROS i TRAIL-behandlede bugspytkirtelkræftceller. Tilsætningen af et caspase-2-inhibitor inhiberede TRAIL-induceret caspase-9-spaltning i to cellelinier, men havde ingen tilsyneladende undertrykkende virkning på caspase-8-aktivering (fig 6A). En caspase-9-inhibitor undertrykte ikke caspase-2-aktivering (fig 6B). Tilsætningen af NAC undladt at undertrykke TRAIL-induceret aktivering af caspase-9 og -2 (fig 6C). Endelig har vi undersøgt virkningerne af caspase-2 eller -9 hæmning på ROS produktion af TRAIL-behandlede celler. Ingen klar suppression af ROS-produktion blev bemærket (Fig 6D og 6E). Disse resultater viser, at caspase-2 er opstrøms for caspase-9, og at der ikke er nogen krydstale mellem disse caspaser og ROS i TRAIL-behandlede MiaPaCa-2 og BxPC-3-celler.
(A) MiaPaCa-2 og BxPC-3-celler blev dyrket med TRAIL (50 ng /ml) med eller uden caspase-2-inhibitor (20 uM) i 12 timer, og proteinet ekspressionsniveauerne af caspase-3, -8 og -9 blev evalueret ved immunblot . a-tubulin blev anvendt som kontrol. (B) MiaPaCa-2 og BxPC-3-celler blev dyrket med TRAIL (50 ng /ml) med eller uden caspase-9-inhibitor (20 uM) i 12 timer, og proteinet ekspression af caspase-2 blev evalueret ved immunblot. p-actin blev anvendt som kontrol. (C) MiaPaCa-2 og BxPC-3-celler blev dyrket med TRAIL (50 ng /ml) med eller uden NAC (10 mM) i 12 timer, og proteinet ekspression af caspase-8, -2, og -9 blev evalueret ved immunoblot. p-actin blev anvendt som kontrol. (D) MiaPaCa-2 og BxPC-3-celler blev dyrket med TRAIL (50 ng /ml) med de angivne inhibitorer (20 uM). Som et køretøj kontrol blev et tilsvarende volumen af DMSO tilsat. Efter 6 timer for MiaPaCa-2 og 12 timer for BxPC-3, disse celler blev dyrket med carboxy-H
2DCFDA i 30 minutter og undersøgt for ROS-niveauer ved flowcytometri. Tallet repræsenterer den gennemsnitlige fluorescensintensitet. (E) Dataene repræsenterer middelværdien af tre dyrkningsbrønde. MFI: betyder fluorescensintensitet. *
P
0,05, NS, ikke signifikant
Diskussion
Da kræft i bugspytkirtlen er meget modstandsdygtig over for konventionelle behandlinger, og er forbundet med en dårlig prognose [. ,,,0],33], er nye behandlingsmodaliteter påkrævet. TRAIL kan være nyttige terapeutisk, fordi dette molekyle kan inducere celledød i mange typer kræft, men samtidig gør næsten ingen cytotoksicitet for normale celler [2]. I denne undersøgelse, vi først undersøgt roller ROS i TRAIL-induceret apoptose af humane pancreas cancer cellelinjer. Under disse forsøg, vi uventet fundet, at inhibering af ROS fremmet TRAIL-induceret nekrose af cancerceller. Vi derefter fastslået, at dette celledød var necroptosis.
ROS spille forskellige roller i mange typer celler. Lave fysiologiske niveauer af ROS fungerer som sekundære budbringere i intracellulær signalering og er nødvendige for normale cellefunktioner, hvorimod overdreven ROS forringe cellefunktioner og fremme celledød [34]. TRAIL er blevet vist at inducere ROS-generering i cancerceller [35], og antioxidanter blokere DR signalering-medieret apoptose [36, 37], hvilket tyder på, at ROS er mediatorer af dødsligand-induceret apoptose. Her fandt vi, at ROS blev kun fremstilles i TRAIL-følsomme bugspytkirtelkræft cellelinjer, og at peroxid bidrager, i det mindste delvist, til TRAIL-induceret apoptose i MiaPaCa-2-celler (Fig 2B). Alternativt inhibitoren af superoxid TEMPOL uventet forøget apoptose i TRAIL-behandlede BxPC-3-celler (Fig 2D), hvilket antyder, at superoxid virker som et anti-apoptotisk mediator under disse betingelser. Hvad var den mekanisme af den inhiberende virkning af superoxid på apoptose i TRAIL-behandlede BxPC-3-celler? ROS, især superoxid, kan inducere autophagy [26, 38, 39], og autofagi kan fungere cytoprotectively [40]. Vi har for nylig rapporteret, at autofagi spiller en anti-apoptotisk rolle i TRAIL-behandlede bugspytkirtelkræftceller [29]. Derfor undersøgte vi, om autofagi blev induceret i BxPC-3-celler og superoxid-inhibitoren TEMPOL undertrykt ROS-induceret autophagy, hvilket resulterer i fremme af apoptose. Vi evaluerede niveauet af autofagi i cancerceller ved at undersøge ekspressionen af LC3. Som et resultat blev autofagi kraftigt induceret i BxPC-3-celler sammenlignet med de andre pancreatiske cancercellelinjer, mens TEMPOL undladt at inhibere ekspressionen af LC3-type II, som en markør for autofagi [41], i BxPC-3-celler ” S1 fig “. Autophagy ikke bidrager til ROS-medieret beskyttelse i TRAIL-behandlede BxPC-3-celler. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at belyse den præcise mekanisme.
