PLoS ONE: Konsekvenserne af Diverse Immune Evasion Mekanismer af kræftceller på T-celler engageret af EpCAM /CD3-bispecifikke antistof Construct AMG 110

Abstrakt

Baggrund

Bispecific T-celle Engager (bid

®) er single-chain bispecifikke antistof konstruktioner med dobbelt specificitet for CD3 på T-celler og en overflade antigen på målceller . De kan fremkalde en polyklonal cytotoksisk T-celle-respons, der er ikke begrænset af T-celle-receptor (TCR) specificitet, og overfladeekspression af MHC klasse I /peptid-antigenkomplekser. Brug human EpCAM /CD3-bispecifikke bid

® antistof konstruere AMG 110, vi her vurderet, i hvilket omfang overflade udtryk for PD-L1, cytoplasmatisk udtryk for indolamin-2,3-deoxygenase type 1, Bcl-2 og serpin PI- 9, og tilstedeværelsen af ​​transformerende vækstfaktor beta (TGF-β), interleukin-10 (IL-10) og adenosin i dyrkningsmedium kan påvirke omdirigeret lysis med AMG 110 i indgreb T-celler.

Metoder

De syv faktorer, som alle er involveret i at hæmme T-celle funktioner ved cancerceller, blev testet med humane EpCAM-udtrykkende kinesisk hamster ovarie (CHO) målceller på niveauer, der dem, der observeres i en række menneske i de fleste tilfælde oversteg cancercellelinjer. Co-kultur eksperimenter blev anvendt til at fastslå virkningen af ​​unddragelse mekanismer på EF

50 værdier og amplituden af ​​omdirigeret lyse med AMG 110 og på bid

® proliferation af tidligere hvilende humane perifere T-celler.

Resultater

en inhiberende virkning på omdirigeret lysis med AMG 110-engageret T-celler blev set ved overekspression af serpin PI-9, Bcl-2, TGF-βand PD-L1. En inhiberende virkning på induktionen af ​​T-celle proliferation blev kun set med CHO-celler overudtrykker IDO. I intet tilfælde, at en enkelt unddragelse mekanisme gjort målceller helt resistente bid

®-induceret lyse, og selv forskellige kombinationer kunne ikke.

Konklusioner

Vores data tyder på, at diverse mekanismer ansat ved kræftceller at afværge T-celler ikke kan inaktivere AMG 110-engageret T-celler, og at hæmmende virkninger observeret

in vitro

kan overvindes ved forhøjede koncentrationer af bid

® antistof konstruktion.

Henvisning: Deisting W, Raum T, Kufer P, Baeuerle PA, Münz M (2015) Virkningerne af Diverse Immune Evasion mekanismer af kræftceller på T-celler engageret af EpCAM /CD3-bispecifikke antistof Construct AMG 110. PLoS ONE 10 (10 ): e0141669. doi: 10,1371 /journal.pone.0141669

Redaktør: Lucienne Chatenoud, Université Paris Descartes, Frankrig

Modtaget: Januar 26, 2015; Accepteret: 12. oktober 2015; Udgivet: 28 Oktober 2015

Copyright: © 2015 Deisting et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Finansiering af denne undersøgelse er leveret af Amgen Inc., et offentligt noteret virksomhed, der gav støtte i form af lønninger til forfatterne WD, TR, PK og MM, men havde ikke nogen ekstra rolle i studie design, indsamling af data og analyse, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. AMGEN støttede denne undersøgelse, men på grund af en interesse i resultaterne af denne forskning. MPM Capital ydet støtte i form af en løn for forfatteren PAB, som tidligere var ansat af Amgen Research München, men havde ikke nogen ekstra rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. De specifikke roller denne forfatter artikuleres i »forfatter bidrag« afsnittet

