PLoS ONE: Hæmning af Inducerbar Heat Shock Protein-70 (Hsp72) Forbedrer Bortezomib celledød i Human Blære Cancer Cells

Abstrakt

proteasominhibitoren bortezomib (Velcade) er en lovende ny agent for blærekræft terapi, men inducerbare cytobeskyttende mekanismer kan begrænse dens potentielle effekt. Vi bruges hele genomet mRNA ekspressionsprofil at undersøge virkningerne af bortezomib på stress-induceret genekspression i et panel af humane blære cancercellelinjer. Bortezomib induceret stærk opregulering af den inducerbare HSP70 isoformer HSPA1A og HSPA1B isoformer af Hsp72 i 253J BV og SW780 (HSPA1A

høj) celler, men kun inducerede HSPA1B isoformen i UM-UC10 og UM-UC13 (HSPA1A

lav) celler. Bortezomib stimulerede bindingen af ​​varmechok faktor-1 (HSF1) til HSPA1A promotoren i 253JB-V, men ikke i UM-UC13 celler. Methyleringsspecifik PCR viste, at HSPA1A promotoren blev methyleret i HSPA1A

lave cellelinier (UM-UC10 og UM-UC13) og udsættelse for chromatin demethyleringsmiddel 5-aza-2′-deoxycytidin restaureret HSPA1A ekspression. Overekspression af Hsp72 fremmet bortezomib modstand i UM-UC10 og UM-UC13 celler, mens forbigående knockdown af HSPA1B yderligere sensibiliserede disse celler for bortezomib, og påvirkning af kemikaliet HSF1 inhibitor KNK-437 fremmet bortezomib følsomhed i 253J B-V celler. Endelig shRNA-medieret stabil knockdown af Hsp72 i 253J B-V forfremmet følsomhed over for bortezomib

in vitro

i tumorxenoplantater

in vivo

. Sammen vores resultater giver proof-of-concept for at bruge Hsp72-inhibitorer til at fremme bortezomib følsomhed i blære kræft og foreslå, at selektiv målretning af HSPA1B kunne producere syntetisk letalitet i tumorer, der viser HSPA1A promotor methylering

Henvisning:. Qi W , hvid MC, Choi W, Guo C, Dinney C, McConkey DJ, et al. (2013) Hæmning af Inducerbar Heat Shock Protein-70 (Hsp72) Forbedrer Bortezomib celledød i Human Blære Cancer Cells. PLoS ONE 8 (7): e69509. doi: 10,1371 /journal.pone.0069509

Redaktør: Kevin Robert Kozak, University of Wisconsin School of Medicine og folkesundhed, USA

Modtaget: 11. december 2012; Accepteret: 10 Juni 2013; Udgivet: 18 Jul 2013

Copyright: © 2013 Qi et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af MD Anderson SPORE i Urogenitale Cancer (P50 CA091846), Cancer center Support Grant (CA016672), og proteasomhæmning og eR Stress (R01 CA127494). De finansieringskilder havde ingen rolle i undersøgelsen design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller perparation af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Nylige undersøgelser har vist, at øget proteinsyntese (oversættelse) er afgørende for neoplastisk transformation. Som følge af denne stigning, cancerceller synes at være særligt sårbare over for stoffer som hæmmer eliminering af aggregerede eller fejlfoldede proteiner fremstillet som en normal biprodukt af proteinsyntese. Proteasomet spiller en central rolle ved udskillelsen af ​​beskadigede proteiner og proteasominhibitorer inducere tumorcelledød stor del via protein aggregering og proteotoxicity. Dog er cytobeskyttende mekanismer opreguleres ved proteasomhæmning, begrænse indvirkningen på kræft celledød [1], [2], [3]. Derfor er det muligt, at tumorer, der besidder defekt (er) i disse cytobeskyttende mekanismer vil være særligt følsomme overfor proteasominhibitorer. Hvis der kan identificeres de relevante cytobeskyttende mekanismer, kan det være muligt at identificere disse tumorer fremadrettet. Alternativt kan det være muligt at udvikle terapeutiske metoder, der forstyrrer disse cytobeskyttende mekanismer og derved fremme proteasominhibitoren følsomhed i tumorer, der ellers ville være resistente over for denne klasse af lægemidler.