Nogle ligander, herunder TNF, FasL, og TRAIL, kan fremkalde både apoptose og necroptosis [1]. De mekanismer, der dikterer den cellulære beslutning om at undergå apoptose eller necroptosis er blevet undersøgt intensivt. I apoptose, caspaser er bødler apoptose; men disse proteaser har nogen positiv rolle i necroptosis [15]. ROS foreslås at være bødler necroptosis [42], og nogle celletyper, såsom muse L929 og embryonale fibroblaster, producere ROS som reaktion på TNFa og vise necroptosis [43, 44]. Derudover behandling med antioxidanter inhiberer necroptosis i nogle celletyper [44]. Imidlertid er ROS ikke påkrævet for necroptosis i alle celletyper og antioxidanter er i stand til at beskytte nogle cellelinier fra denne type af celledød [45, 46]. Disse former for evidens tyder på, at ROS-medieret necroptosis sandsynligvis en celletypeafhængig fænomen. I denne undersøgelse viste vi, at tilsætningen af NAC at inhibere peroxid fremmes necroptosis ved TRAIL stimulering i to humane pancreas cancer cellelinjer (Fig 3A). Denne stigning blev reduceret med necrostatin-1, en RIP1 inhibitor [30] (fig 3B og 3C), og siRNA-medieret RIP3 knockdown faldt necroptosis i TRAIL-behandlede BxPC-3-celler under inhibering af ROS (peroxid og superoxid) (Fig 4D og 4E). Disse resultater indikerede, at ROS spille en hæmmende rolle i TRAIL-induceret necroptosis i BxPC-3-celler. Alternativt MiaPaCa-2-celler var negative for RIP3 (figur 4), hvilket antyder, at RIP3 var undværlig for necroptosis i TRAIL-behandlede MiaPaCa-2-celler.
Vores resultater antyder, at nogen indlysende krydstale mellem ROS og caspase-2 /caspase-9 findes i den eksperimentelle system. Det er fortsat uløst, hvordan en tidlig nekrotisk befolkning blev induceret af TRAIL behandling under hæmning af caspase-2 eller -9. Inhibering af caspase-8 fremmer RIP1 /RIP3 kompleksdannelse, hvilket resulterer i død signalering-induceret necroptosis [19, 20]. Men dette synes ikke at være tilfældet i disse eksperimenter, hvor inhibering af caspase-8 havde mindre effekt end gjorde inhibering af caspase-2 eller -9 (Fig 5B og 5D). Desuden den pan-caspaseinhibitoren Z-VAD havde ingen effekt på TRAIL-induceret necroptosis af bugspytkirtelkræftceller.
Caspase-2 er blevet omtalt som en “orphan” caspase [25], og dens rolle i TRAIL-induceret apoptose af cancerceller er ikke blevet fuldt etableret. Det er blevet rapporteret, at caspase-2 er nødvendig for optimal TRAIL-medieret spaltning af Bid i humane coloncancer-celler [47]. Desuden caspase-2 primer cancerceller for TRAIL-induceret apoptose ved forarbejdning procaspase-8 [48]. I denne undersøgelse viste vi, at inhibering af caspase-2 undertrykt apoptose i TRAIL-behandlede cancerceller. Alternativt ROS aktivere caspase-2, og DNA-skader inducerer også sin spaltning [49]. Vi har for nylig rapporteret, at ROS trigger DNA-skader, hvilket fører til aktivering af caspase-2 i renal celle carcinom linjer [50]. Caspase-2-aktivering som respons på DNA-skade giver en vigtig forbindelse mellem sådanne skader og indgreb af den apoptotiske vej [50, 51]. Derudover ROS udløst caspase-2 aktivering og inducerede apoptose i en human leukæmisk T-cellelinie [51]. Men i denne undersøgelse fandt vi ingen krydstale mellem ROS og caspaser (Figur 6).
Ekspressionen af enten DR4 eller DR5 er forudsætning for TRAIL-induceret apoptose. De fem cellelinier undersøgelser var positive for DR5, men ikke for DR4 (fig 1B).
Leave a Reply
Du skal være logget ind for at skrive en kommentar.