PLoS ONE: Sensibilisering for Human bugspytkirtelkræftceller huser muterede K-ras til Apoptosis

Abstrakt

Kræft i bugspytkirtlen er en ødelæggende menneskelig malignitet og gevinst af funktionelle mutationer i

K-ras

onkogen er observeret i 75% -90% af patienterne. Undersøgelser har vist, at oncogene

ras

er ikke kun i stand til at fremme cellevækst eller overlevelse, men også apoptose, afhængigt af omstændighederne. Brug bugspytkirtelkræft cellelinjer med eller uden at udtrykke muterede

K-ras

, vi viste, at hæmning af endogen PKC aktivitet sensibiliseret humane bugspytkirtelkræftceller (MIA og PANC-1), der udtrykker muteret

K-ras

til apoptose, som ikke havde nogen apoptotisk virkning på BxPC-3 bugspytkirtelkræftceller der indeholder et normalt Ras samt human lunge epiteliale BAES-2B-celler. I denne apoptotisk proces blev niveauet af ROS øget og PUMA blev opreguleret i en p73-afhængig måde i MIA og PANC-1-celler. Efterfølgende caspase-3 blev spaltet. En fuld induktion af apoptose krævede aktivering af både ROS- og P73-medierede pathways. Data tyder på, at PKC er en afgørende faktor, der klarer med afvigende

K-ras

at opretholde homøostase af de bugspytkirtelkræftceller huser muterede

K-ras

. Men undertrykkelse eller tab af PKC forstyrrer balancen og igangsætter en apoptotisk krise, hvor ROS og p73 synes potentialet, centrale mål

Henvisning:. Shen L, Kim SH, Chen CY (2012) Sensibilisering af Menneskelig bugspytkirtelkræftceller huser muterede

K-ras

til apoptose. PLoS ONE 7 (7): e40435. doi: 10,1371 /journal.pone.0040435

Redaktør: Fazlul H. Sarkar, Wayne State University School of Medicine, USA

Modtaget: Marts 20, 2012; Accepteret: 6 juni 2012; Udgivet: 25 Jul 2012

Copyright: © 2012 Shen et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne forskning blev delvist støttet af en intern JCRT (Joint center for strålebehandling, Harvard Medical School) og National Institute of Health 1RO1CA100498 tildelt Chang Yan Chen. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, dataindsamling og analyser, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i bugspytkirtlen er en sygdom med en dystre udsigter. I USA er ca. 33.000 patienter diagnosticeret med kræft i bugspytkirtlen hvert år og næsten lige så mange vil dø af denne ondartet sygdom [1] – [3]. Worldwide, bugspytkirtelkræft forårsager et betydeligt antal dødsfald årligt. Flere funktioner i denne ødelæggende sygdom er ansvarlige for den høje dødelighed på grund af vanskeligheden ved at opdage prækursorer læsioner eller opdager symptomerne indtil i de fremskredne stadier. Canceren ofte undergår mikro-metastase, som er ansvarlig for en dårlig prognose af denne sygdom. Desuden fremskreden bugspytkirtelkræft er ofte resistent over for konventionel kemoterapi eller strålebehandling. Alle disse angiver, at det haster for at udvikle nye strategier til at behandle denne dødelige sygdom.

Genetisk, epigenetiske og miljømæssige faktorer er involveret i tilblivelsen og udviklingen af ​​kræft i bugspytkirtlen [1]. Patogenesen af ​​denne sygdom er gennem akkumulering af genetiske og molekylære ændringer, hvilket resulterer i defekter i vækst, adhæsion og integration af bugspytkirtler. De molekylære ændringer i denne menneskelige malignitet har vist sig at omfatte ændringer i vækst–relaterede molekyler, tumorsuppressorer og cellecyklus regulatorer [4] – [7]. Forstyrrelser i intracellulært, mitogene signalveje eller proliferation begrænsninger giver en fordel til tumorceller for deres vækst eller overlevelse. Epidermal vækstfaktorreceptor (EGFR) familien er plasmamembranen glycoprotein og blev vist at spille en afgørende rolle i bugspytkirtelkræft initiering og udvikling [8] – [10]. Medlemmerne af EGFR er blevet rapporteret at være ofte overudtrykt i bugspytkirtelkræftceller, som i henhold hertil aktiverede dens downstream signalveje, såsom Ras og ERK, at fremme cellevækst og overlevelse [11].

