PLoS ONE: En MicroRNA-7 Binding site Polymorfi i HOXB5 fører til Differential genekspression i Blære Cancer

Abstrakt

Formål

For at undersøge den biologiske funktion af HOXB5 i human blærecancer og udforske hvorvidt HOXB5 3′-UTR SNP (1010A /G), som er placeret inden for microRNA-7 bindingssted, blev korreleret med kliniske symptomer på blærekræft.

Metoder

Angivelse af HOXB5 i 35 humane blære kræft væv og 8 cellelinier blev undersøgt ved hjælp af real-time PCR og immunhistokemi. Dernæst vi undersøgt den biologiske funktion af HOXB5

in vitro

hjælp celleproliferation, migration og kolonidannelse analyser. Brug af bioinformatik, en SNP (1010A /G) fandtes placeret i microRNA-7 bindingssted i 3′-UTR af HOXB5. Real-time PCR blev anvendt til at teste HOXB5 ekspression påvirkes af forskellige alleler. Endelig blev multivariat logistisk regressionsanalyse anvendes til at bestemme forholdet mellem SNP (1010A /G) frekvens og kliniske funktioner i 391 tilfælde.

Resultater

HOXB5 blev ofte over-udtrykkes både i blærekræft væv og cellelinier. Inhibering af HOXB5 undertrykt den onkogene funktion af cancerceller. Dernæst viste vi, at en SNP (1010A /G), som ligger i microRNA-7 bindingssted i 3′-UTR af HOXB5, kan påvirke HOXB5 udtryk i blærekræft hovedsageligt ved differentiel bindende aktivitet af microRNA-7 og SNP-relaterede mRNA-stabilitet. Endelig viste vi også hyppigheden af ​​1010G genotype var højere i kræft gruppen sammenlignet med normale kontroller og korreleret med risikoen for høj kvalitet og høj scene.

Konklusion

HOXB5 er overudtrykt i blærekræft . En miRNA-bindende SNP (1010A /G), der ligger inden for 3′-UTR af HOXB5 er forbundet med genekspression og kan være en lovende prognostisk faktor for blærekræft

Henvisning:. Luo J, Cai Q, Wang W , Huang H, Zeng H, He W, et al. (2012) En MicroRNA-7 Binding site Polymorfi i HOXB5 fører til Differential genekspression i blærekræft. PLoS ONE 7 (6): e40127. doi: 10,1371 /journal.pone.0040127

Redaktør: Lorenzo Chiariotti, Università di Napoli Federico II, ITALIEN

Modtaget: Marts 21, 2012; Accepteret: 1 Jun 2012; Udgivet: 29 juni, 2012 |

Copyright: © 2012 Luo et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (81071688, 30972983, 81172431, 91029742), Guangdong-provinsen Natural Scientific Foundation (07117366, 6104605), Yat-sen Scholarship for Unge Forskere (for Tianxin Lin), Klinisk Key Projekt for Folkesundhed Ministeriet (for Jian Huang), og programmet for New Century Excellent Talenter i University (NCET-10-0852, for Tianxin Lin). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Urinary blærekræft er den mest almindelige urologisk tumor i Kina [1]; Men mekanismerne i blærekræft tumorigenese er ikke blevet godt illustreret. Data viser, at de fleste af de blære kræft induceres af carcinogener, der skader DNA. Følsomheden af ​​den overgangsperiode epitel s mikromiljø kan være en anden vigtig faktor under tumorigenese [2]. Onkogener og tumor suppressorer er også blevet rapporteret at spille vigtige roller i blærekræft [3]. For nylig er der fundet genetiske ændringer, herunder SNP’er, deletioner, insertioner og ændringer i DNA kopital at være involveret i blæren carcinogenese.

A homeobox (HOX) er en sekvens på ca. 180 nukleotider i gener, der koder for et proteindomæne kaldet homeodomæne. Undersøgelser viste, at HOX-gener udgør så meget som 0,1-0,2% af hele hvirveldyr genomet [4]. HOX-gener er stærkt konserverede over store evolutionære afstande og koder kerneproteiner, der fungerer som transkriptionsfaktorer (TF) under normal organudvikling [5]. I de senere år har HOX genfamilien også blevet forbundet med humane sygdomme især cancere. For eksempel, tab af HOXA5 i brystkræft [6], overekspression af HOXA10 i akut myeloid leukæmi (AML) [7], genmutationer af HOXD4 i nyre- og tyktarmskræft [8] og overekspression af HOXC4 i human blærekræft [ ,,,0],9] er blevet rapporteret. HOXB5 (NM_002147.3), som ligger på humant kromosom 17, er et medlem af HOX-genfamilien, der er involveret i normal lunge og tarm udvikling i muse og human [10]. HOXB5 er blevet rapporteret at være relateret til menneskelige sygdomme, herunder AML [11], medfødt cystisk adenomatoid misdannelser (CCAM) [12] og bronkopulmonal binding (BPS) [13]. Desuden blev HOXB5 genet sig at være stærkt udtrykt i kræft i æggestokkene og blev anset for at være et vigtigt potentielle mål i behandlingen af ​​ovariecancer [14]. Den biologiske funktion af HOXB5 i urologiske carcinomer er ikke blevet rapporteret. I en pilotundersøgelse, fandt vi, at HOXB5 var ofte overudtrykt i humane blærekræft væv og cellelinjer, hvilket tyder på, at det kan være en kandidat onkogen i blærekræft.