Heat shock inducerer også protein aggregering og proteotoxicity med varmechok proteiner (HSP’er) fremme varme tolerance ved at forhindre uhensigtsmæssig stress-induceret protein aggregering, bistå i ordentlig refoldning af denaturerede proteiner, og om nødvendigt, at fremme deres nedbrydning [4], [5], [6]. Medlemmer af Hsp70 familien er blandt de mest højt konserverede proteiner i evolution og spiller kritiske roller i disse processer [7]. Den største stress-inducerbare medlem af Hsp70 chaperone familien omtales som Hsp72 og kodes af to gener, HSPA1A og HSPA1B, som producerer Hsp72 isoformer, der deler alle på nær to aminosyrer og menes at være funktionelt overflødige [8]. Hsp72 ekspression styres via hurtig aktivering af varmechok faktor-1 (HSF1), en transskriptionsfaktor, som binder til flere specifikke responselementer beliggende inden for Hsp72 isoform promotorer og promotorerne af andre varme-induceret cytobeskyttende chaperoner [9]. Hsp72 er stærkt homolog med den 78 kDa glucose-reguleret protein (HSPA5, GRP78 /BiP), som spiller en central rolle ved at koordinere aktiveringen af ​​den udfoldede protein respons (UPR) og er også induceret af proteasominhibitorer [10]. Hsp72 konstitutivt udtrykkes i høje niveauer i maligne tumorer af forskellig oprindelse [11], [12], fremme cancer celleoverlevelse [13], [14]. Vigtigere er Hsp72 også robust induceret af proteasominhibitorer [15], [16].

I en tidligere undersøgelse, vi rapporterede, at cirka halvdelen af ​​humane blære cancerceller er resistente over for de cytotoksiske virkninger af bortezomib

i vitro

[17]. Her anvendte vi genekspressionsprofilering at undersøge cytobeskyttende mekanismer, der bidrager til bortezomib modstand, og fandt, at Hsp72 er en af ​​de mest robust inducerede gener på mRNA-niveauet følgende bortezomib eksponering. Vi fandt imidlertid, at Hsp72-ekspression er isoformspecifik i en undergruppe af blære cancerceller (UM-UC10 og UM-UC13) som følge af promotor-methylering af HSPA1A isoformen. Disse celler udviser forøget ekspression af HSPA1B isoform således at basal og bortezomib-induceret Hsp72 proteinniveauer ligner dem fundet i cellelinier, som udtrykker både A1A og A1B isoformer (253JB-V og SW780). Vi rapporterer også, at undertrykkelse af Hsp72 induktion forbedret bortezomib-induceret celledød i både 235JB-V og UM-UC10, og overekspression af Hsp72 beskyttet UM-UC10 og UM-UC13 celler fra bortezomib-induceret cytotoksicitet. Samlet set uanset hvilken isoform genererer Hsp72 protein udtryk, vores data viser, at undertrykkelse af Hsp72 induktion øger bortezomib følsomhed, og støtte den videre udvikling af HSF1 og Hsp72-hæmmere til at øge bortezomib følsomhed i blære kræftformer.

Materialer og metoder

cellelinier og reagenser

blærekræft cellelinier blev opnået fra MD Anderson blærekræft SPORE cellelinje Repository og opretholdt i MEM suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) (Omega Scientific, Tarzana, CA). Ægtheden af ​​alle de cellelinjer blev bekræftet på depositum ved DNA-fingeraftryk, og deres identitet blev rutinemæssigt bekræftet under eksperimenter i MD Anderson Kendetegnet cellelinje Core [18]. Cellelinie 253-JB-V, [19] UMUC-10, [20] og UMUC-13 [20] blev isoleret fra patienter med urotelial cancer. SW780 blev oprindeligt købt fra American Type Culture Collection (ATCC) på Biocompare.com. Bortezomib blev indkøbt fra ChemieTek (IN, USA). For

in vitro

eksperimenter, bortezomib blev opløst i DMSO ved en bestand koncentration på 10 mM, steriliseret ved filtrering gennem et 0,22 um sprøjtefilter, med portioner opbevaret ved -20 ° C indtil anvendelse. Før anvendelse blev bestanden fortyndet i medium til de ønskede koncentrationer. Til injektion af mus, blev bortezomib opløst i saltopløsning indeholdende 10 mg /ml mannitol lige før behandling.

cellelevedygtighed Assays Salg

Celler blev eksponeret for bortezomib, indsamlet på de angivne tidspunkter ved trypsinisering, og resuspenderet i 500 pi PBS. Halvtreds pi PBS, pH 7,4, indeholdende 100 pg /ml propidiumiodid (PI) blev tilsat til de resuspenderede celler, og PI-optagelse (betegnende for celledød) blev analyseret umiddelbart ved flowcytometri (FACS) på en Cytomics FC 500 med CXP Software (Beckman Coulter, Fullerton, CA.

i trypanblåteksklusion, celler blev opsamlet ved trypsinbehandling, farvet med 0,4% trypanblåt (Invitrogen), og celler blev talt under anvendelse af et hæmocytometer. forsøget blev udført tredobbelt.