Konkurrerende interesser:. Finansiering af denne undersøgelse er leveret af Amgen Inc., arbejdsgiver for Wibke Deisting, Tobias Raum, Peter Kufer og Markus Münz og den tidligere arbejdsgiver Patrick A. Baeuerle der nu ansat af MPM Capital. Alle forfattere har aktiepositioner i selskabet. Amgen er fokuseret på udviklingen af ​​bid antistoffer til behandling af maligne sygdomme. AMGEN er fremstilleren af ​​AMG 110. Udover AMG 110, der blev anvendt til denne undersøgelse bid platform besidder andre bid molekyler i støbeskeen og har ét produkt markedsføres opkaldt BLINCYTO. Forfatterne Tobias Raum, Peter Kufer, Markus Munz og Patrick A. Baeuerle holde forskellige patenter er relevante for bid-platformen, herunder et patent for AMG 110. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om deling af data og materialer som beskrevet online i vejledningen for forfattere.

Introduktion

Terapier engagerende en patients cytotoksisk T-celle respons har vist sig at effektivt at behandle og i sidste ende helbrede kræft. For eksempel adoptiv overførsel af ex vivo ekspanderede tumor-resident T-celler [1], inhibering af immun undslippe ved PD-1 /PD-L1 aksen ved monoklonale antistoffer (mAb’er) [2], intralæsional injektion af en onkolytisk virus [3], eller forbedre T-celle differentiering og nedbrydende regulatoriske T-celler ved CTLA-4-antagonistiske mAbs [4] har alle vist delvise og komplette responser i sen-fase melanom, en positiv indvirkning på progressionsfri eller samlet overlevelse, og langsigtet eftergivelse hvis ikke helbrede i en lille del af patienterne. I øjeblikket er responsrater på disse tilgange begrænset, hvilket er grunden til omfattende biomarkør programmer sigter mod at forstå modstand og flere kliniske programmer søger efter kombinationer potentielt stigende svarprocenter og langsigtede fordele. Alle de ovennævnte fremgangsmåder aktivere generation, ekspansion og systemisk spredning af tumorspecifikke T-cellekloner, der genkender cancerceller ved deres specifikke MHC klasse I /peptidkomplekser.

bid

® antistofkonstruktioner indgreb cytotoksisk T celler ved en fundamentalt anderledes mekanisme [5]. De bruger en opløselig adapter til at forbinde en overflade målantigen på cancerceller-as typisk genkendes af monoklonalt antistof terapier-med den invariante CD3e-underenheden af ​​enhver T-cellereceptor (TCR) på T-celler. Potentielt alle allerede eksisterende cytotoksiske T-celler i en patient kan bringes i indgreb med denne tilgang, hvoraf effektor memory T-celler synes at gøre den dominerende bidrag til antitumoraktivitet [6]. Med bid

® teknologi, T-celle genkendelse og aktivering er ikke længere afhængig af T-celle-kloner, der bærer en bestemt TCR, ikke på transport og ekspressionen af ​​MHC I molekyler til kræft celleoverfladen, eller på den proteolytiske produktion, transport og overflade visning af peptidantigener [5]. Den CD19 /CD3-bispecifikke blinatumomab har givet klinisk proof-of-concept, at denne ikke-naturlige engagement af T-celler er yderst effektiv og kan fremkalde i en stor del af alle og NHL patienter meningsfulde kliniske respons [7-9]. Blinatumomab (Blincyto

™) blev for nylig godkendt af FDA til behandling af patienter med Philadelphia kromosom-negative recidiverende /refraktær B-celle forløber ALL.

Her brugte vi AMG 110, et godt karakteriseret EpCAM /CD3 -bispecific BITE

® antistof konstruktion, der er klinisk testes i sene kræftpatienter med forskellige carcinomer [10, 11].