I de seneste ti år, inddragelse af microRNA (miRNA) i humane kræftformer er blevet bredt undersøgt. MiRNA undertrykke ekspressionen af ​​target mRNA ved at binde til den 3′-utranslaterede region (3′-UTR) af mRNA’et. I human blærecancer, havde miRNA vist sig at være vigtige faktorer under tumorigenese. I en tidligere undersøgelse, rapporterede vi, at miRNA-143 og miRNA-125b fungerede som tumorsuppressorer i human blærekræft [15], [16]. I en anden undersøgelse blev det rapporteret, at MIR-7 blev nedreguleret i blærekræft og kan undertrykke tumorvækst ved at inhibere vækst faktor receptor-ekspression og ved at ødelægge den anti-apoptotiske Akt pathway [17].

Single-nukleotid (SNP’er), den mest almindelige form for genetiske variationer i det humane genom, bidrager til forskellige humane fænotyper. SNP’er har været forbundet med mange humane sygdomme, især cancere. I de senere år SNPs beliggende inden for miRNA-bindende site af en miRNA target (også kaldet miRNA-bindende SNP) har vist sig at være vigtigt i tumorigenese. I en tidligere undersøgelse, vores gruppe foreslog, at SNP (1805C /T) i MIR-181a bindingssted Mel-18-genet var relateret til nogle kliniske træk ved prostatacancer [18]. I en pilotundersøgelse, vi fandt en mulig miRNA-bindende SNP (1010A /G) i 3′-UTR af HOXB5 genet under anvendelse af NCBI SNP database (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/) og miRBase (https://www.mirbase.org/).

i denne undersøgelse viste vi, at HOXB5 genet var overudtrykt og fungerede som et onkogen i human blærekræft. Vi fandt også en SNP (1010 A /G) i 3′-UTR af HOXB5 genet, som er inden for miRNA-7 bindingssted. Vi har vist, at denne SNP kan påvirke ekspressionen af ​​HOXB5 hovedsagelig ved at interferere med funktionen af ​​miRNA-7 og SNP-relaterede mRNA-stabilitet; Endvidere frekvensen af ​​1010G genotype var højere i cancer-gruppen sammenlignet med normale kontroller, og viste sig at være korreleret med risiko for høj kvalitet og høj fase. Til vores viden, dette er den første undersøgelse af inddragelse af polymorfier i miRNA bindende site af HOXB5 i human blærekræft.

Materialer og metoder

Patienter og væv

391 blære cancer patienter i vores undersøgelse. Denne undersøgelse blev godkendt af Institute Research Ethics, Sun Yat-sen University, Kina. Informeret samtykke blev skrevet og fået fra alle fag i vores undersøgelse. Alle patienterne havde primær blære kræftformer; ingen tidligere behandling var blevet udført før operationen. Kræft prøver blev opnået fra patienter, som gennemgik resektion af blærecancer. Prøverne blev indsamlet mellem 2007 og 2010 ved Institut for Urology, Sun Yat-sen Memorial Hospital, Sun Yat-sen University, Guangzhou, Kina og Institut for Urologi, Southwest Hospital, Chongqing, Kina. Alle blære prøver blev straks lynfrosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -80 ° C. Histologi af væv blev uafhængigt evalueret af to patologer, og den kliniske fase af blærekræft blev bestemt ved hjælp af 2002 tumor-node-metastaser (TNM) klassifikationssystem.

cellelinjer og Cell Culture

Cellelinjer der anvendes i vores undersøgelse blev opnået fra American Tissue Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA); de omfatter T24, 5637, TCCSUP, HT-1376, UM-UC-3, J82, RT4, EJ og SV40-transformerede nyrecellelinie 293T. Cellerne blev dyrket i en fugtig luft atmosfære af 5% CO2 ved 37 ° C, og alle medier blev suppleret med 10% føtalt bovint serum (Hyclone, Logan, UT, USA). T24 blev dyrket i McCoys 5a medium (modificeret); 5637 blev dyrket i RPMI 1640 medium; J82, UM-UC-3, TCCSUP og HT-1376 blev dyrket i Eagles minimale essentielle medium (EMEM) (Hyclone); og RT4, EJ og SV40-transformeret nyrecellelinie 293T blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) (Hyclone).