Microarray Analyser

microarray eksperimenter blev udført som tidligere beskrevet [21] med mindre modifikationer. RNA blev isoleret fra celler ved anvendelse af TRIzol Reagens (Invitrogen /Life Technologies, Grand Island, NY ), efterfulgt af oprydning med RNeasy Mini kit (Qiagen, Germantown, MD). RNA blev anvendt til syntese af biotin-mærket cRNA, som blev fremstillet ved anvendelse af Illumina RNA-amplifikation kit (Ambion /Life Technologies), og derefter hybridiseret til Illumina Menneske-HT12 (Illumina, Inc., Hayward, CA) chips. vaskede chips blev scannet med BeadStation 500x (Illumina) og signalintensiteter kvantificerede med BeadStudio (Illumina). Den Heatmap blev foretaget ved hjælp Cluster 3.0 og Java Treeview fra Eisen lab (https://www.eisenlab.org/eisen/). Den microarray datasæt kan findes i Gene Expression Omnibus, tiltrædelse nummer GSE46132.

mRNA Extraction, Reverse Transcription og kvantitativ real-time PCR

mRNA udvinding og revers transkription blev udført som beskrevet tidligere [22 ]. RNA blev isoleret fra celler ved anvendelse af TRIzol Reagens (Invitrogen), og cDNA-syntese blev udført under anvendelse SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen). Real-time PCR for HSPA1A, HSPA8, HSPB1, DNAJB1, og glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (GAPDH) udførtes under anvendelse af en StepOne real-time PCR-system (Applied Biosystems /Life Technologies). De TaqMan primer sæt til HSPA1A (Hs00359163_s1), HSPA1B (Hs00271244_s1), pan-HSPA1A HSPA1B (Hs00271229_s1), HSPA8 (Hs03045200_g1), HSPB1 (Hs03044127_g1), DNAJB1 (Hs00428680_m1), og for GAPDH (4333764F) blev erhvervet fra Applied Biosystems. Amplifikationsprotokollen bestod af en cyklus ved 50 ° C i 2 minutter, en cyklus ved 95 ° C i 10 minutter, efterfulgt af 40 cyklusser ved 95 ° C i 15 s og 60 ° C i 60 s, og transcript niveauer blev kvantificeret ved anvendelse af sammenlignende C

T metoden. De resulterende data blev analyseret med StepOne software og udtrykt som middelværdien af ​​forhold (relative ekspression til kontrol) ± SE, og GAPDH tjente som intern loading kontrol.

Behandling af celler med 5-aza-2′ deoxycytidin (5-AzdC)

celler blev udpladet ved lav densitet (-5 x 10

4 celler /brønd) i plader med 6 brønde og lodes binde natten over. Celler blev derefter udsat for 5 uM 5-AzdC opløst i 50% eddikesyre i 5 dage. Bortezomib (30 nM) blev derefter tilsat til passende brønde 6 timer før høst på dag 5, og cellerne blev opsamlet til RNA-isolering. 5-AzdC blev opnået fra Sigma.

DNA methyleringsanalyse

Genomisk DNA blev isoleret ved anvendelse af et genomisk DNA isolation kit (Qiagen). DNA (1 ug) blev omdannet med natriumbisulfit ved hjælp af EpiTect bisulfit Kit (Qiagen) ifølge producentens instruktioner. Det bisulfit-modificerede DNA blev derefter underkastet methylering-specifik PCR (MSP). De anvendte primere til MSP blev designet ved hjælp Methprimer. Primeren sat for konverterede methyleret DNA var 5′-TGTTTTTTTTATTCGGATTAGTTAAC-3 ‘(fremad) og 5′-CCACCTACTCGCTAAAACTACGTA-3’ (revers); Primeren sat for konverterede umethyleret DNA var 5’TTTTTTTTATTTGGATTAGTTAATGT -3 «(fremad) og 5’CCCACCTACTCACTAAAACTACATA -3« (tilbage). PCR-proceduren omfattede en initial inkubation ved 95 ° C i 10 minutter, efterfulgt af 35 cykler ved 95 ° C i 30 s, 49 ° C i 30 s og 72 ° C i 40 s, efterfulgt af en cyklus af 72 ° C i 10 min. MSP PCR-produkter blev separeret på 2% agarosegeler og visualiseret ved ethidiumbromidfarvning. Fuldt methyleret kontrol-DNA og umethyleret kontrol-DNA blev anvendt som kontroller.