Selv om en række forskellige genetiske afvigende markører er blevet identificeret i humane pancreas cancer læsioner, blev de hyppigste mutationer identificeret i

K-ras

, og de tæt følgende begivenheder var inaktivering af de tumorsuppressorer af p16, ARF, p53 og Smad4 [ ,,,0],12] – [14]. K-Ras tilhører Ras familie proteiner, som er små cytoplasmatiske GTP-bindende proteiner [15]. De konstitutivt aktive Ras forbinder med GTP, og giver ukontrollable, mitogen-stimulerende signalering til nedstrømseffektorer, herunder Raf /MAPK, PI3K /Akt, JNK /p38 og RalGDS. En musemodel for pancreascancer viste, at betinget ekspression af et onkogen allel af

K-ras

var i stand til at danne præ-duktale læsioner, som progredierede til invasiv og metastatisk cancer ved en lav frekvens. Samtidig knockout af P14 og ARF fremmes og forvandlet disse præ-læsioner til yderst invasive og metastatiske cancere [12] – [14]. Disse resultater indikerer, at K-Ras-aktivering inducerer pre-pankreatiske læsioner og de tumorsuppressorer (såsom p14 eller ARF) funktion til begrænsning af den maligne omdannelse af disse forstadier [12] – [14]. Men det har ikke været fuldt udforsket, hvis disse intracellulære veje i bugspytkirtelkræftceller kan omdirigeres for at tænde celledød program.

Det er velkendt, at Ras kan fremme ikke blot celledeling eller differentiering, men også programmeret celledød. I Apo1-medieret apoptose, ligeringen med Apo1 (apoptose antigen 1) receptor forårsagede akkumulering af membranlipider og aktivering af ceramid, hvilket igen, stimulerer Ras aktivitet for induktionen af ​​apoptose [16], [17]. I lymfocytter, Ras spillede en vigtig rolle i IL-2 medieret apoptose, som sikrede en effektiv omsætning af lymfocytter [18], [19]. Brat aktivering af Ras nedstrømseffektor MAP kinase pathway fremmes celler til at undergå apoptose [20], [21]. Som reaktion på stress-relaterede stimulation, JNK syntes at fungere på nedstrøms for Ras og inducere apoptose i celler, når stress var vedholdende [22]. Vi rapporteret at oncogen Ha-Ras sensibiliseret humane eller murine celler for apoptose, når endogen PKC-aktivitet undertrykkes [22]. I denne apoptotisk proces blev niveauet af ROS øget og caspasekaskaden blev udløst [22]. Vores nuværende undersøgelse med henblik på yderligere at teste, om

K-ras

mutation var syntetisk dødelig med tab af PKC i bugspytkirtelkræftceller.

PKC (protein kinase C) familie består af mere end 11 isoformer, der klassificeres på grundlag af deres biokemiske funktioner og strukturer i den klassiske (cPKCs: α, Ø og y, der er phorbolester og calcium-afhængig), roman (nPKCs: δ, ε, η og θ, der er phobol ester-afhængige kun ) og atypiske PKC’er (aPKCs: f-og Å-som er uafhængige af phorbolester og calcium). Mitogene stimuli (såsom vækstfaktorer), gennem øget membranen DAG (diacylglycerol), aktivere PKC. Mens undersøgelser har vist, at PKC var involveret i phorbolester-medieret mitogene reaktioner, er det nu klart, at PKC-aktivering kan inhibere cellevækst eller endog udløse apoptose afhængigt typer af isoformerne, differentiel kobling til effektorer [23], [24] . For eksempel PKC α medierer ofte proliferative eller tumorigene responser. I intestinale eller brystceller, de samme isoformer af PKC deltage i anti-proliferative responser. forskellige PKC isoformer i den samme type celler kan dog fungere modsat. I murine NIH3T3, rotte R6 eller normale humane colon-epitelceller, overekspression af PKC δ forårsaget vækststandsning og samtidig øge niveauet af PKC Ea indledt transformationsproces [25] – [27]. Emerging beviser kraftigt antydet, at PKC δ ofte fungerer som en tumor suppressor [24], [28]. Undersøgelser viste, at PKC ikke kun A var en negativ regulator af cellecyklusprogression eller positiv mediator af apoptose, men ligeledes medfører en høj modstandsdygtighed over for huden tumorpromotion induceret af DMBA-phorbolester i dyremodeller [29], [30].

