PLoS ONE: Anti-influenza neuraminidasehæmmer Oseltamivirphosphat inducerer Canine Mammary Cancer Cell Aggressivitet

Abstrakt

Oseltamivirphosphat er en udbredt anti-influenza sialidase inhibitor. Sialylering, styret af sialyltransferaser og sialidaser, er stærkt impliceret i onkogenese og progression af brystcancer. I denne undersøgelse evaluerede vi den biologiske opførsel af hunde brysttumorceller på oseltamivirphosphat behandling (en sialidase inhibitor)

in vitro

in vivo

. Vores

in vitro

Resultaterne viste, at oseltamivirphosphat svækker sialidase aktivitet fører til øget sialylering i CMA07 og CMT-U27 hunde mamma kræftceller. Overraskende oseltamivirphosphat stimuleres, CMT-U27 cellemigration og invasion kapacitet

in vitro

, på en dosis-afhængig måde. CMT-U27 tumorer xenograft af oseltamivirphosphat-behandlede nøgne mus viste øget sialylering, nemlig α2,6 terminal strukturer og SLE (x) udtryk. Bemærkelsesværdigt, var en tendens til øget lungemetastaser observeret i oseltamivirphosphat-behandlede nøgne mus. Tilsammen vores resultater viste, at oseltamivir svækker hunde brystkræft celle sialidase aktivitet, ændre sialyleringsmønsteret af hunde brystkirtler tumorer, og førende overraskende til

in vitro

in vivo

øget mamma tumor aggressivitet

Henvisning:. de Oliveira JT, Santos aL, Gomes C, Barros R, Ribeiro C, Mendes N, et al. (2015) Anti-influenza neuraminidasehæmmer Oseltamivirphosphat inducerer Canine Mammary Cancer Cell Aggressivitet. PLoS ONE 10 (4): e0121590. doi: 10,1371 /journal.pone.0121590

Academic Redaktør: David Wai Chan, The University of Hong Kong, HONG KONG

Modtaget: 12. september 2014 Accepteret: 13 Februar 2015; Udgivet: April 7, 2015

Copyright: © 2015 de Oliveira et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af den portugisiske organ “Fundação para a Ciência ea Tecnologia, Programa Operacional Ciência e Inovação 2010 (POCI 2010) gøre Quadro Comunitario de Apoio III “og Project giver ingen. PTDC /CVT /117.610 /2010. RB (SFRH /BPD /68276/2010) og CG (SFRH /BPD /96510/2013) anerkender den portugisiske Foundation for Science and Technology. Institut for Molekylær Patologi og Immunologi er en Associate Laboratory af det portugisiske ministerium for Ministeriet for Videnskab, teknologi og videregående uddannelse og er delvist støttet af den portugisiske Foundation for Videnskab og Teknologi

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklæret, at ingen konkurrerende interesser eksisterer.

Introduktion

Kræft er fortsat en stor social og økonomisk byrde i den vestlige verden. Trods alle bestræbelser på at reducere en sådan lidelse, at antallet af patienter har været stigende eksponentielt i de seneste par år. Brystkræft i særdeleshed er den mest almindelige kræftform hos kvinder, og den hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald, hovedsagelig som følge af udviklingen af ​​fjernmetastaser [1].

De mekanismer, der er involveret i etableringen af ​​kræft kolonier i fjerntliggende organer langt fra er forstået, så er de faktiske årsager, som fører til metastase-relaterede dødsfald. Således at identificere og undersøge i øjeblikket klinisk anvendte lægemidler, som kan have en indvirkning på tumorprogression er obligatorisk [2]. For eksempel ved at interferere med mange celle mekanismer, som er fælles eller ens mellem patogener og værter, lægemidler såsom rapamycin og niclosamid (som oprindeligt blev anvendt som antifungale og antihelmintic lægemidler henholdsvis) har vist sig at være lovende anticancermidler [3, 4] .

Oseltamivirphosphat er en anti-influenza stof, der er blevet meget anvendt som profylaktisk behandling, da tidspunktet for de H1N1 pandemier [5]. Det indgives som prodruget oseltamivirphosphat, som omdannes med carboxyl esteraseenzymer til det aktive oseltamivircarboxylat. Oseltamivirphosphat er en sialinsyre analog, som interagerer med og blokerer de aktive steder af sialidase enzymer af influenzavirus, det binder til virus enzymer, blokerer deres evne til at spalte sialinsyrerester på overfladen af ​​den inficerede celle, hvilket resulterer i en manglende evne at frigive afkomsvirioner [6].