immunblotting

Celler blev høstet ved trypsinisering og lyseret i buffer indeholdende 20 mM Tris-HCI (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM Na

2EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton, 2,5 mM natriumpyrophosphat, 1 mM beta-glycerophosphat, 1 mM Na

3VO4, 1 ug /ml leupeptin og 1 mM PMSF. Helcelleekstrakterne (20 ug totalt protein) blev underkastet natriumdodecylsulfat-10% polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) og overført til nitrocellulosemembraner (Bio-Rad, Hercules, CA). Membraner blev probet først med enten et monoklonalt antistof specifikt for Hsp72 (SPA-810, StressGen /Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY), HSF1 (SPA-901, StressGen /Enzo) eller human beta-actin (Sigma, St. Louis , Mo.), og derefter med passende peberrodsperoxidasekonjugeret sekundære antistoffer (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX). Immunodetektion blev udført under anvendelse af ECL (Amersham, Piscataway, NJ) ifølge producentens instruktioner.

chromatin immunoprecipitation

kromatin Immunfældning (chip) blev udført med chippen-IT ™ Express Enzymatisk kit, og chip -IT ™ Control Kit (Active Motif) ifølge fabrikantens protokol. Kontrol- og bortezomib-behandlede 253JB-V og UM-UC13-celler (1,5 x 10

7 hver) blev fikseret i 8 minutter ved stuetemperatur og forskydes ved enzymatisk fordøjelse i 10 minutter. Den afskårne kromatin gav bands mellem 200-1500 bp som visualiseret ved agarosegelelektroforese. DNA bundet til HSF1 blev udfældet med et anti-HSF1 antistof (StressGen /Enzo, SPA-901). Til at opformere HSF1-bundne HSPA1A promotoren, blev det udfældede DNA underkastes realtids-PCR under anvendelse af TaqMan ° Gene Expression Master Mix med brugerdefinerede TaqMan® genekspression Assay primere (ABI) svarende til HSF1-bindende region af HSPA1A promotoren ( -10 til -180) [23], [24]. Real-time PCR blev udført under anvendelse af ABI StepOne med følgende betingelser: 5 minutter ved 50 ° C; 10 minutter ved 95 ° C; derefter 40 cykler ved 95 ° C i 15 sekunder, 60 ° C i 60 sekunder. De præsenterede data repræsenterer resultater for tre separate chip eksperimenter og blev normaliseret til reaktioner udført med 1% af input. End-point PCR reaktioner blev også udført som beskrevet tidligere [25] for at bekræfte de real-time PCR resultater. Normal IgG antistof blev anvendt som kontrol.

Molekylær Modulation af Hsp72 Expression

lentivirale pLKO.1-baserede konstruktioner TRCN0000008762 og TRCN0000008757 specifikt rettet mod Hsp72-genet blev købt fra Open Biosystems, Inc. den tomme pLKO.1 vektor blev anvendt som kontrol. Rekombinante vira blev fremstillet ved calciumphosphat-transfektion af HEK293T celler under anvendelse af standardprotokoller. På dag 2-3 efter kultur blev 253J-BV-celler inkuberet med shRNAs og polybren (6 ug /ml) i 16~24 timer og de transducerede celler blev selekteret i 1 pg /ml puromycin. Til transient silencing af Hsp72 i UM-UC10 celler blev celler inkuberet i 6 eller 24-brønds plader i 72 timer med enten ikke-targeting (D-001206-14-20), siHSPA1A (L-005.168 til 00), eller HSPA1B (L-003.501-00) siRNA konstruktioner fra Dharmacon /Thermo Scientific, Waltham, MA. Lipofectamin RNAiMAX transfectionreagent (Invitrogen) blev anvendt til at forbedre siRNA levering i henhold til producentens anvisninger. For overekspression af Hsp72, blev Precision LentiORF RFP kontrol (OHS5832) og Precision LentiORF individuel klon for HSPA1A (OHS5897-100998480) indkøbt fra Open Biosystems blev Inc. transducerede celler udvælges i 5 ug /ml blasticidin og FACS-sortering af GFP-positive celler .