krydstale mellem PKC’er og Ras signalveje er blevet observeret [31]. I forskellige typer af celler, PKC og Ras interagerer enten i en hierarkisk lineær eller kooperative parallelt forhold. Som reaktion på mitogen stimulering, blev PKC phosphoryleret ved forskellige serinrester og efterfølgende forbundet med SH2-domænet i GRB-2. Komplekset herunder GRB-2 /Sos blev på sin side dannet for at aktivere Ras-signalering i T-lymfocytter [32]. Aktiveringen af ​​PKC og Ras i lymfocytter var derefter i stand til at mobilisere PI3 kinase at generere PIP3 og yderligere forårsage forskellige protein kinase kaskader, der fører til aktivering af AKT og Rac at fremme cellevækst aktiviteter. Det blev også rapporteret, at gennem at påvirke Rel aktivitet, PKC haft en negativ indflydelse på Ras-medieret signalering [31]. I visse maligne celler, blev PKC aktiveret og i stand til at medieret Bcl-2-phosphorylering for overlevelse fremme [33], [34]. Ved at blokere pro-apoptotiske signalveje, PKC-induceret aktivering af Bcl-2 blev foreslået at spille en væsentlig rolle i lunge tumorigenese. Hæmning af PKC ved farmakologiske hæmmere i dyrkede humane lunge kræftceller udløste en apoptotisk respons [35]. Vores nuværende undersøgelse viste, at Ras fortrinsvis induceret apoptose i bugspytkirtelkræftceller huser en aktiv

K-ras

efter blokaden af ​​PKC. Vores data foreslog, at samarbejdet mellem PKC optrådte afgørende for bugspytkirtelkræftceller huser muteret K-Ras at overleve.

Resultater

Sensibilisering af kræft i bugspytkirtlen celler, der huser muterede K-ras til apoptose efter behandling med GO6976

De duel funktioner Ras at fremme cellevækst og apoptose blev veldokumenteret [20], [22]. Vi har tidligere påvist, at co-inhibering af PKC α og β ekspression eller aktivitet var letal for murine celler overudtrykker

v-ras

[22], [28]. Da

K-ras

påvises mutationer i de fleste af pancreas adenocarcinom læsioner [1], det førte os til at undersøge følsomheden af ​​bugspytkirtelkræftceller til apoptose som reaktion på behandlingen med GO6976 (en PKC-inhibitor specifik for PKC a og β). Ekspressionen og aktiveringsstatus af K-Ras i forskellige humane pancreas cancercellelinier og humane lungeepitelceller blev testet. Niveauet af Ras-ekspression i human pancreascancer MIA eller PANC-1-celler var sammenlignelig med den i lunge epiteliale BEAS-2A-celler og en let reduceret mængde af Ras blev detekteret i pancreas cancer BxPC-3-celler (fig. 1A). Efterfølgende blev lysater fra disse celler udfældet med en RBD (Ras bindende domæne af Raf) -GST fusionsprotein at teste aktiveringsstatus af Ras. En aktiveret Ras blev co-udfældet med fusionsproteinet i MIA og Panc-1-celler, men ikke i BxPC-3 eller BEAS-2B-celler (fig. 1B). Størrelsen af ​​Ras aktivering i MIA var højere end i PANC-1 celler.

A. Ekspressionen af ​​Ras blev undersøgt ved immunoblotting-analyse i human pancreascancer BxPC-3, MIA, PANC-1 eller lunge epiteliale BEAS-2B-celler. Folderne af ekspressionsniveauerne af Ras i bugspytkirtelkræftceller forhold til det i BEAS-2B-celler blev målt og angivet. Lige belastning af totale proteiner per bane blev bestemt ved β-actin. B. Ras GTP-bindende aktivitet blev målt i disse celler ved Ras-GTP assay. Blottet blev re-undersøgt af anti-Ras antistof til at bedømme jævnt indlæsning af de samlede proteiner.