Nogle forslag er tidligere blevet gjort med hensyn potentielt relevante farmakologiske virkninger af denne og andre hæmmere af virale sialidaser anvendes i klinikker, i humane endogene sialidaser [7]. Mens koncentrationer lave nanomolære af oseltamivircarboxylat er tilstrækkelig til at blokere aktiviteten af ​​virale sialidaser, dette stof demonstrerede næsten ingen mærkbar inhibering af humane sialidaser [7, 8]. Ikke desto mindre blev modstridende resultater opnået, når oseltamivirphosphat blev testet i kræftceller ved hjælp af både

in vitro

in vivo

modeller [9, 10]. Faktisk nogle bemærkninger påpegede en mulig hæmmende effekt af oseltamivirphosphat på endogene sialidaser af rotter og mus [11-14]. For nylig blev det foreslået, at oseltamivirphosphat havde evnen til at vende epitel til mesenkymale (EMT) omstillingsprocessen og øge lægemiddelfølsomhed af kemoterapi humane cancerceller [10].

sialylerede glycaner er epidemiologisk forbundet med dårligere prognose i forskellige typer af cancer, herunder brystcancer [15]. Sialinsyrer er sure monosaccharider normalt findes i den terminale position af kulhydratkæder til stede i glycoproteiner og glycolipider [16]. Gennem komplekse interaktioner med selectiner og siglecs blandt andre molekyler, sialinsyrer er fysiologisk til stede i forskellige typer af celle-celle-interaktioner. Sialinsyrer øge styrken af ​​ladningstæthed på hele glycankæden, på grund af tilstedeværelsen af ​​deres carboxylsyredel, associere til ændringer i glycaner ‘adhæsionsegenskaber [17]. Sialinsyrer overføres fra en donor substrat til en glycan struktur til stede på en given glycokonjugat af sialyltransferaser [18, 19]. På den anden side er deres fjernelse fra glycankæder katalyseret af sialidaser. Aktiviteten af ​​disse enzymer menes at påvirke kropsbygning af glycoproteiner, og dermed bidrage til enten øget anerkendelse eller maskering af biologisk relevante steder i molekyler og celler [20].

Stigningen i sialylerede Lewis-type blod gruppe antigener, såsom Sialyl Lewis X (SLE (x)) og mindre trunkerede glycaner såsom Sialyl Tn (STN) er blandt de mest almindelige glycan ændringer i cancerceller [21-24]. Flere funktionelle assays, hvor sialylerede glycaner er vist at spille en rolle i øget migration og invasion både

in vitro

in vivo

findes i litteraturen [19, 24]. På den anden side, manipulation med sialylering

in vitro

er også blevet vist t undertiden reducere invasive kapacitet af cancerceller [25]. Som følge heraf er modulering af sialylerede glycaner blevet anbefalet som et formodet mål for neo-adjuverende behandling i cancer [26]. Men på grund af den brede vifte og kompleksiteten af ​​sialyltransferaser og alle andre glycosyltransferaser involveret i sialylering proces, der er velkendt vanskeligheder med at dreje sialinsyrer i klinisk relevante terapeutiske mål [27, 28]. Men selv om der er mere end 20 kendte forskellige sialyltransferaser, der er kun fire identificeret og karakteriseret mammale sialidaser [20]. Interessant alle fire kendte mammale sialidaser er homologe til de af vira indeholdende, i nogle tilfælde, rester er identiske med dem, der findes i det aktive enzymatiske sted [29].

Der er således et presserende behov for at studere neoplastiske sammenhænge i som oseltamivirphosphat kompetitivt kunne hæmme pattedyr sialidaser [30]. Forskellige resultater kan forventes at opstå, og kan afhænge af målet for hæmning stede, og den vifte af berørte glycokonjugater [20]. I dette arbejde har vi undersøgt effekten af ​​sialidase hæmning som modulator af sialylering-relaterede mekanismer invasion i mamma celletumorer hjælp både

in vitro

in vivo

tilgange.