Lysosomale Integrity assays

Celler (~1-2 × 10

5), blev forgyldt i 6-brønds plader og lov til at vedhæfte natten over. Celler blev derefter udsat for bortezomib i 24 timer. Efter lægemiddelbehandlinger, 100 nM LYSOTRACKER Red DND-99 (Molecular Probes /Life Technologies, Grand Island, NY) blev tilsat til cellerne i 30 minutter før høst. Celler blev trypsinbehandlet, vasket en gang med PBS og resuspenderet i frisk PBS, og fluorescens blev målt ved anvendelse af en Beckman Coulter FC500 flowcytometer.

xenografundersøgelser

Kvindelige athymiske nøgne mus blev købt hos National Cancer Institute (NCI-Frederick). Musene blev huset og holdt under specifikke patogenfrie forhold i anlæg, der er godkendt af den amerikanske Association for akkreditering af Laboratory Animal Care og i overensstemmelse med gældende regler og standarder for det amerikanske landbrugsministerium, United States Department of Health og Human Services. Denne undersøgelse blev udført i nøje overensstemmelse med anbefalingerne i Vejledning for Pleje og anvendelse af forsøgsdyr af National Institutes of Health. Protokollen blev godkendt af University of Texas M. D. Anderson Cancer Center Animal Care og brug Udvalg (ACUF Protocol # 11-00-12734). Musene overvåges dagligt, herunder weekender og helligdage, med eutanasi udføres ved hjælp af CO2 i tilfælde af et af følgende: tumor er større end 1,5 cm, 20% vægttab, sløvhed, manglende evne til at skaffe føde og /eller vand, anstrengt vejrtrækning, foroverbøjet kropsholdning, abdominal distension svarende til en gravid mus eller uarbejdsdygtig som følge af tumorvækst.

nøgne mus (NIH, 6 uger gamle) blev indpodet subkutant (sc) med 2 x 10

6 253J BV celler transduceret med HSPA1A shRNA konstruktion (253JB-V.KDHsp72) eller et ikke-targeting kontrol konstrukt (253JB-V.NT) (10 mus /gruppe). Når tumorer blev palpable (5~7 dage), blev musene randomiseret til kontrol eller behandlingsgrupper. Musene blev behandlet i.v. (Via halevenen) hver anden uge med 1 mg /kg bortezomib formuleret i saltvand indeholdende 10 mg /ml mannitol i et volumen på 100 pi eller med 100 pi saltvand indeholdende 10 mg /ml mannitol som en vehikelkontrol. Caliper målinger af de længste vinkelrette tumordiametre blev udført to gange om ugen efter behandlingens start, og i produktionen af ​​tumorer blev beregnet efter formlen: W * W * L /2 (hvor W og L repræsenteret tværgående diameter, og længste langsgående) . For H . E-analyse, tumorer blev indsamlet fra mus 24 timer efter den anden behandling og derefter fikseret i OCT og 10% formalin

UCSC Genome Browser

UCSC Genome Browser [26] blev anvendt til at identificere tilstedeværelsen af ​​en CpG ø omkring HSPA1A promotorregionen, i genomet Browser blev Encyclopedia of DNA-elementer konsortium (KODE) database [27] anvendes til at identificere tilstedeværelsen af ​​methylering i andre celletyper. Den UCSC Genome Browser er offentligt tilgængelige på følgende websted:. https://genome.ucsc.edu/

Statistik

Statistik blev genereret ved hjælp af Students

t

test funktioner i GraphPad Prism 5 og Microsoft Excel software. P-værdier for 0,05 blev anset for at være betydelige

Resultater

Differential Induktion af HSPA1A i Blære Cancer Cells

Vi valgte fire repræsentative humane blærekræft cellelinjer (. 253J BV, SW780, UM-UC10, og UM-UC13) for karakterisering af molekylære biologiske mekanismer, der bestemmer cellulær respons til proteasominhibitoren bortezomib. Vi bekræftede først at cellelinierne var heterogene med hensyn til deres følsomhed til bortezomib-induceret celledød som bestemt ved anvendelse propidiumiodidfarvning og FACS-analyse (PI-FACS) for at måle tab af plasmamembranintegritet (fig. 1A). Vi anvendte derefter hele genomet mRNA-ekspression profilering (Illumina platform) at identificere genet ekspressionsmønstre associeret med lægemiddel følsomhed og /eller resistens. Bortezomib induceret stærk opregulering af mRNA, der koder den store inducerbare isoform af Hsp72 (HSPA1A) i den mest bortezomib-resistent cellelinje (253J B-V), men ikke i den mest lægemiddel-sensitive linie (UM-UC13) (fig. S1). Vi bekræftede disse resultater ved hjælp af kvantitativ real-time RT-PCR, viser, at HSPA1A mRNA stærkt blev induceret ved bortezomib i 253JB-V og SW780 celler (~25-60 gange over ubehandlede niveauer), mens udtryk steg kun svagt induceret (~2- 4 gange over ubehandlede niveauer) i UM-UC10 og UM-UC13 celler (fig. 1B). Vi bemærkede også meget lav basal HSPA1A mRNA-ekspression i UM-UC10 og UM-UC13 celler (~50-250 gange lavere end 253JB-V og SW780), og disse forskelle blev forværret ved bortezomib eksponering således at HSPA1A ekspressionsniveauerne var ~1000-3000 fold lavere i UM-UC10 og UM-UC13-celler end i 253JB-V og SW780 (fig. 1B). Men immunoblotting afslørede sammenlignelige Hsp72 protein niveauer i alle 4 cellelinjer (Fig. 1C).