Kræftceller kan vælges under tumor progression for mange immun unddragelse mekanismer, som for eksempel kan påvirke MHC klasse i /peptidpræsentation [12, 13], eller at skabe, differentiering, overlevelse, migration og udvidelse af specifikke cytotoksiske T-celle-kloner. I den foreliggende undersøgelse, undersøgte vi, i hvilket omfang syv hyppige unddragelse mekanismer påvirker bid

® virkningsmekanisme, som potentielt kan engagere alle allerede eksisterende cytotoksisk T-celle hos patienter. Vi fokuserede derfor på disse mekanismer, der potentielt kan påvirke cytotoksisk T-celle ydeevne og venstre efter dem, for eksempel forringe specifik T-celle genkendelse af MHC I /peptidkomplekser. Til dette formål har vi etableret gnaver CHO cellelinier, der udtrykker human EpCAM som overflade målantigen der enten overudtrykker proteiner vides at have immun unddragelse potentielle eller hvor det immunsuppressive faktor blev sat til dyrkningsmediet. Potens og amplituden af ​​omdirigeret CHO-EpCAM målcellelysis og induktion af T-celleproliferation som respons på AMG 110 blev anvendt som udlæsninger for cytotoksisk T-celle ydeevne.

Med PD-L1, adenosin, IL-10 og TGF -β vi undersøgt faktorer ofte produceres af cancerceller som binder negative regulatoriske overfladereceptorer udtrykt på cytotoksiske T-celler. PD-L1 udtrykkes på overfladen af ​​tumorceller og forebyggelse af binding sin inhiberende receptor PD-1 på T-celler efter mAb-monoterapier viste sig at have en udtalt antitumoraktivitet i kliniske forsøg [14, 15]. Adenosin kan syntetiseres ved cancerceller og binder A2A og A3 adenosinreceptorer på T-celler, som kan inhibere effektorfunktioner [16, 17]. IL-10 betragtes som en anti-inflammatorisk cytokin med bred funktion. Fordi kræftceller kan secernere IL-10, har en rolle i udslip af immunosurveillance blevet tilskrevet IL-10 i tumorer [18]. Ved transkriptionel repression, TGF-β secerneres af cancerceller kan stort set nedmodulere effektor T-celle-funktioner, for eksempel ved at reducere ekspression af granzymer A og B, perforin og interferon-gamma (IFNy) ved receptorbinding [19]. Det cytoplasmatiske proteaseinhibitor serpin PI-9 kan blokerer direkte den enzymatiske aktivitet af granzym B, der til sidst afgives i cytosolen af ​​cancerceller gennem en cytolytisk synapse som dannes af T-celler [20]. Med Bcl-2, studerede vi et anti-apoptotisk cytosoliske protein, som kan nedsætte følsomheden af ​​cancerceller til induktion af apoptose ved granzym B [21]. Med IDO, vi undersøgt en katabolisk enzym, ved overekspression af cancerceller kan udsulte mikromiljø den essentielle aminosyre tryptophan og frigivelse immunosuppressive metabolitter, ligesom L-kynurenin eller 3-hydroxykynurenin, som kan tolerize T-celler [22, 23].

med undtagelse af IFNy-induceret IDO, alle andre unddragelse faktorer undersøgt på niveauer i transficerede CHO-celler, der langt oversteg dem, der findes i seks humane cancercellelinier. Trods studere naturligvis høje niveauer af unddragelse faktorer, har vi observeret kun beskedne virkninger af nogle på omdirigeret lysis og induktion af T-celleproliferation. I de fleste tilfælde kunne hæmmende virkninger opvejes af højere dosering af bid

® antistof konstruere AMG 110, eller vendes ved farmakologiske midler. Bid

®-engageret T-celler kan have potentiale til at være aktive mod kræftceller, der udtrykker en række hyppige immun unddragelse mekanismer.

Materiale og metoder

Reagenser

AMG 110 blev leveret af Amgen Research (München) GmbH. Den blev produceret ved rekombinant DNA-teknologi og oprenset via et C-terminalt hexa-histidin-mærke som tidligere beskrevet [24].

