PLoS ONE: A PK2 /Bv8 /PROK2 Antagonist undertrykker Tumordannende processer ved at hæmme angiogenese i gliom og Blokering myeloid Cell Infiltration i kræft i bugspytkirtlen

abstrakt

Infiltration af myeloide celler i tumormikromiljøet er ofte forbundet med forøget angiogenese og tumorprogression, hvilket resulterer i dårlig prognose i mange typer af cancer. Polypeptidet kemokin PK2 (Bv8, PROK2) er blevet vist at regulere myeloid celle mobilisering fra knoglemarven, hvilket fører til aktivering af den angiogene proces, samt akkumulering af makrofager og neutrofiler i tumorstedet. Neutraliserende antistoffer mod PK2 blev vist at vise potent anti-tumor effekt, der illustrerer potentialet i PK2-antagonister som terapeutiske midler til behandling af cancer. I denne undersøgelse viser vi den antitumoraktiviteten af ​​et lille molekyle PK2 antagonist, PKRA7, i forbindelse med glioblastom og bugspytkirtelkræft xenograft tumormodeller. For de meget vaskulariserede glioblastom, blev PKRA7 forbundet med nedsat blodkar densitet og forøget nekrotiske områder i tumormassen. I overensstemmelse med den antiangiogene aktivitet af PKRA7

in vivo

, dette stof reduceres effektivt PK2-induceret mikrovaskulære endotelceller forgrening

in vitro

. For dårligt vaskulariseret pancreascancer, vises den primære antitumorvirkning af PKRA7 at være medieret af blokeringen af ​​myeloid cellemigration /infiltration. På molekylært niveau, PKRA7 inhiberer PK2-induceret ekspression af visse pro-migrerende chemokiner og chemokinreceptorer i makrofager. Kombinere PKRA7 behandling med kemoterapeutiske standardmidler resulterede i øget virkning i xenograftmodeller for begge typer tumor. Tilsammen vores resultater viser, at antitumoraktiviteten af ​​PKRA7 kan medieres af to forskellige mekanismer, som er relevante for de patologiske træk ved den specifikke type cancer. Denne lille molekyle PK2 antagonist giver løfte skal videreudvikles som et effektivt middel til kombinatoriske kræftbehandling

Henvisning:. Curtis VF, Wang H, Yang P, McLendon RE, Li X, Zhou Q-Y, et al. (2013) En PK2 /Bv8 /PROK2 Antagonist undertrykker Tumordannende processer ved at hæmme angiogenese i gliom og Blokering myeloid Cell Infiltration i kræft i bugspytkirtlen. PLoS ONE 8 (1): e54916. doi: 10,1371 /journal.pone.0054916

Redaktør: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japan

Modtaget: Juni 25, 2011; Accepteret: 17. december 2012; Udgivet: 23 Jan 2013

Copyright: © 2013 Curtis et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Det var støttet af CA151541 at XFW fra National Cancer Institute (www.cancer.gov) og MH67753 at QYZ fra National Institutes of Health (www.nimh.nih.gov). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Den komplekse tumor mikromiljø er en vigtig bidragyder til tumorigenese. I de senere år har en øget fokus blevet placeret på målretning stromacellerne i tumormikromiljøet, der er ansvarlige for forskellige aspekter af den tumorigene proces. Knoglemarvafledte myeloide celler, som er forstadier til makrofager, neutrofiler og myeloide afledte suppressorceller, udgør en subpopulation af stromaceller der spiller vigtige roller under tumorprogression [1]. Som svar på cytokiner /chemokiner udskilt af tumorceller, kan myeloide celler mobiliseres fra knoglemarven og infiltrere tumorsteder, hvor de kan fremme vækst, invasion og angiogenese til støtte tumor ekspansion og metastase [2]. For eksempel kan CSF3 (kolonistimulerende faktor 3), også kendt som G-CSF, der produceres af tumorceller føre til differentiering af CD11b

+ Gr1

+ myeloide celler i neutrofiler, makrofager og dendritiske celler, dvs. har vist sig at være overproduceres i kræftpatienter og tumorbærende mus [1], [3] – [4]. På tumorstedet, disse CD11b

+ Gr1

+ myeloide celler udskiller en række faktorer, der direkte kan bidrage til angiogenese og tumorvækst [5] – [6].