RNA-ekstraktion og kvantitativ real-time PCR

Totalt RNA blev ekstraheret fra patienternes blære prøver eller cellelinjer under anvendelse af TRIzol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, Californien, USA) ifølge producentens protokol. Kvantitativ real-time PCR (qPCR) blev gjort ved hjælp af SYBR grønne assay (Takara Biotechnology, Dalian, Kina) på et Roche LightCycler 480 maskine (Roche Applied Science, Mannheim, Tyskland). qPCR blev udført som følger: en indledende prædenaturering trin i 30 sekunder ved 95 ° C, efterfulgt af amplifikation af 40 cyklusser ved 95 ° C i 5 sekunder og ved 60 ° C i 20 sekunder blev smeltekurveanalyse udføres ved afslutningen. Alle reaktioner blev udført i et 20 pi reaktionsvolumen i tre eksemplarer. Ekspressionsniveauet af HOXB5 blev evalueret ved brug af sammenlignende Ct-metoden. GAPDH blev anvendt som en intern kontrol. Primerne anvendt til HOXB5 var: sense, 5′-TGAAGCACAGGGTTATAACGACCA-3 ‘, antisense, 5’GCAGCGGGATCCCTGTAAGA-3’; og for GAPDH var primerne:. sense, 5’GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3 ‘, antisense, 5’GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’

Immunhistokemi

paraffinindlejrede, formalin-fikserede væv blev skåret i 5-um snit, placeret på en polylysin-coated objektglas, afparaffiniseret i xylen, rehydreret under anvendelse gradueret ethanol, standset for endogen peroxidaseaktivitet i 0,3% hydrogenperoxid og forarbejdet til antigen-genvinding ved mikrobølgeopvarmning i 10 mM citratpuffer (pH 6,0) . Snit blev inkuberet ved 4 ° C natten over med HOXB5 kanin-polyklonalt antistof (1:100, ABCAM, Cambridge, MA, USA). Immunfarvning blev udført under anvendelse af ChemMate ™ DAKO EnVision ™ Detection Kit (DakoCytomation, Glostrup, Danmark), hvilket resulterede i et brunt bundfald ved antigen site. Efterfølgende blev snit modfarvet med hematoxylin (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA, USA) og monteret i ikke-vandigt monteringsmedium. Det primære antistof blev udeladt for negative kontroller.

Western Blot

Protein blev ekstraheret fra blærekræft væv og cellelinier som beskrevet [19]. Kort beskrevet 30 ug protein fra hver prøve blev separeret ved elektroforese i en natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgel før det overføres til polyvinylidenfluorid membraner (Millipore, Billerica, MA, USA) i 2 timer. Derefter blev membranerne blokeret i 1 time ved stuetemperatur under anvendelse af 5% bovint serumalbumin (BSA) og inkuberet i TBST (Tris-bufret saltvand med 0,05% Tween) indeholdende kanin-polyklonalt IgG2a-anti-HOXB5 (1:1000, ABCAM) eller GAPDH (1:1000, Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA) natten over ved 4 ° C. Membranerne blev inkuberet med peroxidase-konjugeret gede-anti-kanin-immunglobulin (1:5000, Cell Signaling Technology) som sekundært antistof og derefter visualiseret under anvendelse af et kommercielt ECL kit (Pierce, Rockford, IL, USA).

Cell Transfektion med si-HOXB5 og miRNA-7

siRNA’er designet til HOXB5 og miRNA-7 efterligner blev transficeret ind i blæren kræftceller T24, 5637 og TCCSUP hjælp lipofectamin-RNAiMAX (Invitrogen). Sekvenserne, der anvendes til si-HOXB5 var, sense: 5′-GGAUGGACCUCAGCGUCAATT-3 ‘, antisense: 5′-UUGACGCUGAGGUCCAUCCTT-3′; for MIR-7 efterligner, sense: 5’-CAACAAAUCACAGUCUGCCAUA-3 ‘, antisense: 5′-UAUGGCAGACUGUGAUUUGUUG-3′; og for den negative kontrol, sense: 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ‘, antisense: 5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’. Alle RNA oligoribonukleotider blev købt fra Genepharma (Shanghai, Kina). En dag før transfektion, 2 × 10