Dernæst undersøgte vi ekspressionen af ​​PKC i disse celler, samt deres svar på PKC aktivator PMA (phorbol myristatacetat) eller inhibitor GO6976. Et tilsvarende ekspressionsniveauet af PKC blev påvist i alle cellelinjer (fig. 2A). Induktionen PKC-aktivitet med PMA og inhiberende virkning af GO6976 på PMA-induceret PKC-aktivitet blev også undersøgt under anvendelse af et PKC-aktivitet kit (fig. 2B). I ubehandlet MIA eller PANC-1-celler, PKC-aktivitet var lidt højere end i ubehandlede BxPC-3 eller BEAS-2B-celler. Behandlingen med PMA steget dramatisk aktiviteten af ​​denne kinase i alle cellelinjer, der blev inhiberet af GO6976, hvilket indikerer, at PKC var funktionelle i alle testede celler.

A. Cellelysater isoleret fra ubehandlede celler blev immunoblottet med anti-pan-PKC-antistof.

β

actin blev anvendt til bestemmelse lig belastning af totalt protein per bane. B. Cellelysater fra cellerne med eller uden at blive behandlet med PMA eller PMA plus GO6976, blev immunpræcipiteret med anti-pan-PKC-antistof. Immunkomplekserne blev inkuberet med [

32P] γ-ATP og peptidsubstrater at analysere PKC-aktivitet. Fejlsøjlerne repræsenterede SD fra tre uafhængige forsøg (n = 3,

ρ

0,05).

PKC og Ras er de afgørende intracellulære signal transducere og deltage i at sende signaler til regulere forskellige biologiske eller pato-biologiske aktiviteter. Induktion af apoptose ved PKC undertrykkelse blev rapporteret i murine eller humane celler, der udtrykker onkogen

ras

[20], [22], [28]. For at teste om GO6976 kunne inducere apoptose i pancreas cancercellelinier med eller uden at udtrykke muterede

annexin V blev udført K-ras

, (fig. 3A og B). GO6976 behandling dramatisk sensibiliserede MIA og PANC-1-celler til apoptose og spillet nogen rolle ved induktion af apoptose i BxPC-3-celler, der indeholder normale Ras-signalvejen og i human lunge epiteliale BEAS-2B-celler. Især MIA celler, i hvilke Ras-aktivitet var højere var mere modtagelige for GO6976-induceret apoptose end PANC-1-celler. For at bestemme om Ras var ansvarlig for induktionen af ​​apoptose, blev farnesyltransferase-inhibitor (FTI) at undertrykke Ras aktivitet anvendes (fig. 3C). I nærvær af FTI, GO6976 behandling var ikke i stand til at inducere apoptose i MIA eller PANC-1-celler. Dataene antydede, at muterede K-Ras, sammen med tab af PKC-funktion, optrådte letal og denne dødbringende reaktion kunne reguleres ved muteret Ras.

A. Celler blev behandlet med GO6976 (1 uM) i 48 timer og derefter opsamlet for annexin V-assay. De fejl barer er SD fra 5 uafhængige forsøg (n = 5,

ρ

0,05). B. Profiler af cellerne efter at være farvet med annexin V. C. Cellerne blev behandlet med FTI i 30 min før GO6976 behandling. Efterfølgende blev annexin V-assay udført. De fejl barer er SD fra 5 uafhængige forsøg (n = 5,

ρ

0,05)

opregulering af ROS ved GO6976 i bugspytkirtelkræftceller huser Muterede K-ras for. induktion af apoptose

ROS (reaktive oxygenarter) vides at være nødvendig for cellevækst og tværtimod en vedvarende forhøjet i ROS blev vist at være i stand til at forårsage DNA-skader eller udløse apoptose [36]. Undersøgelser viste, at ROS i celler, der udtrykker onkogener (såsom

ras

) blev ofte augmented, hvilket kan skyldes høje metaboliske behov hos neoplastisk vækst [36]. ROS-niveauer i bugspytkirtelkræft og BEAS-2B-celler blev målt under normale vækstbetingelser eller efter behandlingen med GO6976 (fig. 4A). En moderat mængde af ROS blev påvist i MIA eller Panc celler, som dramatisk var forhøjet efter tilsætningen af ​​GO6976. ROS var på baseline niveauer i ubehandlet BxPC-3 eller BEAS-2B celler og behandlingen med PKC-hæmmer ikke påvirkede ROS produktion eller akkumulering.