Antistoffer Salg

Følgende antistoffer blev anvendt. Til flowcytometri: muse-anti-humant PD-L1-APC (M1H1, eBiosciences), muse-anti-humant CD3-FITC (UCHT1; BD Biosciences), muse-anti-humant CD25-APC (M-A251, BD Biosciences), mus anti-human EpCAM (B302 /323 /A3, Abcam), ged anti-mus IgG (H + L) APC (Jackson Immuno Research), muse-anti-humant TGF-β-PE (9016; R for intracellulære FACS eller Western blot-analyse: muse-anti-humant PI-9 (7D8, Abcam), muse-anti-humant GrB-APC (GB11, BD Biosciences), muse-anti-humant Bcl-2 (100 /D5; Thermo Scientific) , muse-anti-humant β-actin (AC-15; Thermo Scientific), kanin-anti-human IDO (Abcam), ged anti-mus og anti-kanin HRP-koblet detektionsantistoffer (Thermo Scientific); stimulerende og neutraliserende antistoffer: muse-anti-human CD3 (OKT-3; Janssen-Cilag), muse-anti-humant CD28 (L293, BD Biosciences), muse-anti-humant TGF-β (1D11; R eBiosciences)

Byggeri, dyrkning og afprøvning af flugt protein og stabilt humane EpCAM-udtrykkende CHO cellelinier

Parental kinesisk hamster ovarie (CHO) celler, der udtrykker fuld -længde human EpCAM under kontrol af den EF1α promotoren (tilvejebragt af Amgen Research (München) GmbH) blev stabilt transficeret med en anden ekspressionsplasmid, der koder for enten human PI-9, IDO, Bcl-2, PD-L1, TGF-β1 , IL-10 eller den tilsvarende mock vektor. Bortset fra Bcl-2 (genereret af gensyntese, Geneart). Blev alle escape proteiner klonet fra humane cancercellelinjer

efterfølgende selektion og amplifikation af proteinekspression blev opnået ved tilsætning af methotrexat (Sigma-Aldrich), L-alanosine (TRC, Toronto) og DCF (Hospira). CHO EpCAM: undsluppet protein dobbelt-transfektanter blev dyrket i suspension i HyQ medium (HyClone) suppleret med 1% penicillin /streptomycin (Biochrom AG), 500 nM methotrexat, 10 mM HEPES (Biochrom AG), 1,1 mM adenosin (Sigma-Aldrich) , 50 uM L-alanosine, 1 mM uridin (Sigma-Aldrich) og 0,1-1 uM DCF ved 37 ° C i 5% CO

2 befugtet inkubator.

Ekspression af membranbundne proteiner EpCAM og PD-L1 og membranbundet TGF-β blev analyseret ved flowcytometri, ekspression af PI-9 af intracellulære FACS eller Western blot-analyse. Til sammenligning af ekspressionsniveauer blev den relative median (= median prøve /median kontrol) af prøverne beregnes. Ekspression af intracellulær IDO og Bcl-2 blev bestemt ved Western blot analyse og kvantificeret med Image J software. Ekspressionsniveauer af secernerede IL-10 og TGF-p-proteiner blev vurderet i cellesupernatanten 2,5x 10

5 /ml efter 48 timers dyrkning ved ELISA ved anvendelse Quanti Glo IL-10 ELISA-kit (R bd), fåre-anti-muse IgG-perler (Invitrogen) og Dynal magneter, eller ved at bruge MACS CD8

+ Isolation Kit (Miltenyi). T-celler blev stimuleret med plade-bundet anti-CD3 (OKT-3; Janssen-Cilag) og anti-CD28 (BD) antistoffer og 20 U /ml rekombinant human interleukin-2 (IL-2, Chiron Corperation Ltd) i RPMI1640-medium (Biochrom AG), suppleret med de samme ingredienser som anført ovenfor. Suppleret RPMI blev anvendt til dyrkning af T-celle og alle

in vitro

assays. Yderligere tilføjelser adenosin (Sigma-Aldrich), tryptophan (Sigma-Aldrich) rekombinante cytokiner (Miltenyi), eller neutraliserende antistoffer blev tilsat direkte til dyrkningsmediet ved begyndelsen af ​​inkubationstiden.