Materiale og metoder

cellelinjer og dyrkningsbetingelser

for at vurdere eventuelle forskelle i oseltamivirphosphat behandling i benigne og maligne cellelinjer blev to brystkirtler cellelinjer anvendt i denne undersøgelse: en adenom-afledte cellelinje (CMA07 etableret på vores laboratorium fra et spontant forekommende hunde kompleks adenom skåret fra en 6 år gammel kvinde hund til helbredende formål med ejere samtykke [31]) og et karcinom-afledt cellelinje (CMT-U27 – meget metastatisk hunde karcinom cellelinje, venligst stillet til rådighed af professor Eva Héllmen, fra Sverige [32]). De to cellelinier blev dyrket ved 37 ° C i en fugtig 5% CO

2 inkubator (Thermo Scientific) og opretholdt i RPMI 1640 medium med Glutamax og 25 mM Hepes (Gibco Life Technologies) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) (Gibco Life Technologies) og 1% Penicillin streptomycin (P /S) (Gibco Life Technologies).

Sialidase aktivitetsassay

Højere forventes sialylering niveauer i maligne celler sammenlignet med godartede modstykker. Dette er så tilbøjelige til at være afhængig af aktiviteten både sialyltranferases og sialidase [17]. For at evaluere effekten af ​​oseltamivirphosphat på aktiviteten af ​​sialidaser, en

in vitro

assay anvendelse af en modificeret sialinsyre (4-methyl-umbelliferyl-Nacetylneuraminic acid-4-Muñana), blev udført under anvendelse CMA07 og CMT u27 canine brysttumorceller. Sialidase aktivitet blev bestemt ved at opnå den metaboliske omdannelse af sialinsyre analog, 4-Muñana, ind i fluorescerende forbindelse methyl-umbelliferon (blå farve), efter behandling med forskellige doser af oseltamivirphosphat. Celler blev dyrket i 12 mm cirkulære glas indtil sammenløb og inkuberes derefter i 24 timer med medium, der indeholder forskellige oseltamivir fosfat koncentrationer (0,305 pM, 3,05 pM, 30,5 m og 305 uM oseltamivir fosfat opløst i PBS), og køretøjets af lægemidlet (PBS ) blev anvendt som kontrol. Efter 24 timers behandling blev hver 12 mm cirkulære glas anbringes på et objektglas og inkuberet i en 2 uM 4-Muñana (2 ‘- (4-methylumbelliferyl) -α-DN-acetylneuraminsyre) (Sigma, Saint Louis, USA) -opløsning . Objektglas blev straks observeret med epi-fluorescensmikroskopi under UV-lys (excitation bølgelængde ved 360 nm, og emission bølgelængde ved 440 nm), som tidligere beskrevet [33]. Slides blev analyseret og billeder blev taget med et Carl Zeiss fluorescerende mikroskop (Carl Zeiss Microscopy).

Cell morfologi analyse

CMA07 og CMT-U27 celler blev udsået med en tæthed på 1×10

4 celler per brønd i plader med 6 brønde i tre eksemplarer. Tre forskellige oseltamivirphosphat koncentrationer blev undersøgt: 0,305 pM, 3,05 pM og 30,5 pM, og PBS blev anvendt som kontrol. Analyse af cellekonfluens og morfologi blev udført under anvendelse af en kontrast omvendt mikroskop over en periode på 7 dage. Fotografier blev taget på dag 0 og 7 under 200x forstørrelse

Cell proliferation assay

CMA07 og CMT-U27 celler blev dyrket i 24-brønds plader i tre eksemplarer for hver betingelse:. 0,305 pM, 3,05 uM, 30,5 uM og 305 uM oseltamivirphosphat og PBS blev anvendt som kontrol. Celler blev talt hver dag i 7 dage i en Neubauer kammer i en 1: 2 fortynding af celler i 0,4% trypanblåt og celletælling blev udført under anvendelse af lydstyrken omregningsfaktoren for 1 mm3, som er 1×10

4. Denne analyse blev gentaget 3 gange og vækstkurver blev sporet.

Cell vækst assay

Cell vækst blev bestemt i CMA07 og CMT-U27 cellelinjer ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt kit CellTiter 96 vandig One Solution reagens (Promega Corporation), og udført ifølge producentens anvisninger. Kort beskrevet blev celler udpladet i plader med 96 brønde i tre eksemplarer (Orange Scientific), med en densitet på 5×10

3 celler pr. Efter cellebinding blev oseltamivirphosphat tilsat ved 0,305 pM, 3,05 pM, 30,5 uM og 305 uM slutkoncentrationer og PBS blev anvendt som kontrol. Cellulær metabolisme blev målt ved tilsætning MTS tetrazolium reagens og absorbansen blev registreret ved 490 nm. Målinger blev udført ved 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24 og 48 timer. En yderligere måling kontrol blev udført ved tid-punkt 0h, i en kultur godt uden celler. blev udført forsøgene to gange.