Blandt disse faktorer produceret af CD11b

+ Gr1

+ myeloide celler prokineticin 2 (PROK2), kaldet PK2 i dette dokument, også kendt som Bv8. Som en af ​​to medlemmer af prokineticin familie, PK2 binder sig til to meget beslægtede G-protein-koblede receptorer (GPCR), PROKR1, kaldet PKR1 og PROKR2, kaldet PKR2, og påvirker flere biologiske processer, herunder nociception, døgnrytme , gastrointestinal motilitet, neurogenese, hæmatopoiese og angiogenese [7]. PK2 produktion af CD11

+ Gr1

+ myeloide celler kan føre til dannelsen af ​​en positiv feedback loop, med forbedret differentiering af disse myeloide præcursorceller til makrofager, samt øget mobilisering af disse celler fra knoglemarven til blodstrømmen [8]. Disse differentierede makrofager kan derefter infiltrere tumor mikromiljø og fortsætte med at udskille mere PK2, hvilket fører til øget proliferation og migration af endotelceller udtrykker PKR1 og PKR2 og dermed bidrage til øget angiogenese [8]. Ud over at stimulere endotelceller blev PK2 vist sig at påvirke cytokinproduktion i mus lymfocytter, forøgelse pro-inflammatoriske cytokiner IL-1B og IL-12 og faldende anti-inflammatoriske cytokiner IL-4 og IL-10 [9] – [10] . PK2 receptorer er også udtrykt i muse makrofager og endotelceller; følgelig PK2 kan inducere migrationen af ​​disse makrofager og påvirke dannelsen af ​​kapillære-lignende strukturer af endothelceller [10] – [13]

På grund af de vigtige roller PK2 i skabelsen af ​​en tumor mikromiljø begunstige tumor. vækst og progression, har PK2 blevet et mål for udviklingen af ​​nye behandlinger mod kræft. En række undersøgelser har overbevisende vist, at neutraliserende antistoffer mod PK2 kunne udvise en potent anti-tumor effekt på flere typer af humane cancere i musemodeller [1], [6], [8]. Disse positive resultater fra proof-of-principle type forsøg har lagt fundamentet for yderligere udvikling af anti-PK2 agenter i terapi. I denne undersøgelse rapporterer vi vores resultater på antitumoraktiviteten af ​​et syntetisk lille molekyle af PK2 antagonist, PKRA7 som kan konkurrere om bindingen af ​​PK2 til dets receptorer PKR1 og PKR2 dermed inhibere evnen hos PK2 at aktivere nedstrøms veje [ ,,,0],Zhou manuskript under udarbejdelse]. Vi valgte at teste PKRA7 i to tumortyper, glioblastom og kræft i bugspytkirtlen, der har vedvarende udstillet de værste prognoser blandt alle kræftformer på grund af mangel på effektiv terapi. De to typer af kræft display drastisk forskellige patologiske træk. Glioblastoma er yderst vaskulariseret og har udvist en vis følsomhed over for antiangiogen terapi, hvorimod bugspytkirtelkræft er ofte dårligt vaskulariseret, men yderst fibrotisk med en stor del af tumormassen bestående af stromale komponenter, herunder infiltrerede makrofager [14] – [16]. Men en fælles træk ved både glioblastom og kræft i bugspytkirtlen er inddragelse af myeloide celler [17] – [20]. Vi håbede at bestemme, om PKRA7 kunne have en indvirkning på tumorvækst gennem sin hæmmende effekt på myeloide celler. I overensstemmelse med denne postulat, vores resultater viser klart, at PKRA7 besidder en stærk antitumoraktivitet for begge typer af kræft, selv gennem forskellige mekanismer. Desuden er vores undersøgelse viser, at PKRA7 har potentiale til at blive en del af kombinationsbehandlinger med standardbehandling i øjeblikket anvendes i klinikken, og dette stof lover til yderligere udvikling til behandling af de kræftformer, der i øjeblikket har meget dårlig prognose.