A. Effekter af bortezomib på celledød. Blærekræft cellelinier (253JB-V, SW780, UM-UC10, UM-UC13) blev inkuberet med eller uden 100 nM bortezomib i 24 timer og PI /FACS blev anvendt til at kvantificere celledød. Middelværdi ± SEM, n = 3. B. Virkninger af bortezomib på mRNA-ekspression af Hsp72-isoformen HSPA1A. Celler blev udsat for 30 nM bortezomib i 6 timer og HSPA1A blev målt ved kvantitativ RT-PCR. RQ = relativ mængde (GAPDH). Værdier repræsenterer middelværdier ± SEM (N≥3) C. Virkninger af bortezomib på Hsp72 protein niveauer. Celler blev inkuberet i 16-18 timer med 30 nM bortezomib (nM), og Hsp72-niveauer blev målt i helcellelysater ved immunoblotting. Blots er repræsentative for to uafhængige forsøg.

HSPA1B Isoform Kompenserer for Tab af HSPA1A Expression i UM-UC10 og UM-UC13 celler

Hsp72 er kodet af to uafhængige genetiske loci (HSPA1A og HSPA1B), der producerer meget homologe protein produkter. Vi karakteriseret derfor HSPA1B udtryk i HSPA1A

lave celler. Vi anvendte primere specifikke for de to isoformer af Hsp72, HSPA1A og HSPA1B samt en primer, som genkendte både (PAN) isoformer til sammenligning. Vores data viste, at HSPA1A

lave celler (UM-UC10, UM-UC13) havde højere udtryk for HSPA1B isoformen ved baseline end gjorde HSPA1A-høje celler (253JB-V, SW780) (fig. 2A). Derudover blev HSPA1B ekspression mere robust induceret efter bortezomib eksponering i HSPA1A

lave cellelinier, som manglede den A1A isoformen (fig. 2B). Vigtigere, udtryk målt ved pan-primer var ens på tværs af alle fire cellelinjer, der bekræfter immunoblotting data (Fig. 1C). Disse data tyder på, at øget HSPA1B udtryk kompenseret for manglen på HSPA1A og tegnede sig for Hsp72 protein-ekspression i UM-UC10 og UM-UC13 celler.

A. Basal ekspression af HSPA1A og HSPA1B isoformer på tværs af de fire cellelinier. B. Bortezomib-induceret ekspression af HSPA1A og HSPA1B tværs af de fire cellelinier. Specifikke primere for hver isoform, samt en pan-primer, som genkendes begge isoformer, blev anvendt til måling ekspression ved kvantitativ RT-PCR. Værdier repræsenterer middel ± SE (n = 2). RQ = relativ mængde (GAPDH).

Manglende HSPA1A inducerbarhed i UM-UC10 og UM-UC13 celler skyldes Promoter Methylering

Heat shock faktor-1 (HSF1) aktivering styrer den globale varme chok reaktion og stress-induceret opregulering af Hsp72 [28]. For at teste, om HSF1-ekspression påvirke forskellene i HSPA1A udtryk blandt vores cellelinjer, vi målte HSF1 mRNA og protein niveauer i 253JB-V (HSPA1A