FACS-baserede cytotoksicitet analyser

Målceller blev mærket med Vybrant DIO eller gjorde (Life Technologies) fluorescerende membran farvestof, justeret til 1,25x 10

5 celler /ml og co-inkuberes i 96-brønds plader med frisk isolerede CD3

+ -T effektorceller ved et effektor-til-mål (E: T) forhold på 4: 1 eller med præ-stimuleret CD8

+ T effektorceller ved et E: T-forhold på 1: 1 i nærvær af AMG 110 seriel fortynding. Yderligere tilsætninger blev tilsat direkte til assaymediet. Inkubation blev udført ved 37 ° C, i et CO 5%

2 fugtig atmosfære. Efter 24-72 timer, levende og døde celler blev opsamlet, resuspenderet i PBS /2% FCS med 1 ug /ml propidiumiodid (PI) (Sigma-Aldrich), og analyseret i en FACS Canto

™ II flowcytometer ( Becton Dickinson) udstyret med FACSDiva software. Cytotoksicitet blev bestemt i duplikater ved at kvantificere de mærkede og PI positive ikke-levedygtige målceller og de mærkede PI negative målceller. Procentdel af lyse blev analyseret med hensyn til at bide

® koncentration ved hjælp Prism 5 software (GraphPad). Analyse med Prism 5 omfattede oprettelsen af ​​sigmoidale dosis-respons kurver, beregning af EF

50 værdier samt bestemmelse af top og bund procentdel af bid

®-afhængige lyse til beregning af lysis amplitude for et givet tidspunkt. For at sammenligne virkningen af ​​escape proteiner på bid

®-induceret omdirigeret lysis relative ændring i EF

50 blev beregnet ved formlen: (EF

50 værdier udgangsveje transfektanter) /(EF

50 værdier for forældrekontrol celler) og relative ændring i amplitude værdier ved (amplituden af ​​Flugt transfektanter) /(amplituden af ​​forældrekontrol celler). Hver assay blev mindst udført i dubletter.

CFSE-baserede proliferationsassays

For at vurdere proliferative potentiale af T-celler i tilstedeværelsen af ​​immun escape proteiner, T-celler blev mærket med carboxyfluoresceine diacetat succinimidyl esther (CFSE) i henhold til fabrikantens instruktioner (Molecular Probes). Mærkede T-celler blev co-inkuberet med CHO-cellelinjer, der stabilt udtrykker EpCAM og en af ​​unddragelse proteiner eller kontrolceller +/- adenosin i en inkubator med 37 ° C, 5% CO

2 atmosfære i 120 timer i 48-brønds fladbundede plader (Nunc) i nærvær eller fravær af 1 ug /ml AMG 110. antallet af T-celler blev holdt konstant på 1 x 10

4. CHO-celler blev vasket to gange for at fjerne selektionsmedium og blev justeret til E: T-forhold på 1: 8, 1: 1 og 4: 1. Efter inkubationsperioden blev proliferation af CD3

+ T-celler bestemmes ved at overvåge CFSE fordeling ved flowcytometri under anvendelse af en FACS Canto

™ II flowcytometer og FACS DIVA

™ software. Efterfølgende analyse blev udført under anvendelse FlowJo 7.6.5 software. Alle analyser blev udført i det mindste i dubletter.

Statistisk analyse

Statistisk analyse af EF

50 værdier og amplituder betydelige outliers blev udelukket med Grubb test. Bagefter blev p-værdier beregnet med Prism 5 (GraphPad Software) hjælp uparrede t-tests med Welch korrektion.