A. Cellerne blev behandlet med GO6976 eller co-behandlet med GO6976 plus NAC (2,5 mM). Efter at være farvet med DCF, blev niveauerne af ROS i cellerne analyseret ved et flowcytometer. B. Cellerne blev behandlet med GO6976 (1 uM) eller GO6976 plus NAC. Efterfølgende blev prøverne opsamlet og udsat for annexin V-assay. De fejl barer er SD fra 5 uafhængige forsøg (n = 5,

ρ

0,05).

For at afgøre, om ROS spillet en rolle i induktion af apoptose efter PKC hæmning i bugspytkirtelkræftceller udtrykker muteret

K-ras

, annexin V assay blev udført (fig. 4B). Igen, MIA og PANC-1-celler var følsom for GO6976 behandling, som delvis var, men signifikant blokeret af NAC (N-acetyl-L-cystein, en ROS inhibitor). Da NAC ikke fuldstændig undertrykt apoptose i disse celler, foreslås deltagelse af andre veje i udførelsen af ​​denne celledød program. Konsekvent, bugspytkirtelkræftceller uden at udtrykke muterede

K-ras

eller human lunge epiteliale BEAS-2B-celler var ikke-responsive for GO6976 samt til kombinationsbehandling af GO6976 plus NAC.

Aktivering af caspase 3 i denne Lethal Reaction Opstod i MIA eller PANC-1 Celler

Caspase familie består af mere end 10 medlemmer [37]. Som reaktion på apoptotiske stimuli, blev caspase-3 vist at fungere som en bøddel i caspasekaskaden til færdiggørelse af celledød program [37]. I denne proces blev caspase-3, der skal spaltes i en lille, aktivt fragment. For at teste aktiveringsstatus af caspase 3, blev tilstedeværelsen af ​​den spaltede caspase 3 i MIA eller PANC-1-celler analyseret ved immunoblotting (fig. 5A). Efter behandling med GO6976, en lille, spaltet caspase-3 faktisk var til stede i disse to bugspytkirtelkræftceller. Den aktive form af denne caspase kunne ikke påvises i GO6976-behandlede BxPC-3 eller BEAS-2B-celler (data ikke vist). For yderligere at undersøge aktiveringen af ​​caspase 3 med samme eksperimentelle indstilling blev caspase 3-aktivitet analyseret (fig. 5B). Efter behandling med inhibitoren blev aktiviteten af ​​denne protease opreguleret i MIA og PANC-1-celler, som blev delvist undertrykt ved tilsætning af NAC. Konsekvent, aktiviteten af ​​caspase 3 var til stede i GO6976-behandlede BxPC-3-celler uden at udtrykke muterede

K-ras

eller BEAS-2B-celler. Resultaterne antydede, at caspase 3 deltog i udførelsen af ​​GO6976-induceret apoptose i bugspytkirtelkræftceller huser onkogene

K-ras

.

A. Med eller uden GO6976 behandling blev cellelysater fremstillet og immunblottet med anti-caspase 3-antistof. B. Cellerne blev underkastet behandling med GO6976 eller GO6976 plus NAC. Efterfølgende blev annexin V-assay udføres. Fejlbjælkerne viser SD fra 3 uafhængige forsøg (n = 3,

ρ

0,05).

opregulering af de apoptotiske Factor PUMA i en p73-afhængig Fashion Under GO6976- induceret apoptose

p73 tilhører p53 familien og deler homologi med p53 ikke blot i deres sekvenser, men også transaktivering, DNA-bindende eller oligomerisering funktioner [38]. I P73-medieret apoptose, blev den apoptotiske-relateret faktor PUMA ofte opreguleres [38]. Vi har tidligere rapporteret, at efter PKC hæmning, P73 i murine fibroblaster ektopisk udtrykker

Ha-ras

blev aktiveret og der er ansvarlige for initiering af apoptose [28]. Under denne celledød proces, blev p73 phosphoryleret ved dets serinrester [28]. For at teste, om p73 blev phosphoryleret i GO6976-behandlede MIA eller PANC-1-celler, blev immunoblotanalyse udført (fig. 6A). Phosphoryleringen af ​​p73 blev forekom ved sine serinrester i de behandlede celler, men ikke i kontrolceller. Den GO6976-medieret p73 phosphorylering ikke ændres ved tilsætning af NAC. Efterfølgende ekspressionen af ​​p73-regulerede