høj) og UM-UC13 (HSPA1A

lav) celler. Vi observerede beskedne forskelle i basal og BZ-inducerede HSF1 mRNA niveauer mellem 253JB-V og UM-UC13 celler; specifikt viste 253JB-V en 2-fold stigning i HSF1 niveauer ved udsættelse stof, mens UM-UC13 viste kun ~1.3 fold stigning, men havde 2 gange højere HSF1 mRNA-ekspression ved baseline end gjorde 253JB-V (fig. 3A, venstre panel). Imidlertid proteinniveauer optrådte væsentlige er lig mellem begge celletyper (fig. 3A, højre panel). Endvidere blev andre HSF1 mål kraftigt induceret, herunder den førnævnte HSPA1B (fig. 2) og DNAJB1 (Hsp40) (Fig. S2) i UM-UC10 og UM-UC13 celler antyder, at der ikke var nogen generaliseret defekt i endogen HSF1 aktivering i disse celler. Vi begrundede derfor, at UM-UC10 og UM-UC13 celler kan besidde specifik defekt (er) i HSF1-medieret aktivering af HSPA1A promotoren. Konsistent med denne ide, chromatin immunoprecipiation (chip) afslørede, at 253J BV celler besad højere niveauer af HSF1 binder til HSPA1A promotoren ved baseline og følgende bortezomib eksponering end gjorde UM-UC13 (ca. 2 gange og -5-gange højere) (fig. 3B). Den fold-induktion af HSF1 binding ved bortezomib var -9-fold vs -4 gange i 253JB-V og UM-UC13 hhv. Analyse af HSPA1A promotoren ved hjælp af UCSC Genome Browser afslørede, at det ligger inden for et CpG ø, der er methyleret i andre cancercellelinier (fig. S3). Brug af methylering-specifik PCR, vi bekræftet, at HSPA1A promotoren stærkt blev methyleret på UM-UC10 og UM-UC13 men ikke i 253J B-V eller SW780 celler (fig. 3C), som eventuelt tegnede sig for defekte bortezomib-induceret HSPA1A induktion. For direkte at teste denne mulighed, vi undersøgt virkningerne af histon methyltransferase inhibitor 5-aza-2′-deoxycytidin på basal og bortezomib-induceret HSPA1A mRNA-niveauer i UM-UC10 og UM-UC13 celler. Den hæmmer inducerede store stigninger i både basal og proteasominhibitoren-induceret HSPA1A niveauer i både bortezomib-følsomme cellelinjer (Fig. 3D). Sammen disse resultater viser, at kromatin methylering er ansvarlig for den defekte HSPA1A induktion observeret i UM-UC10 og UM-UC13 celler.

A. Ekspression af HSF1. 253J B-V og UM-UC13 blærekræft cellelinier blev udsat for bortezomib i 12 timer og HSF1 mRNA (venstre felt) og proteinniveauer (højre panel) blev målt ved kvantitativ RT-PCR og immunoblotting hhv. Værdier repræsenterer middel ± SE (n = 2); blots er repræsentative for mindst to uafhængige forsøg. B. chromatin immunoprecipitation (chip) analyse af HSF1 binding til HSPA1A promotoren. Bemærk, at basal og bortezomib-induceret HSF1 binding blev stærkt reduceret i de bortezomib-følsomme UM-UC13 celler. Middelværdi ± SEM, n = 3. * P 0,05 C. Selektiv methylering af HSPA1A promotoren i bortezomib-sensitive humane blære cancerceller. Methyleringsspecifik PCR blev anvendt til at vurdere kromatin methylering i lægemiddel-sensitive (UM-UC10, UM-UC13) og lægemiddelresistente (253J B-V, SW780) cellelinier som beskrevet i Materialer og Metoder. m, methyleret; u, umethyleret. m /u nøgletal blev beregnet ved hjælp af densitometri. Data er repræsentative for mindst to uafhængige forsøg. D. DNA methyltransferase inhibitor 5-aza-2′-deoxycytidin gendanner HSPA1A ekspression i bortezomib-sensitive celler. Celler blev inkuberet med 5 uM 5-AzdC i 5 dage og derefter inkuberet med eller uden 30 nM bortezomib i 6 timer, og HSPA1A ekspression blev målt ved kvantitativ realtids-PCR. Værdier repræsenterer gennemsnit ± SEM, n = 3. RQ = relativ mængde (GAPDH).