Resultater

CHO cellelinier udtrykker høje niveauer af menneskelige immun skatteunddragelse faktorer

stabilt transficerede humane EpCAM-udtrykkende CHO-celler blev karakteriseret for ekspressionsniveauer af humane immun unddragelse proteiner i forhold til naturlige niveauer, der findes i seks human cancer cellelinjer A549 (lunge), BxPC3 (prostata), KATOIII (gastrisk), SKBR3 (bryst), SW480 (colorectal), og A431 (hud). For IDO og PD-L1, cancerceller var desuden stimuleret i 48 timer med 1000 U /ml IFNy, som vides at inducere proteinerne [30, 31]. Forskellige fremgangsmåder blev anvendt til at kvantificere og sammenligne ekspressionsniveauer, herunder FACS (for serpin PI-9, PD-L1, EpCAM og TGF-β), ELISA (for TGF-β og IL-10) og Western blotting (for Bcl-2 og IDO, se analyser i S1 fig). Western blot-analyser bekræftede den korrekte molekylære størrelse og anvendelse af specifik påvisning antistoffer identiteten af ​​de respektive proteiner i cancercellelinier og transficerede CHO-celler. Et resumé af ekspression data viser, at adskilte fra IDO efter stimulering af A431, A549, BxPC3 og KATOIII celler med IFNy-i alle tilfælde unddragelse proteiner blev udtrykt i stabilt transficerede CHO-celler til et meget højere niveau end i de seks cancercellelinier. Ekspressionen af ​​målantigenet EpCAM i de fleste cellelinier (A431, BxPC3 og KATOIII, SKBR3 og SW480) var i området fra CHO transfektanter (faktor 2-9 gange mindre), mens A549 viste kun moderat EpCAM ekspression (50x mindre end transficerede CHO celler) (tabel 1).

IDO viste udtalt hæmmende effekt på AMG 110-induceret T-celleproliferation

AMG 110 og andre bid

® antistof-konstruktioner har kapacitet til at potent aktivere T-celler, men kun i tilstedeværelse af target-celler [32]. Vi her undersøgte effekten af ​​syv immun escape faktorer på initiering af T-celle proliferation af AMG 110 på tre forskellige effektor at målrette (E: T) nøgletal efter co-kultur i 120 timer. I mangel af AMG 110, ingen af ​​de transficerede eller kontrol CHO cellelinier fremkaldte en proliferation af CD3

+ T-celle population inden tilsatte perifere mononukleære celler (PBMC’er) som overvåges ved FACS ved anvendelse CSFE farvning (figur 1). I nærvær af 1 ug /ml AMG 110, kontrol CHO-EpCAM-celler (sorte) samt CHO-celler med unddragelse faktorer (rød) udviste kraftig T-celleproliferation signaler, der indikerer flere runder af cellecyklus (Fig 1). Noget stærkere signaler blev observeret med stigende E: T-forhold (sammenlign E: T-forhold på 1: 8 med 4: 1). En væsentlig forskel mellem kontrol og unddragelse faktor blev kun bemærket for celler, der udtrykker IDO. På alle tre E: T-forhold, kunne AMG 110 knapt inducere T-celleproliferation i CHO-EpCAM-celler stabilt transficeret med humant IDO cDNA. En manglende virkning af TGF-β og IL-10 blev bekræftet ved tilsætning af rekombinante faktorer til dyrkningsmediet (se S2A Fig). Til eksperimenterne blev tre forskellige humane PBMC donorer anvendt. en af ​​dem viste en svagere AMG 110 afhængig proliferation (se adenosin ET = 1: 1 og 4: 1).

humane CD3

+ T-celler blev mærket med CFSE og co-dyrket ved effektor og mål (E: T) forhold på 1: 8, 1: 1 og 4: 1 i 48-brønds plader med CHO cellelinier, der udtrykker human EpCAM, og en af ​​de seks stabilt transficerede immune unddragelse proteiner (PI-9, Bcl-2, IDO , IL-10, TGF-β eller PD-L1) (rød), eller med forældrenes EpCAM

+ CHO-celler i nærvær af 1 mM adenosin (ADO) i dyrkningsmediet (sort: parentale celler). CFSE signaler i celler blev analyseret ved flowcytometri. For hver unddragelse protein er vist et repræsentativt eksperiment. Co-kultur i fravær af AMG 110 ikke gav CSFE signaler, medens co-kultur i nærvær af 1 ug /ml AMG 110 viste celledelingscykluser påvirket af E: T-forhold. Tre forskellige humane PBMC blev anvendt.