TUNEL assay

CMA07 og CMT-U27 cellelinjer blev dyrket i plader med 6 brønde og derefter behandlet med forskellige koncentrationer af oseltamivirphosphat (0,305 pM, 3,05 pM, 30,5 uM og 305 uM, og PBS blev anvendt som kontrol). Efter 24 timers behandling, dyrkningsmedium og tripsinized celler blev opsamlet og centrifugeret i 10 minutter ved 2000 rpm. Celler blev vasket i PBS og fikseret i kold methanol i 20 minutter. Efter fiksering blev celler ressuspended i 1 ml PBS for cytospin procedure. Kort fortalt blev 100 pi cellesuspension centrifugeres i en centrifuge cytospin3 hjælp polylysin belagt objektglas. Objektglas blev derefter brugt til

in situ

celledød påvisning ved et kommercielt tilgængeligt kit (

In situ

celledød afsløring kit, fluorescein fra Roche) baseret på mærkning DNA dobbelt strengbrud (TUNEL teknologi) ifølge producentens instruktioner. Objektglas blev observeret under et fluorescensmikroskop ved anvendelse af en 488 nm excitationsbølgelængde og procentdelen af ​​døde celler blev beregnet ved at registrere positive TUNEL celler i forhold til de samlede celler ved anvendelse af ImageJ software. Dette assay blev udført to gange.

sårheling

sårhelende assay blev udført under anvendelse af en godartet (CMA07) og en højt metastatisk (CMT-U27) hunde brysttumor-cellelinje i et Time-lapse mikroskop. Kort fortalt blev 20×10

4 celler udpladet på en 24-brønds kulturplade og efter at have nået høj konfluens en kunstig “sår” blev foretaget med en pipettespids. Dyrkningsmediet blev udskiftet med de forskellige oseltamivirphosphat koncentrationer: 0,305 pM, 3,05 pM og 30,5 pM oseltamivirphosphat og PBS som kontrol. Viklet erhvervelse billede blev udført med 5 minutters intervaller i 48 timer, ved anvendelse af programmet Axio Vision Frigivelse 4.8.2. og konverteres i video. Behandling af celler med 305 pM oseltamivirphosphat blev ikke udført på grund af sin tidligere vist cytotoksicitet. Dette assay blev udført to gange.

Matrigel Invasion Assay

En matrigel invasion assay blev udført for at evaluere den invasive kapacitet CMT-U27-celler, en god model til at studere celle invasion [34]. Matrigel inserts blev re-hydreret med RPMI 1640 i 1 time ved 37 ° C i en fugtig 5% CO2 inkubator (Thermo Scientific). Medierne var de samme i de øverste og de nederste brønde (RPMI 1640 medium suppleret med 10% FBS og 1% af penicillin og streptimicin).

Efter insert rehydrering, 1×10

5-celler blev podet på Matrigelcoatede kamre i nærvær af forskellige oseltamivirphosphat koncentrationer (0,305 uM, 3,05 uM, 30,5 uM oseltamivirphosphat) og PBS som kontrol, og opretholdt i kultur i yderligere 6 timer (tidligere optimerede tidspunkt for invasion assays under anvendelse denne cellelinie ). Lægemidlet blev anvendt i de øverste brønde. Efter inkubering blev indholdet af hver indsats fjernes og vaskes to gange med PBS for at fjerne ikke-invaderende celler. Invasive celler blev fikseret med kold methanol i 20 minutter, blev indsatse overført til dias (Industriel kvalitet) og monteret med Vectashield montering medium med DAPI (Vector Laboratories). Invaderende celler blev registreret ved at tælle antallet af celler til stede i indsatsen. Disse eksperimenter blev udført 3 gange.