5-celler podedes på en seks-brønds plade. Den næste dag, når cellerne nåede 70-80% konfluens, blev de transficeret med RNA ved en slutkoncentration på 100 nM ifølge lipofectamin-RNAiMAX protokol. Den transfektion effektivitet målt ved qPCR, var 70% for T24, 72% for 5637 og 75% for TCCSUP (data ikke vist).

celleproliferationsassay

Menneskelig blære kræft cellelinjer T24, 5637 og TCCSUP blev udpladet på plader med 6 brønde og inkuberet ved 37 ° C i en 5% CO2 inkubator en dag før transfektion. Efter transfektion med siRNA’er (100 nM) eller en negativ kontrol i 24 timer, blev cellerne opsamlet og udpladet på 96-brønds plader til evaluering cellernes levedygtighed under anvendelse af en CCK8 assay (Cell Counting Kit-8) (Dojindo Laboratories, Japan) ifølge protokollen [20].

In vitro

cellemigrationsassay

Efter blærekræft cellelinjer T24, 5637 og TCCSUP blev transficeret med si-HOXB5 (100 nM) eller uspecifik kontrol (NC) siRNA i 24 timer blev cellerne høstet og suspenderet i 100 pi serumfrit medium og dernæst udpladet (1 x 10

4 celler) i det øvre rum af Transwell-plader (Corning, NY, USA ). Transwell inserts blev derefter anbragt i det nedre kammer af et 24-brønds plade indeholdende 600 pi af mediet med 20% FBS som kemo-tiltrækningsstof. Efter en 24 timers inkubationsperiode blev cellerne forbliver på den øverste overflade af membranen fjernet, og cellerne på den nedre overflade blev fikseret i 100% methanol i 30 minutter, efterfulgt af farvning med 0,1% krystalviolet opløsning i 30 minutter. Celler, farvede lilla blev defineret som positiv, og billederne blev taget med et mikroskop (10 ×) (Olympus, Center Valley, PA, USA).

Colony Formation Assay

Efter transfektion med si -HOXB5 (100 nM) eller NC siRNA i 24 timer, de humane blære cancerceller T24, 5637 og TCCSUP blev opsamlet og anbragt på en frisk seks-brønds plade (500 celler til T24, og 1000 celler for 5637 og TCCSUP). Cellerne blev dyrket i omkring 2 uger til at danne kolonier. Kolonier blev fikseret med 100% methanol og farvet med 0,1% krystalviolet i 20% methanol i 15 minutter. Kolonidannende effektivitet blev beregnet som kolonier /forgyldt celler × 100%.

Bioinformatik

NCBI SNP-databasen (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/) blev anvendt til at finde SNPs beliggende inden for 3′-UTR af HOXB5 genet. Fire offentligt tilgængelige algoritmer, PicTar (https://pictar.mdc-berlin.de/), Targetscan (https://www.targetscan.org/), Miranda (https://www.microrna.org/) og Diana microT (https://diana.pcbi.upenn.edu/) blev anvendt til at forudsige, hvilken af ​​de humane miRNA i miRBase (https://www.mirbase.org/) kan binde til 3′-UTR af HOXB5. De miRNA, der blev forudsagt af mindst 2 af de algoritmer til at binde blev accepteret som kandidater til yderligere undersøgelse. MRNA’et sekundær struktur forudsigelse værktøj MFOLD (https://mfold.rna.albany.edu/) blev anvendt til at forudsige den sekundære struktur af HOXB5 mRNA. Lille minimal fri energi (MFE) angiver høj stabilitet af den forudsagte mRNA sekundære struktur.

Luciferase Reporter Assay

Vi konstruerer luciferase reporter plasmider med HOXB5 3′-UTR fragment, der indeholdt den formodede binding sites for kandidaten miRNA og subklonet dem i psiCHECK-2-vektoren (Promega, Madison, WI, USA) for at fremstille psiCHECK-2-3′-UTR-WT plasmid. Mutanten HOXB5 3′-UTR blev dannet ved anvendelse af fusion PCR-fremgangsmåden og derefter det også subklonet i psiCHECK-2 Vektor at producere psiCHECK-2-3′-UTR-MUT plasmid. DNA-sekventering analyse blev anvendt til at bekræfte sekvensen af ​​de konstruerede plasmider.