Serpin PI-9, TGF-β, Bcl-2 og PD-L1 reducere styrken af ​​omdirigeret target lysis af AMG 110

Med renset CD8

+ T-celler fra raske humane PBMC donorer, AMG 110 dosisrespons analyser for omdirigeret lysis sammenlignet EF

50 værdier og procentdelen af ​​lysis mellem CHO-EpCAM kontrolceller (sort) og målceller i nærvær af stabilt udtrykt eller tilsatte unddragelse faktorer (rød) (Fig 2). Co-kultur var i 24 timer ved et E: T-forhold på 1: 1. Afhængigt af T-celle donorer, basale EF

50 værdier for omdirigeret lysis varierede mellem 5 og 200 pg /ml AMG 110. Procentdelen af ​​cellelysis varierede mellem 40 og 90%. Diskrete forskydninger af dosisresponskurver til højere EC50-værdier og lavere procentdele af lysis blev bemærket i adskillige unddragelse faktorer (figur 2A). Dog i intet tilfælde har tilstedeværelsen af ​​en unddragelse faktor ophæve omdirigeret lyse. En kvantificering af resultaterne er vist i figur 2B og 2C.

AMG 110 dosisafhængig lysis blev sammenlignet mellem parentale EpCAM

+ CHO-celler og EpCAM

+ CHO-celler stabilt transficeret med en af ​​seks humane Evasions proteiner eller i tilstedeværelse af 1 mM adenosin. Humant CD8

+ T-celler blev anvendt som effektorceller ved et E: T-forhold på 1: 1. Procentdel af målcellelysis efter co-kultur i 24 timer og EF

50 værdier fra sigmoidale dosis-respons responskurver blev bestemt i et FACS-baseret cytotoksicitet assay. (A) repræsentant dosisresponskurver er vist for parental EpCAM

+ CHO-celler (sort) og EpCAM

+ CHO-celler, der udtrykker unddragelse proteiner eller inkuberet i nærvær af 1 mM adenosin (rød). (B) Mean EF

50 værdier for omdirigeret lysis blev beregnet ud fra det angivne antal uafhængige forsøg. Den relative ændring i EC

50 værdier for lysis blev bestemt ved at dividere middelværdien af ​​EF

50 værdier fra unddragelse betingelser ved middelværdien af ​​EF

50 værdier fra kontrolbetingelser. Fejl- søjler repræsenterer SEM-værdier. (C) Relative ændringer i procentdelen af ​​målcellelysis efter 24 timer ved plateauet af dosisresponskurver. Den gennemsnitlige amplitude af lysis under unddragelse betingelser blev divideret med den gennemsnitlige amplitude af lysis under kontrolbetingelser. Fejl søjler repræsenterer SEM-værdier.

Den stærkeste hæmmende effekt på styrken af ​​omdirigeret lyse blev set med granzym B hæmmer serpin PI-9 viser en gennemsnitlig 18-dobling i EF

50 værdier (fig 2A og 2B), med en tendens til statistisk signifikans (p = 0,07, N = 5). Næststærkeste var virkningen af ​​overfladeekspression af PD-L1 på CHO-EpCAM-celler med a 5-gange reduktion i styrke nå statistisk signifikans (p = 0,04, N = 7). Ekspression af TGF-β inducerede en 3-ganges reduktion i styrken af ​​lysis med en stærk tendens (p = 0,06, N = 5). En inhiberende virkning blev bekræftet ved tilsætning af rekombinant TGF-β til dyrkningsmediet af CHO-EpCAM kontrolceller (se S2B Fig). Den 4-fold inhiberende virkning af Bcl-2 på EF

50 værdien af ​​lysis viste en svag tendens (p = 0,09, N = 3), og en statistisk signifikant omend lille reduktion (se fig 2C) i procentdel af lyserede celler (p = 0,01; N = 4). Ingen af ​​de andre effekter på effekten af ​​lyse eller procentdelen af ​​lyserede celler, der er beskrevet i figur 2 nåede statistisk signifikans eller viste en stærk tendens (S3A og S3B Fig). Lignende resultater blev opnået, når CD3

+ T-celler blev anvendt i stedet for CD8

+ T-celler som effektorceller cellepopulation (se S4 Fig).