PUMA

gen i MIA eller PANC-1-celler blev undersøgt ved real-time PCR-analyse (fig. 6B). Niveauet af genekspression i cellerne blev øget markant efter behandlingen med GO6976. Opregulering af genet var igen uændret i nærvær af NAC, men fuldstændigt undertrykt af den transiente infektion af

shRNA-P73

. Konsekvent blev proteinet ekspression augmented efter behandlingen med PKC-inhibitor (fig. 6B). Indførelsen af ​​

shRNA-P73

i cellerne også blokeret induktionen af ​​PUMA protein, som ikke var påvirket af tilsætning af NAC (data ikke vist). Det viste sig, at PUMA var involveret i akse P73-medieret signalering i denne apoptotisk proces.

A. Med eller uden behandling med GO6976 eller GO6976 plus NAC, blev lysater immunfældet med anti-p73 antistof. Immunopræcipitaterne blev derefter underkastet immunoblotting under anvendelse af anti-phosphorylerede serin antistof. Niveauet af de immunpræcipitater blev bedømt ved re-probe blottet med anti-p73 antistof. B. Total RNA fra cellerne med eller uden behandling med GO6976, GO6976 plus NAC eller GO6976 plus

shRNA-P73

infektion blev isoleret. Lige så stor mængde RNA’er blev revers-transkriberet, og ekspressionen af ​​

PUMA

blev testet ved RT-PCR. C. Med eller uden GO6976 behandling, MIA eller PNAC-1-celler blev underkastet immunblotting analyse for PUMA ekspression. Lige belastning af totale proteiner bestemtes ved rep-probe blottet med anti-β-actin-antistof.

Samarbejdet af ROS og P73 til induktion af GO6976-medieret apoptose

Det er velkendt, at multiple, apoptotiske signalveje integreres for en fuld gennemførelse af celledød program. Da ROS og P73 dukkede deltager i induktion af apoptose i GO6976-behandlede bugspytkirtelkræftceller huser muterede

K-ras

, vi først testet hvis P73 spillet nogle roller i opregulering af ROS i bugspytkirtelkræftceller ( fig. 7A). Igen, en moderat blandt af ROS blev påvist i ubehandlede MIA eller PANC-1-celler, som blev yderligere forøget efter PKC-inhibering. Den forbigående infektion af

shRNA-P73

havde ingen indflydelse på induktion af ROS, tyder på, at P73 i vores eksperimentelle indstilling var ikke involveret i ROS signalering. Efterfølgende blev caspase-3 aktivitet analyseret efter knockdown af p73 eller co-hæmning af P73 og ROS (fig. 7B). Indførelsen af ​​

shRNA-P73

delvist blokeret aktiviteten af ​​caspase-3 i GO-6976-behandlede MIA eller PANC-1 og aktiviteten af ​​denne protease blev fuldstændigt ophævet efter co-suppression af P73 og ROS. Forekomsten af ​​apoptose efter de samme behandlinger blev derefter analyseret ved annexin V-assay (fig. 7C). Knockdown af

P73

delvist inhiberede GO6976-induceret apoptotisk proces i MIA eller PANC-1-celler. I mangel af både

P73

og ROS, GO6976 ikke var i stand til at initiere apoptose i disse celler. Dataene antydede, at mindst to apoptotiske veje:. P73 og ROS deltog i denne dødbringende reaktion

Niveauet af ROS i cellerne behandlet med GO6976 eller GO6976 plus

shRNA-P73

infektion var analyseret. Fejlbjælkerne viser SD fra 3 uafhængige forsøg (n = 3,

ρ

0,05). B. Aktiviteten af ​​caspase 3 i cellerne behandlet med GO6976, GO6976 plus

shRNA-P73

infektion eller GO6976 plus NAC plus

shRNA-P73

infektion blev analyseret. Fejlbjælkerne viser SD fra 3 uafhængige forsøg (n = 3,

ρ

0,05). C. Annexin V assay i MIA og PANC-1 celler behandlet med GO6976, GO6976 plus

shRNA-P73

infektion eller GO6976 plus NAC plus

shRNA-P73

infektion blev udført. Fejlbjælkerne viser SD fra 3 uafhængige forsøg (n = 3,

ρ

0,05).