Fluorescerende cytokemi

Celler blev dyrket i dækglas og dyrkningsmediet blev suppleret med 0,305 pM, 3,05 pM og 30,5 pM oseltamivirphosphat og PBS som kontrol, for 24 timer. Celler blev derefter vasket med PBS og fikseret med kold methanol i 20 minutter. Efter fiksering blev celler rehydratiseres med PBS og blokeret med 10% BSA i 20 minutter. Plant lektiner SNA (Biotinyleret hyldebær bark lektin, B-1305, Vector Laboratories), MAL I (Biotinyleret Amur-Maackia lektin I, B-1315, Vector Laboratories), og MAL II (Biotinyleret Amur-Maackia lektin II, B-1265, Vector Laboratories ) blev fortyndet 1: 300 i 5% BSA i PBS og inkuberet på objektglas i 1 time ved stuetemperatur. Objektglas blev derefter vasket tre gange med PBS og inkuberet 1 time med streptavidin-FITC. Efter to gange vask med PBS blev objektglassene inkuberet i 10 minutter med DAPI (Sigma-Aldrich) i PBS og objektglas blev monteret i Vectashield mounting medium (Vector Laboratories) til fluorescens-analyse. Slides blev analyseret og billeder blev taget i et Carl Zeiss fluorescerende mikroskop (Carl Zeiss Microscopy).

Western Blot-analyse

Celler fra CMA07 og CMT-U27 cellelinier blev dyrket til sammenflydning i 6 godt -plates og forskellige koncentrationer af oseltamivirphosphat blev tilsat til mediet (0,305 pM, 3,05 pM og 30,5 pM oseltamivirphosphat). Efter 24 timers inkubation blev cellerne vasket tre gange med PBS og lyseret under anvendelse af RIPA lysebuffer (50 mM Tris HCI, pH 8; 150 mM NaCl; 1% NP-40; 0,5% natrium desoxicolate; 0,1% SDS ) indeholdende komplet proteaseinhibitorcocktail (Roche), 1 mM PMSF (phenylmethylsulfonylfluorid), og 1 mM Na

3VO

4 (natriumorthovanadat). Proteinkoncentration blev bestemt ved anvendelse af biocinchoninic syre metode fra Pierce BCA Protein Assay Kit (Pierce /Thermo Scientific), ifølge producentens instruktioner.

De samlede proteinekstrakter blev løst i 10% SDS-PAGE, overført til en nitrocellulose membran (Amersham Biosciences /GE Healthcare Life Sciences) og inkuberet med forskellige biotinylatedlectins: MAL I (B-1315, Vector Laboratories), MAL II (B-1265, Vector Laboratories) og SNA (B-1305, Vector Laboratories) fortyndet 1 : 500 i 5% BSA (Sigma-Aldrich) i PBS med 0,05% Tween-20 (Sigma-Aldrich, USA). Efter vask med PBS 0,05% Tween-20 blev membranerne inkuberet med avidin-biotin-peroxidase-kompleks kit (Vectastain ABC kit Standard, Vector Laboratories) i 1 time ved stuetemperatur. For SLE (x) og STN-analyse blev membraner inkuberet med monoklonale antistoffer fra mus, KM93 (Millipore) fortyndet 1: 500 og TKH2 (forsigtigt tilbydes af Dr. H. Clausen fra Danmark), efterfulgt af inkubation med et HRP-konjugeret anti-muse sekundært antistof i 1 time. Analysen blev udført ved kemiluminescens under anvendelse af ECL Western blotting påvisningsreagens og film (begge fra GE Healthcare). Western blot for actin fortyndet 1: 4000 (Santa Cruz Biotechnology) blev anvendt som ladningskontrol

2D-gelelektroforese

Forskelle i individuelle proteiner er vanskelige at visualisere anvendelse af standard Western blot-analyse.. Forsøger at overvinde dette, har vi udført en 2D-geler analyse, som bedre diskriminerer protein glycoformer i proteinekstrakter. Proteinprøver fra CMA07 og CMT-U27-celler behandlet med 3,05 uM oseltamivor og PBS-behandlede kontrolceller blev udfældet (ProteoExtract, Calbiochem) og resuspenderet i rehydrering buffer (7 M urinstof, 2 M thiourinstof 4% (v /v) CHAPS og 0,0002 % bromphenolblåt) med 0,2% af amfolyt og kvantificeret (2D Quant Kit fra GE Healthcare). Passiv rehydrering af strimlerne blev udført natten over med 200 ug af total proteiner under anvendelse IPG strimler af pH 3-10 NL (ReadyStrip; 0,5 x3 x70 mm, Bio-Rad, Hercules) ved stuetemperatur. Isoelektrisk fokusering blev udført på Protean IEF celle (Bio-Rad) med en indledende spænding på 250 V i 15 min, og derefter ved at påføre en spænding gradient op til 4000V med begrænsende strøm på 50 uA pr strimler og indstillet ved 20 ° C. Den første dimension blev afsluttet på 14-20 KVH.