Resultater

PKRA7 Undertrykker tumorvækst i Nude (nu /nu) mus xenograftmodel af glioblastoma gennem hæmning af angiogenese

Selv om en anti-PK2 neutraliserende antistof blev fundet ved tidligere undersøgelser at vise anti tumoraktivitet, udforskede vi muligheden for, at der kan udvikles små molekyler for at opnå den samme anti-tumor effekt med lavere omkostninger og nemmere levering. Efter biokemisk at definere den molekylære natur af interaktioner mellem PK2 og dets receptorer [21] har vi fastslået hexapeptidet aminosyresekvensen AVTIGA i N-terminalen af ​​PK2 er fuldstændig talte blandt pattedyr og ikke-pattedyr arter og er kritisk for aktivering PKR1 og PKR2 [22]. Mutationer i denne region, herunder en A1M (alanin til methionin) substitution eller addition af methionin til N-terminalen viste stærk antagonistaktivitet i nærvær af både PKR1 og PKR2 stabilt udtrykt på kinesisk hamster ovarie (CHO) celler [22]. Efter denne indledende opdagelse har vi syntetiseret over 200 forbindelser med små molekyler, der strukturelt efterligner PK2 N-terminale region mutante peptider og testet deres evne til kompetitivt at inhibere aktiveringen af ​​PK2 receptorer. Fra denne indledende screening, fandt vi over 60 vandopløselige forbindelser, som udviser inhiberende virkning på PK2-receptor-interaktion med bindingskonstant under 20 nM (Zhou, manuskript under udarbejdelse). Vi har valgt forbindelse PKRA7 for vore forsøg, fordi det kraftigt kunne inhibere PK2 receptorer, med IC50-værdier på 5,0 og 8,2 nM for PKR1 og PKR2 henholdsvis (fig S1), og, endnu vigtigere, det kunne gennemtrænge blod-hjerne-barrieren, en funktion, der kan være afgørende for behandling af glioblastom.

for at undersøge

in vivo

effekt af PKRA7 på glioblastom tumorvækst, vi først genereret subkutane menneskelige glioblastom tumorxenoplantater i nøgne mus. 5 × 10

4 D456MG gliomceller blev implanteret i ti nøgne mus subkutant og musene blev adskilt i to behandlingsgrupper 14 dage efter implantation. Musene i den første gruppe modtog en intraperitoneal (IP) kontrol behandling af PEG400 (polyethylenglycol) fortyndet 1:10 i PBS, mens den anden gruppe af mus modtog IP-injektioner af PKRA7 i den samme opløsning i en dosis på 20 mg /kg /dag. Tumorstørrelser blev overvåget hver tredje dag og vækstkurver blev dannet (figur 1A). 30 dage efter implantation, blev tumorerne isoleret efter musene blev aflivet og vejet (figur 1B). Mus behandlet med PKRA7 viste et klart fald i både D456MG tumorvæksthastighed og tumorvægt. For at bestemme den mekanisme, hvormed PKRA7 inhiberede xenograft tumorvækst, målte vi potentielle ændringer i blodkar tæthed og graden af ​​nekrose i D456MG tumorer behandlet eller ubehandlet med denne forbindelse. Som vist i figur 1C-F, blev en mærkbar nedgang i relativ blodkar massefylde og en betydelig stigning i områder af nekrotiske områder af PKRA7-behandlede tumorer observeret i sammenligning med kontroller, hvilket antyder, at PKRA7 kan undertrykke tumordannelse primært ved at hæmme angiogenese gennem PKR1 og PKR2 udtrykt på endotelceller på en lignende måde som de PK2-neutrolizing antistoffer [8], [12] – [13].

(a) D456MG celler blev SC injiceret i nøgne mus, og kontrol ( n = 5) eller PKRA7 (n = 5) behandlingen blev påbegyndt, da tumorer blev synlige (14 dage). Målinger blev taget hver 2-3 dage. (B) Gennemsnit tumorvægt af kontrol og PKRA7-behandlede mus tumorer efter fjernelse. (C) IHC farvning hjælp CD34 endotelceller markør i D456MG SC tumorer fra mus behandlet med kontrol eller PKRA7. (D) Akkumuleret sandsynlighed for fartøj vægtfylde målt ved CD34 farvning. Kartæthed af tumorer faldt med PKRA7 behandling. (E) Repræsentative billeder af H & E-farvning af snit fra kontrol- og PKRA7-behandlede SC tumorer (F) Kvantificering af nekrotiske regioner fra 5 lysbilleder af hver tumor pr behandlingsgruppe, procentdele af nekrotiske områder blev målt ved ImageJ (* p ≤ 0,05 ). (G) 1 × 10

4 D456MG celler blev IC injiceret i nøgne mus og behandling begyndte 7 dage efter tumorimplantation. Mus i kontrol (n = 8) eller PKRA7 behandling (n = 9) gruppe blev aflivet, når de udviklede alvorlige neurologiske fænotype indikerer tumorvækst intrakranialt.