Diskussion

Kræft i bugspytkirtlen er en ødelæggende menneskelig malignitet og en af ​​de førende årsager til kræft død [1]. Prognose af denne sygdom er dystre, på grund af manglen på effektive behandlinger. Det vides, at gevinst på funktionelle mutationer i

K-ras

opstår på tidlige stadier i menneskets bugspytkirtlen kræftpatienter eller musemodeller, der blev genereret af knockout af tumorsuppressorgener af

p16, Arf

, eller

p53

henholdsvis eller i kombinationer [12] – [14]. Disse fund indikerer betydningen af ​​K-Ras i tilblivelsen og udviklingen af ​​kræft i bugspytkirtlen. Målet med vores undersøgelse var at udforske den nye strategi rettet mod onkogen Ras for pancreas lægemidler. Den foreliggende undersøgelse viste, at afvigende, muterede

K-ras

var i stand til at omdirigere bugspytkirtelkræftceller mod til apoptose efter undertrykkelsen af ​​PKC. I denne apoptotisk proces, flere signalveje var involveret. Efter behandlingen med PKC-inhibitor, der udtrykker niveauet af ROS i bugspytkirtelkræftceller muteret

K-ras

blev forøget, ledsaget med induktion af apoptose. Men tilsætning af NAC delvist blokeret cellen dødsprocessen. P73 var phosphoryleret og, PUMA gen og protein blev opreguleret. Desuden caspase 3 blev kløvet for udførelsen af ​​celledød program. Den co-hæmning af ROS og p73 opnået en ultimative blokade effekt på apoptose i GO6976-behandlede bugspytkirtelkræftceller huser muterede

K-ras

. Således er vores undersøgelse tyder på, at afvigende Ras, sammen med tab af PKC er syntetisk dødelig i bugspytkirtelkræftceller. Dataene også foreslået en potentiel balance mellem Ras og PKC, der bestemmer grænsen af ​​apoptose i cellerne.

mutations aktiveringer af

ras

gener er en af ​​de vigtigste begivenheder under initiering og udvikling af forskellige typer af humane maligniteter [15]. I processen med omdannelse, vedvarende stigninger i Ras aktivitet kontakten på forskellige nedstrømseffektor veje, der fører til phosphorylering kædereaktioner til aktivering af pro-vækst transkriptionelle faktorer [39]. På trods af den betydeligt engagement i cellevækst og differentiering, hyperaktive Ras, under visse omstændigheder, kan omdirigeres til apoptose. Talrige undersøgelser har fremhævet roller Ras i reguleringen af ​​apoptose [20]. Især er det blevet observeret, at behandlinger med PKC-inhibitorer kan inducere apoptose i murine fibroblaster eller rottelunge epitelceller overudtrykker onkogen

ras

[22], [28]. Her vil vi vise, at PKC aktivitet i bugspytkirtelkræftceller huser muterede

K-ras

var lidt augmented, der måtte være nødvendige for at håndtere afvigende høj Ras aktivitet for at overleve. Efter PKC blev undertrykt, muterede K-Ras kunne ikke opretholde høje metaboliske behov hos de kræftceller og dødbringende Reaktionen blev initieret. Da høje procenter af menneskelige kræftformer huser onkogen

ras

, PKC vises en ideel intracellulært mål for induktion af apoptose, med en lav eller ingen toksisk virkning på omgivende normale væv eller celler.

Mere end 11 serin /threonin-proteinkinaser tilhører PKC familie, hvoraf nogle er strukturelt forskellige eller funktionelt forskellige. Men der er en funktionel redundans blandt disse PKC isozymer til genoprettelse af normal fysiologisk status, når en eller flere PKC isozymer bliver slået ud eller ikke-funktionel. Roller PKC isoformer i reguleringen af ​​cellevækst eller død er temmelig kontroversielle, afhængigt af forskellige typer af celler eller cellulære sammenhænge. For eksempel er det blevet foreslået, at PKC α, β, A besad duel roller i reguleringen af ​​udviklingen af ​​kræft eller programmeret celledød, hvilket indikerer kompleksiteten af ​​disse PKC isozymer [24]. Cross-samtaler mellem PKC-isoformer og med andre intracellulære signaltransducere var ofte til stede i et hierarki orden eller forskellige rum til at guide celler for at opnå forskellige resultater. Det blev også vist, at PKC og Ras signalveje blev indbyrdes forbundet, især i lymfocytter [24], [40]. Ved mitogen stimulering, SH2 bindingssteder PKC var phosphoryleret, hvilket igen rekrutterer Grb2 /SOS kompleks og yderligere aktiverede Ras-signalvejen i T-lymfocytter [24]. PKC blev rapporteret til negativt reguleret Ras vej, gennem at påvirke dets effektor Rel [24]. I NIH3T3-celler ektopisk udtrykker