Efter isoelektrisk fokusering proteiner blev reduceret og alkyleret ved inkubation med 2% DL-dithiothreitol (DTT), efterfulgt af 2,5% Iodacetamid i en ækvilibreringspuffer (6M Urea, 2% SDS, 0,002% bromphenolblåt, 75 mM Tris pH 8,8, 29,3% glycerol) i 10 minutter hver under forsigtig omrøring. Strimlerne blev derefter pakket i en 1% lave gelatinerings- (1% agarose i løbebuffer-25 mM Tris, 192 mM glycin og 0,1% (vægt /volumen) SDS, pH 8,3; Bio-Rad) på toppen af ​​en 10% acrylamidgel (acrylamid /bisacrylamid 37,5: 1, 2,6% fra Bio-Rad). Anden dimension elektroforese blev udført i en Mini-Protean tetra cellesystem (Bio-Rad) under anvendelse 1xTris /glycin /SDS-puffer ved konstant spænding på 125 V. Western blot-analyse under anvendelse af SNA lectin blev udført som beskrevet i det foregående afsnit.

Animal Studies

dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med de europæiske retningslinjer for pleje og anvendelse af forsøgsdyr, direktiv 2010/63 /UE og National forordningen blev offentliggjort i 2013 (Decreto-Lei n. ° 113/2013 de 7 de Agosto). N: NIH (S) II-nu /nu nøgne mus, blev indkvarteret, opdrættet og vedligeholdes på det Ipatimup Animal House, i et patogen-frit miljø under kontrollerede forhold af lys og fugt. Følgende Humane endepunkter var etableret: nogen signaler af angst, lidelse eller smerte, vægttab på mere end 20-25% af kroppens masse, anoreksi og døende tilstand, relateret eller ikke til den eksperimentelle procedure

Eksperimentel. mus grupper og medicinsk behandling

Female NIH (S) II-nu /nu nøgne mus, i alderen 4-6 uger blev orthotopisk podet med 1 x 106 levedygtige CMT-u27 hunde brystkræftceller i brystfedtpuden anvendelse af en 25 gauge nål. I alt 8 mus blev inokuleret. Når knuder nåede et volumen på ca. 500mm3, mus (n = 8) blev randomiseret og opdelt i kontrolgruppen (n = 4) og behandlingsgruppen (n = 4) .De dyr fik intraperitonealt (IP) dailly enten 100 pi PBS ( kontrolgruppe) eller 100 mg /kg af Oseltamivirphosphat (Tamiflu Roche) købt fra apoteket, fortyndet i PBS (behandlingsgruppe), indtil dødstidspunktet. Tumorstørrelse blev målt ved anvendelse skydelære, og tumorvolumen (mm3) blev estimeret ved bredde x længde x højde. At observere metastization blev primære tumorer i alle mus kirurgisk fjernes, når en gennemsnitlig volumen ~ 1000-1500mm3 blev nået. Mus blev bedøvet ved IP administration af 100 pi af en blanding indeholdende 50 mg /kg Ketamin (IMALGENE 1000) og 1 mg /kg medetomidinhydrochlorid (Medetor), og tumoren blev udskåret. Vi anvendte 2,5 mg /kg af atipamezol (Revertor) pr mus til at antagonisere virkningen af ​​anæstesi. Mus blev behandlet med en oral opløsning på 10 mg /kg af tramadol chloridrate (Tramal) hver 8 timer for 24-48 timer for at forhindre smerte. Dyr blev fulgt op efter kirurgisk excision af primære tumorer til invasion og /eller metastization tegn.

Alle mus blev aflivet i henhold til de etablerede Humane endpoints og obduceret. Væv blev fikseret i 10% bufret formalin, behandlet og indlejret i paraffin. Tre mikrometer snit blev skåret og farvet med hematoxilin eosin (HE) til yderligere histopatologisk og immunhistokemisk analyse. blev udført histopatologisk bedømmelse af primære tumorer og respektive metastaser samt betændelse vurdering (tælling af antallet af inflammatoriske infiltrater stede i hele xenotransplantat) uafhængigt af to patologer.