Baseret på disse lovende resultater med undertrykkelsen af ​​subkutan tumordannelse ved PKRA7 anvendte vi intrakraniel inokulering af gliomaceller at vurdere evnen af ​​PKRA7 at inhibere tumorvækst i en patologisk relevante indstilling. Denne gang, behandlingen begyndte 7 dage efter 1 × 10

4 D456MG gliom celleinokulering med daglige IP injektioner af PKRA7 eller vehikelkontrol. Mus blev aflivet, når neurologiske tegn på voksende tumorbyrde blev klart og datoerne blev registreret til at generere en Kaplan-Meier-kurve (figur 1G). I dette assay behandling med PKRA7 mærkbart forlænget indtræden af ​​neurologiske tegn på tumorbelastning (gennemsnitlig overlevelse på 38,4 dage versus 34,1 dage for PKRA7 og kontrol, henholdsvis p ≤ 0,05), hvilket indikerer, at PKRA7 var effektiv til inhibering af tumorvækst i intrakraniel miljø. Lignende resultater blev opnået med en anden glioma cellelinie som for D456G celler (data ikke vist).

PKRA7 Undertrykker tumorvækst i nøgne (nu /nu) mus xenograftmodel af pancreascancer gennem hæmning af makrofaginfiltration

Vi næste testede, om PKRA7 kan have en indvirkning på xenotransplantat væksten af ​​humane pancreatiske cancerceller på grund af den veletablerede rolle myeloide celler i dannelsen af ​​pancreascancer. 5 × 10

5 aspC-1-celler blev inokuleret i nøgne mus subkutant og behandlingen begyndte 7 dage efter implantation efter samme procedure som med D456MG gliomaceller. Som vist i figur 2A, blev væksthastighed aspC-1-celler undertrykt af PKRA7, hvilket resulterer i en signifikant reduktion i den gennemsnitlige vægt af tumorerne (figur 2B). Lignende resultater blev opnået, når en anden human pankreatisk cancercellelinie, CFPac-1, blev anvendt i stedet for aspC-1-celler (figur S2).

(A) aspC-1-celler var SC injiceret i nøgne mus og kontrol (n = 4) eller PKRA7 (n = 5) behandlingen blev påbegyndt, da tumorer blev synlige (9 dage). Målinger blev taget hver 2-3 dage. (B) Gennemsnit tumorvægt af kontrol og PKRA7-behandlede mus tumorer efter fjernelse (* p ≤ 0,05). (C) Repræsentant H & E glider fra kontrol og PKRA7 behandlede tumorer. (D) Kvantificering af nekrotiske regioner fra 5 lysbilleder af hver tumor pr behandlingsgruppe blev procentdele af nekrotiske områder målt ved ImageJ (p = 0,205719). (E) IHC farvning hjælp F4 /80 mus makrofag markør for aspC-1 SC tumorer behandlet med kontrol eller PKRA7. (F) Kvantificering af gennemsnitlig makrofag infiltration af aspC-1-tumorer behandlet med kontrol (n = 4) eller PKRA7 (n = 5), 5 lysbilleder af hver tumor pr behandlingsgruppe (* p ≤ 0,05).

for at bestemme den potentielle mekanisme ligger til grund for væsentlig reduktion i tumorvækst grund PKRA7 behandling, vi undersøgte tumor sektioner for tegn på ændringer i angiogenese og nekrose. Der var ingen forskel i tætheden af ​​blodkar selvom der var færre fartøjer pr synsfelt observeret sammenlignet med glioblastom sektioner (data ikke vist) og tilsvarende niveauer af nekrose blev observeret for tumorerne afledt fra behandlede og kontrolmus (figur 2C, D). I modsætning hertil var der et betydeligt fald i antallet af makrofager infiltreret i tumorerne isoleret fra PKRA7-behandlede mus som målt ved farvning intensitet af muse makrofag markør F4 /80 (fig 2E, F). Disse resultater antyder kraftigt, at PKRA7 kunne inhibere pancreas tumorvækst via en anden mekanisme ved at blokere PKR1- og PKR2-udtrykkende makrofager infiltrerer ind i tumormikromiljøet snarere end at undertrykke angiogenese, en observation i overensstemmelse med de fænotypiske egenskaber af human pancreascancer så dårligt vaskulariseret, men udstiller rigelige desmoplastiske fibrose og indeholder stort antal infiltrerede myeloide celler, herunder makrofager [10], [15].