v-Ha-ras

, p73 fungerede nedstrøms for PKCa og β og som en sensor til at bestemme tærsklen for apoptose [22]. Brug af PKC-inhibitoren GO6976 som hæmmer den phorbolester-afhængige PKC-isoformer, vi i denne undersøgelse viste, at de bugspytkirtelkræftceller med hyperaktiv K-Ras kunne effektivt sensibiliseret til apoptose. Undersøgelsen for at identificere centrale PKC isoform (r) i reguleringen af ​​denne apoptotiske proces er i gang.

ROS ofte virker som et intracellulært signal transducer af vækstfaktorer [36]. Nogle mitogene stimuli er i stand til at øge niveauet af intracellulær ROS, hvilket resulterer i ændring af strukturen af ​​cytoskelettet og længere inducere transformation [36]. I PC12-celler blev Ras vist at opregulere ROS produktion på EGF-stimulering [41]. Undersøgelser viste også, at onkogener (såsom

myc

eller

ras

), gennem vedholdende forstyrrende staten intracellulære redox, var i stand til at forårsage kromosomafvigelser og efterfølgende forstyrre genetiske integritet for at fremme tumorigenese [36 ]. Trods regulere celleproliferation og transformation, blev en stigning i ROS foreslået at spille en obligatorisk rolle i induktionen af ​​apoptose [22]. I TNFa-induceret programmeret celledød, NF-KB og JNK samarbejdet at stimulere ROS produktion, hvilket fører til caspasekaskaden og mitokondriel depolarisering [42]. Ektopisk udtryk for

Ha-ras

i murine fibroblaster inducerede celledød gennem fremkalde ER (endoplasmatisk reticulum) stress og aktivering UPR (udfoldet protein respons) [22]. Den aktuelle undersøgelse viste, at selv om ROS moderat blev forhøjet i bugspytkirtelkræftceller udtrykker muteret

K-ras

under normale vækstbetingelser, hæmning af PKC alvorligt forstyrret ligevægten af ​​redox stat og inducerede en signifikant akkumulering af ROS i celler. Synes således PKC en vigtig faktor for at opretholde homøostase af bugspytkirtelkræftceller huser en afvigende

K-ras

.

P73 tilhører p53 familie proteiner og deler den strukturelle og funktionelle homolog med p53 [38]. Undersøgelser viste, at p73 spillet en væsentlig rolle i DNA damage- eller stress-induceret apoptose. Nuklear c-Abl blev aktiveret ved genotoksisk stress og yderligere phosphoryleret P73 til induktion af apoptose [43]. I denne celledød proces, nuklear c-Abl interageret med P73 og stimuleres yderligere P73-regulerede aktiviteter. Det blev også vist, at som reaktion på ioniserende stråling eller cisplatin behandling, P73 spillede en central rolle i transmissionen af ​​den apoptotiske signalering [44]. I murine fibroblaster overekspression

v-Ha-ras

, PKC δ interageret med og yderligere aktiveret p73 at udløse en apoptotisk krise [28]. I denne undersøgelse har vi vist, at p73 blev phosphoryleret i bugspytkirtelkræftceller huser muterede

K-ras

, og efterfølgende opreguleres niveauet af ekspressionen af ​​apoptotiske faktor PUMA. Den underliggende mekanisme, som PUMA deltager i denne apoptotisk proces stadig undersøges nærmere.

Sammenfattende genetiske mutationer i

K-ras

vises entydigt til stede i 90% af humane pancreas cancer læsioner og denne sygdom er en af ​​de førende årsager til kræft død. Således er der et presserende behov for opdagelser af effektive behandlinger klinisk.