Histochemistry med lectiner og immunhistokemi

udtrykket af sialylerede strukturer i CMT-u27 implanteret i mus behandlet med oseltamivir og kontroller blev udført ved hjælp af plante lektiner SNA, MAL i og MAL II.

Slides blev afparaffiniseret og rehydreret efterfulgt af antigen opsving med kogende 0005% Extran i 8 minutter. Endogen peroxidaseaktivitet blev blokeret med 10% H2O2 i methanol opløsningen i 10 minutter, og objektglassene blev blokeret med 10% BSA i PBS (pH 7,4) i 30 minutter.

Derefter blev tumorsnit inkuberet i 2 timer ved stuetemperatur med biotinyleret SNA, MAL i og MAL II (Vector Laboratories.), fortyndet ved 1: 250, 1: 250 og 1: 150 i henholdsvis 5% BSA i PBS. Objektglas blev derefter vasket i PBS, inkuberet med avidin-biotin-peroxidase-kompleks (ABC) i 30 minutter og fremkaldt med diaminobenzidin tetrahydroxychloride substrat, DAB (SIGMA FAST). For immunohistokemi blev snit inkuberet natten over ved stuetemperatur med de primære antistoffer anti-Ki67 monoklonalt antistof (MIB1 klon, Dako), anti-caspase-3 (5A1E klon, Cell Signalling), og anti-SLE (x) (KM93, Millipore ) ved 1:50, 1: 100 og 1: 200 i henholdsvis 5% BSA i PBS. Objektglas blev derefter vasket i PBS, inkuberet med Novolink Max Polymer Detection System (1250 testikler), Novocastra, (Newcastle, UK) i 30 minutter ved stuetemperatur og udviklet anvende DAB af samme kit i 5 minutter.

objektglassene blev derefter modfarvet med hematoxylin, dehydreret, og monteret med Histomount (National Diagnostics). Negative kontroller, uden lektiner eller antistoffer, blev inkluderet. Alle farvede sektioner blev undersøgt med lysmikroskopi og gennemgået af tre observatører (de Oliveira J .; Ribeiro, C .; og Gartner, F.).

Statistisk analyse

Om nødvendigt resultaterne er præsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse. Statistisk analyse blev udført under anvendelse af envejs-ANOVA (variansanalyse) -test. For MTS, celleproliferation, og cellevæksten assays multiple sammenligninger anvendtes Dunnett metode. Student t-test blev udført for at evaluere sårhelende analyseresultater. Multiple sammenligninger Tukeys test blev anvendt til at undersøge celle matrigel invasion assay og multiple sammenligninger Bonferroni-test blev anvendt til Tunel assay analyse. GraphPad Prism 5.02 version blev anvendt til at udføre disse statistiske analyser.

Imunohistochemical billeder af Ki-67 og caspase-3-ekspression blev analyseret ved hjælp af ImmunoRatio online analyseværktøjer, under high-power forstørrelse i hvert område [35] . Tumor sager blev inddelt i 3 kategorier efter den Ki67 score: mindre end 10% Ki67 positive celler (lav), 10 til 50% Ki67-positive celler (moderat) og mere end 50% Ki67-positive celler (høj). For at evaluere caspase 3 og SLE

x-ekspression blev tumorer grupperet efter procentdelen af ​​immunoreaktive celler i hele læsion, i 3 klasser: 0% (negativ); mindre end 5% (sjældne celler) eller 6-10% (lav). Vedrørende SNA og MAA I-ekspression, en semi-kvantitativ analyse, hvor prøver blev scoret ifølge procentdelen af ​​positive celler. Tumorer blev grupperet i: mindre end 25% (lav); 25 til 50% (moderat) og mere end 50% (høj). Så foreningens hypoteser blev testet ved hjælp Chi-square test for diskrete variable. SPSS software (version 22,0) blev anvendt til statistisk analyse.

Resultater

Indflydelse af oseltamivirphosphat optagelse af CMA07 og CMT-U27 celler på den endogene sialidase aktivitet

in vitro

Oseltamivirphosphat behandling forringet sialidase aktivitet (neuraminsyre hydrolyse), som vist ved et fald af methyl-umbelliferon fluorescens i begge cellelinier (fig 1). Desuden, et fald på sialidase aktivitet var mere og mere tydeligt i højere oseltamivirphosphat koncentrationer.