PKRA7 Hæmmer endotel Cell Kapillær forgrening og myeloid Cell Migration

resultaterne fra

in vivo

xenografundersøgelser af menneskelig gliom og bugspytkirtelkræftceller støttede kraftigt den opfattelse, at den anti-tumor aktivitet PKRA7 kunne være medieret via to meget forskellige mekanismer. For at undersøge dette yderligere på celleniveau, gennemførte vi

in vitro

analyser at evaluere virkningerne af PKRA7 på den angiogene aktivitet af endotelceller, såvel som den vandrende evne af myeloide celler. For at bestemme om PKRA7 påvirker evnen af ​​endotelceller til dannelse af kapillarrør-lignende netværk som en vigtig indikator for angiogenese [23] anvendte vi immortaliserede humane mikrovaskulære endotelceller (IHMVECs). Cellerne blev behandlet med 200 ng /ml rekombinant PK2 alene eller PK2 plus 1 ug /ml PKRA7 og udpladet på et tyndt lag Matrigel. Denne koncentration af PKRA7 blev brugt i vores

in vitro

eksperimenter, fordi det er tæt på koncentrationen af ​​PKRA7 i kredsløbet af mus fra vores

in vivo

eksperimenter, mens de resterende ikke-giftige for celler i vævskultur (data ikke vist). Som vist i figur 3A, PKRA7 inhiberes effektivt PK2-induceret kapillær forgrening som målt ved antallet af forbindelser mellem celler, men havde ingen virkning på VEGFA-induceret kapillær forgrening (kvantificering præsenteret i figur 3B). Identiske resultater blev opnået under anvendelse af to yderligere endotheliale cellelinier: muse embryonale endothelceller og primære humane mikrovaskulære endotelceller (data ikke vist). Specificiteten af ​​anti-PK2 aktivitet i denne analyse blev yderligere bekræftet af demonstration af en lignende effekt af anti-PK2 polyklonalt antiserum (figur S3 og data ikke vist). Taget sammen antyder disse resultater, at PKRA7 specifikt kan inhibere den angiogene virkning af PK2 på endotelceller.

(A) IHMVECs blev udpladet på Matrigel i angivne behandlingsgrupper. Repræsentative fotografierne blev taget på 8 timer efter plating. (B) Gennemsnitligt antal forbindelser mellem cellerne blev talt og analyseret. Resultaterne er normaliserede data fra 3 uafhængige eksperimenter. Tilsætning af PKRA7 signifikant blokerer PK2-induceret kapillær forgrening (* p ≤ 0,05). (C) 1 x 10

5 THP-1-celler på toppen kammer transbrøndene fik lov til at migrere i 4 timer. Celler blev fikseret, farvet og antallet af celler pr synsfelt tælles. Resultaterne er de normaliserede gennemsnit af 3 uafhængige eksperimenter. Tilsætning af PKRA7 signifikant blokeret PK2-induceret monocyt migration (* p ≤ 0,05). (D) 7,5 x 10

4 RAW264.7 celler på øverste kammer af transbrøndene fik lov til at migrere i 18 timer. Celler blev fikseret, farvet og antallet af celler pr synsfelt tælles. Resultaterne er de normaliserede gennemsnit af 3 uafhængige eksperimenter. Tilsætning af PKRA7 signifikant blokeret PK2-induceret makrofag migration (* p ≤ 0,05). (E) Gennemsnitlig målte luminescens af tumorstedet efter IP-injektion af luciferase-mærket RAW celler i kontrol (n = 4) eller PKRA7 (n = 4) behandlede mus med SC aspC-1 tumorer 30 dage efter implantation. Gennemsnitlige samlede luciferase tællinger var lavere i mus behandlet med PKRA7 i forhold til kontrol (* p ≤ 0,05). (F) qPCR assay at måle effekten af ​​PKRA7 på ekspressionen af ​​chemokiner og chemokinreceptorer, der blev identificeret at blive induceret af PK2 behandling. Data om mRNA niveauspring blev vist som log2 af Ct værdiændringer. PKRA7 hæmmer opregulering af CCL27, CCR10, CCR4, CCR5, og CCR6 (* p ≤ 0,05).