De inhibitoriske aktiviteter af IDO, PD-L1, og TGF-β kan vendes ved farmakologiske midler

IDO var den eneste unddragelse faktor i denne undersøgelse fører til stærke hæmning af AMG 110-induceret T-celleproliferation (se figur 1). For at demonstrere, at inhiberingen skyldtes den enzymatiske aktivitet af IDO, vi sat 0,5 uM tryptophan til cellekulturmediet og analyseret cellecyklus ved CFSE-baserede FACS. Som vist i fig 3A, opfyldning med tryptophan fuldstændigt vendt inhibering af AMG 110-induceret cellecyklus i IDO-udtrykkende CHO-EpCAM-celler.

(A) Analyse af CD3

+ T-celleproliferation efter 120 h af co-kultur med kontrol EpCAM

+ CHO-celler og IDO-udtrykkende, EpCAM

+ CHO-celler i nærvær eller fravær af 500 uM tryptophan (trp) med og uden 1 pg /ml AMG 110. (B ) dosisafhængig, omdirigeret målcellelysis af parental EpCAM

+ CHO-celler og EpCAM

+ CHO TGF-β transfektanter +/- 50 pg /ml TGF-β neutraliserende anti-human TGF-β-antistof i nærvær af AMG 110 og CD3

+ T-celler i et E: T-forhold på 4: 1 efter 72 timer inkubation. (C) Dosisafhængig omdirigeret målcellelysis af kontrol EpCAM

+ CHO-celler og EpCAM

+ CHO PD-L1 transfektanter med og uden 5 pg /ml af et anti-humant PD-L1-neutraliserende antistof i tilstedeværelse af AMG 110 og præ-stimuleret CD8

+ T-celler. E: T-forholdet var 1: 1, assayet varighed 24 timer

Den inhiberende virkning ses efter ekspression af TGF-β på omdirigeret lysis af målceller, der udtrykker og secernerer humant TGF-β kunne være. vendt i nærvær af 50 pg /ml af en neutraliserende anti-TGF-β-antistof (fig 3B). Den reducerede lyse af PD-L1, der udtrykker CHO-EpCAM-celler ved AMG 110 fuldt ud kunne tilbageføres i nærvær af 5 pg /ml af en antagonistisk anti-PD-L1-antistof (Fig 3C). Anti-TGF-β og anti-PD-L1-antistoffer eller PI-9 inhibering med shRNA havde ingen effekt på lysis af cancer cellelinjer, der udtrykker de respektive unddragelse faktorer på lavt niveau (se S4D, S4E og S4F Fig).

Omdirigeret målcellelysis observeres, selv om alle syv unddragelse mekanismer er til stede i co-kultur

Adskillige unddragelse faktorer undersøgt i dette studie kan virke i

trans

, såsom TGF-β, IL-10, PD-L1, IDO og adenosin. Kun Bcl-2 og serpinresistente PI-9 proteiner, som er begrænset til cytoplasmaet i kræftceller, kan ikke. Vi her forsøgt at skabe i co-kultur en immunosuppressiv miljø ved at have alle syv faktorer til stede på samme tid. I én tilstand, hver af de seks transficerede CHO-EpCAM cellelinjer var til stede på det samme nummer og 1 mM adenosin tilsat til dyrkningsmediet. Selv under denne betingelse, blev omdirigeret lyse stadig observeret (figur 4). Men en væsentlig indvirkning på den procentdel af lysis var tydelig med et stigende antal faktorer kombineret. Konsekvenserne for EF

50 værdi på lyse viste en tendens og ikke overstige 7 gange reduktion.

Parental menneskelig EpCAM

+ CHO celler og forskellige kombinationer af EpCAM

+ CHO