Modulation af HSPA1A og HSPA1B Expression i HSPA1A

lave Cells

Siden UM -UC10 og UM-UC13 manglede HSPA1A udtryk, vi undersøgt, om udskiftning af HSPA1A isoformen vil fremme bortezomib modstand. For at løse dette, vi stabilt overudtrykt HSPA1A i både UM-UC10 og -UC13 celler ved hjælp af en lentiviral vektor. HSPA1A mRNA-ekspression blev bekræftet under anvendelse QRT-PCR og Hsp72 total protein stiger med immunoblotting (fig. 4A). HSPA1A overudtrykker celler og tom vektor transducerede celler blev derefter udsat for bortezomib og vi opdagede at overekspression signifikant reduceret bortezomib-induceret celledød (fig. 4B). Omvendt fordi UM-UC10 og -UC13 celler syntes at udelukkende være afhængige af HSPA1B mRNA for Hsp72 protein-ekspression, vi hypotese, at disse celler kan være særligt modtagelige for målretning af HSPA1B. For at teste dette, brugte vi siRNA til forbigående tavshed HSPA1B i UM-UC10 celler. Analyse af knockdown effektiviteter afslørede, at den kommercielt tilgængelige siRNA’er ikke specifikt kan målrette individuelle isoformer (dvs. siHSPA1A tavshed HSPA1B) (fig. 4C). Ikke desto mindre, en kombination af siHSPA1A og siHSPA1B sekvenser gav den bedste (men ikke fuldstændige) samlet knockdown af A1B isoformen på både RNA- og proteinniveau (fig. 4C). Under anvendelse af denne strategi, bekræftede vi, at blokade af HSPA1B induktion sensibiliseret UM-UC10 celler til bortezomib (Fig. 4D).

A. Virkninger af tvungen HSPA1A overekspression på HSPA1A mRNA og Hsp72 totale proteinniveauer i UM-UC10 og UM-UC13 celler. Celler blev stabilt transduceret med en lentiviral HSPA1A ekspressionskonstruktion, og HSPA1A niveauer blev målt ved kvantitativ RT-PCR. Middelværdi ± SEM, n = 3. RQ = relativ mængde (GAPDH). Proteinniveauer blev målt via immunblotting. Blots er repræsentative for to uafhængige forsøg. B. Virkninger af HSPA1A overekspression på bortezomib-induceret celledød. Celler transduceret med tom vektor (NT) eller med den HSPA1A ekspressionskonstruktionen blev udsat for 30 nM bortezomib i 24 timer og plasmamembranintegritet blev målt ved trypanblåt-optagelse. (Tilstedeværelsen af ​​RFP i ekspressionskonstruktionen forhindret vores brug af PI /FACS celledød assay.) Middelværdi ± SEM, n = 3. *, P 0,02. C. Knockdown af HSPA1B i UM-UC10-celler. Venstre panel, Knockdown virkningsgrad på siRNA mod HSPA1A, HSPA1B, eller begge isoformer som målt ved kvantitativ RT-PCR efter udsættelse for 30 nM bortezomib i 6 timer. RQ = relativ mængde (GAPDH). Right panel, tilsvarende knockdown af Hsp72 protein niveauer ved forskellen siRNA-sekvenser efter eksponering for 30 nM BZ i 14 timer. Data er repræsentative for to uafhængige forsøg. D. Virkning af HSPA1B knockdown på bortezomib-induceret celledød i UM-UC10-celler. Efter 72 h knockdown blev celler eksponeret for 30 nM bortezomib i 24 timer og celledød måles ved PI /FACS-analyse. Værdier repræsenterer middel ± SE (n = 3). * P. 0,01

Hsp72 Induktion Forhindrer Bortezomib celledød

For at mere direkte bestemme, om bortezomib-induceret Hsp72 opregulering forfremmet modstand, vi stabilt slået ned Hsp72 i 253JB-V bortezomib-resistente celler under anvendelse af en lentiviral shRNA vektor (fig. 5A). Baseline HSPA1A mRNA niveauer blev reduceret med mere end 75% i cellerne, men shRNA-medieret undertrykkelse af HSPA1A mRNA (fig. 5A. Øverste panel) og Hsp72 protein (fig. 5A, nederste panel) var mindre imponerende efter udsættelse for bortezomib, formentlig fordi proteasominhibitor producerede en så stærk opregulering af Hsp72. Ikke desto mindre stabil Hsp72 knockdown signifikant forøget bortezomib-induceret tab af plasmamembranintegritet som målt ved propidiumiodid-optagelse (fig. 5B). Tidligere undersøgelser konkluderede, at Hsp72 induktion serverer en cytobeskyttende funktion i den integrerede stress respons (ISR) ved stabiliserende lysosomer [29]. Som sådan, vi sammenlignede virkningen af ​​bortezomib på lysosomale integritet i 253JB-V celler transduceret med kontrol vektor (253JB-V NT) eller KD9 HSPA1A-specifikke shRNA konstruktion. Bortezomib havde lidt at ingen indvirkning på lysosomale integritet i 253JB-V NT celler, men inducerede stærk, koncentrationsafhængig tab af lysosomale integritet i 253JB-V-KD9 celler (Figur 5C). indsprøjtning.