For at bestemme virkningen af ​​PKRA7 på PK2-induceret migrering af myeloide celler, vi ansat den menneskelige monocyt THP-1 under anvendelse af en transwell migration assay. Som vist i figur 3C, 1 ug /ml PKRA7 effektivt svækkede PK2-inducerede migration af THP-1-celler, men ikke migrationen af ​​disse celler mod CCL2 eller monocyt kemotaktiske protein 1 (MCP-1), en kendt kemoattraktant af THP -1 [24] – [25]. Næsten identiske resultater blev observeret med musen makrofag cellelinie RAW264.7 med PKRA7 specifik blokering PK2-induceret migration, men ikke migration induceret af CXCL12, her benævnt SDF-1α (figur 3D). Derfor PKRA7 specifikt hæmmer PK2-induceret migrering af myeloide celler fra både humane og murine oprindelse.

For at vurdere virkningen af ​​PKRA7 om migration /infiltration af muse makrofager i mikromiljø xenotransplantattumorer dannet af humane bugspytkirtelkræftceller målte vi akkumulering i tumorerne af luciferase-mærkede RAW264.7 makrofagceller 24 timer efter deres IP injektion i nøgne mus 30 dage efter subkutan implantation af aspC-1 cancerceller. Som vist i figur 3E, blev et signifikant fald i luminescerende signal, der udsendes af muse makrofagceller observeret hos mus behandlet med PKRA7 sammenlignet med den for kontrolmusene. Disse resultater indikerer, at PKRA7 er i stand til at blokere makrofag migration /infiltration i tumorstedet i en

in vivo

indstilling, således inhiberer evnen hos makrofager til at bidrage positivt til væksten af ​​xenograft-tumorer.

for yderligere at undersøge den mekanisme, hvormed PKRA7 blokerer PK2-induceret makrofag migration, vi udførte et cytokin array ved hjælp kvantitativ-real time PCR på THP-1 celler, der blev induceret til at differentiere til makrofagceller. Blandt adskillige af 95 humane kemokin /cytokin-ligander og deres receptorer, fem viste en signifikant induktion i deres ekspression efter behandling med PK2 herunder CCL27, CCR10, CCR4, CCR5, og CCR6 (fig S4). Vigtigere, mindst fire af disse inducerede molekyler vides at være involveret i at øge migrationen af ​​myeloide celler og alle deres induktion ved PK2 blev gjort stump ved PKRA7 (figur 3F), hvilket kraftigt antyder, at undertrykkelse af PK2-induceret produktion af disse kemokiner og receptorer ligger til grund for primære mekanisme af anti-tumor aktivitet PKRA7 i forbindelse med kræft i bugspytkirtlen.

PKRA7 Forbedrer Effekt af standardbehandling for glioblastoma og kræft i bugspytkirtlen i xenograftmodeller

Selvom PKRA7 vises stærke anti-tumor aktiviteter i sammenhænge både glioblastom og kræft i bugspytkirtlen, er det usandsynligt, skal udvikles til et terapeutisk middel anvendes alene. For at teste om PKRA7 kunne øge effektiviteten af ​​standard kemoterapeutisk behandling for glioblastom, undersøgte vi virkningen af ​​denne forbindelse i kombination med temozolomid, der aktuelt anvendes i klinikken for denne sygdom [26] – [27]. Efter en etableret eksperimentel procedure til evaluering af effekten af ​​kombinatoriske terapi i xenograft musemodeller [28] – [29], 1 x 10

4 D456MG celler blev implanteret intrakranialt og efterfulgt af behandling med 10 mg /kg temozolomid i fem dage, og derefter med eller uden PKRA7 administration i de resterende dage af forsøgene. Som vist i figur 4A, behandling med både temozolomid og PKRA7 forlænget indtræden af ​​neurologiske tegn på tumorbyrde sammenlignet med mus, der modtager kontrol, temozolomid eller PKRA7 alene, hvilket indikerer en forøget effekt af multikombinerbare behandling med midlerne til inhibering intrakraniel gliom vækst i nøgne mus (gennemsnitlig overlevelse 49,8 dage for PKRA7 plus temozolomid vs 44,6 dage for enten temozolomid eller PKRA7 alene vs 38,6 dage for kontrol).