CMA07 og CMT-U27 celler blev behandlet i 24 timer med forskellige koncentrationer af oseltamivirphosphat (0,305 pM, 3,05 pM, 30,5 pM og 305 uM) eller PBS som kontrol, og inkuberes med en 2 pM 4-Muñana opløsning. Objektglas blev straks observeret under en epi-fluorescensmikroskop med UV-lys. Begge cellelinier viste nedsat sialidase aktivitet som vurderet af den fluorescerende methyl-umbelliferon, som skyldes metaboliske omdannelse af 4-Muñana.

Effekt af oseltamivirphosphat behandling i CMA07 og CMT-U27 celler morfologi, levedygtighed og programmeret celledød

for at vurdere effekten af ​​forskellige doser af oseltamivirphosphat på cellemorfologi, levedygtighed og programmeret celledød,

in vitro

analyser nedenfor blev udført.

Mindre ændringer i cellemorfologi blev observeret i CMA07 celler behandlet med oseltamivir fosfat. Ingen større ændringer i CMT-U27 cellemorfologi blev observeret (S1 Fig).

Statistisk analyse viste ingen signifikante forskelle i vækstraten for både CMA07 (

s

= 0,6209) og CMT-U27 (

s

= 0,9929) cellelinjer, ved behandling med oseltamivir fosfat (fig 2A). For yderligere at vurdere virkningen af ​​oseltamivir behandling på CMA07 og CMT-U27 cellelevedygtighed, MTS kolorimetrisk assay, som bestemmer cellulær metabolisk aktivitet, blev udført i 48 timer. Den metaboliske aktivitet af CMA07 og CMT-U27 cellelinjer blev signifikant nedsat med 305 pM oseltamivirphosphat behandling (

s

= 0,005 og p 0,0001 henholdsvis) ved hjælp af One Way ANOVA testikler (variansanalyse). I modsætning hertil ingen statistisk signifikante ændringer blev observeret med 0,305 pM (p = 0,9781), 3,05 uM (

s

= 0,7436) og 30,5 uM (

s

= 0,9623) af oseltamivirphosphat behandlinger når sammenlignet med kontrolceller (fig 2B). Endelig, for at vurdere effekten af ​​oseltamivirphosphat på CMA07 og CMT-U27 programmeret celledød, og da 305 pM oseltamivirphosphat behandling svækket celle metaboliske aktivitet blev en programmeret celledød måling udføres med TUNEL-analysen. Tyve-fire timer oseltamivirphosphat behandling, specielt ved 305 uM, signifikant forøget CMA07 (

s

= 0,0010) og CMT-U27 (

s =

0,0002) DNA-fragmentering, hvilket tyder på fremme af programmeret celle død, når man sammenligner med lavere koncentrationer oseltamivir, eller med PBS (fig 2C øvre og nedre paneler).

Cellevækst vurderes med Trypan blå (A) eller med MTS-assay (B) og programmeret celledød (C ) blev evalueret i CMA07 og CMT-u27-celler efter behandling med oseltamivirphosphat (0,305 pM, 3,05 pM, 30,5 uM og 305 uM) eller PBS som kontrol. (A) Celler blev dyrket i nærværelse af forskellige oseltamivirphosphat koncentrationer, og cellevækst blev overvåget i 7 dage ved at tælle antallet af levedygtige celler dagligt. Ingen signifikante forskelle i vækstrater på behandlede celler blev kontrolleret sammenlignet med ikke-behandlede celler, bortset fra en reduceret vækst i CMA celler efter 4 dage med 305 pM oseltamivirphosphat behandling. (B) Celler blev dyrket i nærværelse af de forskellige oseltamivirphosphat koncentrationer, og celle metaboliske aktivitet blev yderligere overvåget ved anvendelse af et MTS-assay, i et tidsforløb måde i 48 timer. CMA07 og CMT-U27 celler behandlet med 305 pM oseltamivirphosphat viste et signifikant fald i deres metaboliske aktivitet (***

s

0,001), men ingen ændringer blev kontrolleret med lavere koncentrationer. (C) CMA07 og CMT-U27 blev behandlet med forskellige koncentrationer af oseltamivir i 24 timer. Celler behandlet med 305 pM oseltamivirphosphat viste også en statistisk signifikant stigning i programmeret celledød (***

p

0,001) efter 24 timers oseltamivirphosphat behandling, men ingen ændringer blev verificeret med de lavere koncentrationer (grafer