(A) Kaplan-Meier kurve af nøgne mus efter temozolomid og PKRA7 behandling efter IC injektion 1 × 10

4 D456MG celler. Behandling med 10 mg /kg temozolomid eller kontrol startet 3 dage efter IC injektion for i alt 5 på hinanden følgende daglige behandlinger. Behandling med PKRA7 eller kontrol startet 7 dage efter IC injektion og fortsatte under hele forsøget. 5 mus pr stand. (B) aspC-1-celler var SC injiceret i nøgne mus, og kontrol (n = 10) eller PKRA7 (n = 10) behandlingen blev påbegyndt, når tumorerne var synlige (7 dage). Behandling med 100 mg /kg gemcitabin (n = 10) eller kontrol (n = 10) startet 7 dage efter tumorimplantation, og administreret hver 4. dag i to uger for i alt 4 behandlinger (#). Målinger blev taget hver 3. dag. 5 mus pr stand. (C) Gennemsnitlig tumor vægt af kontrol, gemcitabin, PKRA7 og gemcitabin plus PKRA7-behandlede mus tumorer efter fjernelse (* p ≤ 0,05).

For kræft i bugspytkirtlen, gemcitabin er en af ​​de vigtigste kemoterapeutiske midler, der anvendes i klinikken, og det blev testet tidligere i kombinationsterapi studier involverer aspC-1-celler [30]. I vores eksperimenter, 5 × 10

5 aspC-1-celler blev subkutant implanteret i nøgne mus, der blev behandlet med PKRA7 og gemcitabin (100 mg /kg) 7 dage senere. Som vist i figur 4B, er det klart, at tumorer fra mus modtog både gemcitabin og PKRA7 var betydeligt mindre end dem fra mus behandlet med kun gemcitabin eller PKRA7. Disse resultater antyder, at multikombinerbare behandling med gemcitabin og PKRA7 kunne have en stærkere antitumorvirkning end standard behandling for at reducere pancreascancer xenograft tumorvækst i vores model.

Discussion

tumorigenese er en kompleks proces, der omfatter meget mere end prolifererende tumorceller. Tumorcellerne bliver hjulpet og støttet af den omgivende tumor stroma mikromiljø, der er rig med en heterogen blanding af celler, såsom fibroblaster, endotelceller og immunceller [31]. Disse celler reagerer på signaler fra den ekspanderende tumor ved at udskille faktorer for deres egne, kan fastfryser væksten signal, remodel den ekstracellulære matrix, bidrager til angiogenese og omdirigere den rolle af immunceller. Angiogenese har længe været forstået at være en vigtig del af tumorigenese og mange undersøgelser er blevet gjort for at blokere denne proces [32]. Mens vigtige angiogene faktorer er blevet identificeret som VEGF har terapi mod VEGF signalvejen ikke vist sig at være universelt succes. Faktisk mange kræftformer er resistente over for anti-VEGF behandling eller blive resistente over for administrationen af ​​disse behandlinger, hvilket resulterer i tilbagefald, der er nogle gange mere aggressiv end den primære tumor [14], [16], [33] -. [38]

der er behov for at identificere og målrette yderligere signalveje der kan bidrage til angiogenese eller andre processer, der har vist sig at være vigtige for tumor progression såsom makrofag infiltration. PK2 og dets receptorer er en del af en signalvej involveret i myeloid celle mobilisering [8]. Flere undersøgelser har vist, at CD11

+ Gr1

+ myeloide precursorceller kan bidrage til angiogenese og tumorigenese i en række forskellige typer cancer [8], [37], [39]. Makrofager stammer fra disse precursor celler i tumor mikromiljø kan også udskiller cytokiner, der direkte påvirker tumorcellevækst. I de seneste undersøgelser har antitumoreffektiviteten af ​​et anti-PK2 antistof blevet sammenlignet med behandling med et anti-VEGF-antistof og viste sig at være næsten lige så effektive til at forebygge sygdomsprogression af en transgen musemodel af pancreas β-celle tumorigenese, mens kombinationen af ​​de to antistoffer viste en endnu mere udtalt effekt til inhibering subkutan væksten af ​​forskellige humane cancercellelinier (coloncancer, rhabdomyosarkom) og muse tumorceller (mastocytomceller, lymfom) [8], [39]. Anti-PK2 antistofbehandling reducerede også antallet af cirkulerende og tumor-infiltrerende CD11b

+ Gr1

+ myeloide celler, herunder knoglemarv-afledte makrofager, som har vist sig at mægle ikke reagerer på anti-VEGF behandlinger i flere mus xenograft tumormodeller [8], [37]. Disse undersøgelser har indikeret PK2 som en legitim mål for kræftbehandling.

antistof-baserede terapier udgør en betydelig del af optioner kræftbehandling i dagens klinikker. Men undersøgelser med patienter og musemodeller af glioblastom og bugspytkirtelkræft vist, at disse typer af kræft kan være resistente eller refraktære over for anti-VEGF signalering behandlinger [14], [16], [33], [35] – [37] . Andre undersøgelser har vist, at denne resistente reaktion kan være fælles for flere typer af kræft, såsom bryst- og tyktarmskræft [34], [40] – [41]. Patienter kan derfor drage fordel af yderligere behandlinger, der er målrettet alternative veje i kombination med anti-VEGF signalering terapier for at forhindre ildfaste svar. Således småmolekylære inhibitorer tilbyde et alternativ terapeutisk tilgang, fordi de stadig kan være specifikke for deres mål og samtidig være mere omkostningseffektivt at fremstille. Desuden er nogle lægemiddelterapier kræves til at krydse blod-hjerne-barrieren til behandling af sygdomme, såsom glioblastom og småmolekylære inhibitorer er gode kandidater til dette formål. I denne henseende vores demonstration af, at PKRA7 er i stand til at penetrere blod-hjerne-barrieren hos mus og virker til at inhibere intrakraniel xenotransplantat tumordannelse ved gliomceller viser en alternativ strategi til at inhibere tumor angiogenese via en mekanisme forskellig fra anti-VEGF siden PK2 øger angiogenese gennem sine G-protein-koblede receptor aktiveres veje [7].

desmoplastiske stroma er et karakteristisk træk ved kræft i bugspytkirtlen og kan indeholde høje niveauer af tumor-associerede makrofager (Tams), især ved den invasive forsiden af kræft i bugspytkirtlen [15], [18]. Denne infiltration af makrofager menes at bidrage til sygdomsprogression og er forbundet med dårlig prognose [18]. Nylige undersøgelser rapporterer, at immunosuppressive celler, herunder TAM’er, myeloide afledte suppressorceller (MDSCs) og regulatoriske T-celler (T

REG) blev fundet i høje niveauer i tidligt at sene stadier af forløber cancer sammenlignet med normalt væv i en musemodel af præ-invasive og invasive pancreatisk duktalt adenokarcinom [42]. PK2 kan spille en afgørende rolle i den komplekse og dynamiske forhold mellem bugspytkirtelkræftceller, og disse stromale celler gennem regulering af rekruttering og aktivitet af myeloide celler. Vi har faktisk fundet, at PK2 inducerer produktionen af ​​chemokiner og receptorer, der er involveret i vandringen af ​​myeloide celler og PKRA7 kunne blokere denne induktion (figur 3F). Kemokinreceptorerne, CCR10 og CCR4, der vides at reagere på kemo-tiltrækningsmidler CCL27, MCP-1, og CCL22, har vist sig at være kritisk i inducere mobilisering og homing af myeloide celler og leukocytter til tumorstedet [43]. Kemokinreceptoren CCR6 og dens ligand CCL20 har været impliceret i dendritisk celle migration og synes at være vigtigt for at opretholde et normalt niveau af makrofag befolkning siden CCR6

– /- mus udviste nedsat antal af makrofagceller [44]. Vore undersøgelser viste, at pancreas-tumorer er dårligt vaskulariseret og indeholder relativt få endotelceller i de ubehandlede mus og bekræftede, at eventuelle ændringer i vaskulær densitet på grund af PKR inhibering med PKRA7 i de behandlede mus sandsynligvis ville være meget lille og vanskelig at opdage.