I luciferase reporter assay, HEK-293T-celler (2 x 10

4) blev anbragt på en plade med 24 brønde dagen før transfektion. Den næste dag 0,5 ug af enten psiCHECK-2-3′-UTR-WT eller psiCHECK-2-3′-UTR-MUT, og enten miRNA eller den negative kontrol blev cotransficeret ind i HEK-293T-celler ved hjælp af lipofectamin 2000 ( Invitrogen). Assays blev udført 48 timer efter transfektion under anvendelse af Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega). Luciferaseaktivitet blev detekteret under anvendelse af GloMax-Multi Detection System (Promega). De Renilla luciferase signaler blev normaliseret til den interne ildflueluciferase transfektion kontrol. Transfektioner blev udført i tre eksemplarer på uafhængige forsøg.

DNA Udvinding og HOXB5 Genotypning Analyse

I alt DNA blev ekstraheret fra patienternes blærekræft prøver og cellelinjer hjælp QIAamp reagens (QIAGEN, Germantown, MD , USA) ifølge producentens protokol. HOXB5 genotypebestemmelse blev udført ved anvendelse af en DNA-sekventering assay. En 334 bp DNA-fragment indeholdende SNP i 3′-UTR af HOXB5 genet blev amplificeret fra genomisk DNA. PCR anvendte primere var, fremadrettet 5′-GCGCATGAAGTGGAAGAAGG-3 ‘, revers 5′-TTGGGACAAGCAGAAGGGAG-3’. Det amplificerede DNA fragment blev sekventeret ved hjælp GENESCAN software (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).

Måling af ekspression af HOXB5 mRNA

HOXB5 mRNA niveau blev målt i tre blærekræft cellelinier (5637, J82 og RT4) og 13 blærekræft væv. Områdespecifikke Taqman prober blev designet til at detektere SNP i 3′-UTR af HOXB5 mRNA. CDNA’et fra cellelinjer og cancer væv blev underkastet qPCR og fluorescensen (VIC for 1010A, FAM for 1010G) blev målt ved anvendelse LightCycler 480 Prober Master (Roche Applied Science, Mannheim, Tyskland).

Genomisk DNA blev også ekstraheret fra cellelinjer og cancervæv som nævnt. Som en indre kontrol blev qPCR udført for at bestemme de genomiske DNA-niveauer af HOXB5 anvendelse af de samme områdespecifikke Taqman prober.

HOXB5 mRNA Halveringstid

qPCR blev også anvendt til at måle den halve -Life af HOXB5 mRNA. 1 × 10

6 T24 og TCCSUP blære cancerceller blev udpladet på en 10 cm skål én dag før actinomycin D (5 ug /ml), som inhiberer genetisk transskription, blev tilsat til cellerne. Efter behandlet med actinomycin D blev cellerne lyseret under anvendelse af TRIzol på forskellige tidspunkter, 0 timer, 4 timer, 8 timer, 12 timer, 24 timer og 48 timer. Totalt RNA blev ekstraheret og HOXB5 mRNA niveau blev kvantificeret ved qPCR hjælp af Taqman assay som tidligere beskrevet ovenfor.

Statistik

Alle data er udtrykt som middelværdi ± SEM fra mindst tre separate forsøg . Forskellene mellem grupperne blev analyseret ved anvendelse af Students t-test, når kun to grupper blev sammenlignet, eller ved envejs variansanalyse (ANOVA), når mere end to grupper blev sammenlignet. Alderen-justerede odds ratio (AOR) og 95% konfidensinterval (CI) for forholdet mellem de HOXB5 3′-UTR genotypefrekvenser og kliniske eller histologiske træk blev bestemt ved multivariat logistisk regressionsanalyse ved anvendelse SPSS 17.0 med alderen betragtes som en faktor . Alle statistiske tests var to-sidet. Forskelle blev betragtet som statistisk signifikant ved p. 0,05

Resultater

HOXB5 blev Over-udtrykt i Human blærekræft væv og cellelinier

RNA blev ekstraheret fra 35 blære kræftpatienter og 8 blærekræft cellelinjer og ekspressionen af ​​HOXB5 blev målt ved anvendelse qPCR. Som vist i figur 1A, på 35 prøver, 23 (-70%) udviste højere ekspression af HOXB5 sammenlignet med normalt tilstødende væv (NAT). Udtrykket af HOXB5 var også højere i 6 af 8 blære kræft cellelinier (TCCSUP, 5637, T24, RT4, HT-1376, og J82) end i normale blære celler (Figur 1B). Immunohistokemiske undersøgelser under anvendelse af HOXB5 antistof bekræftede, at ekspression af HOXB5 er højere i blærekræft væv end normale blære væv (figur 1C). Der var imidlertid ingen korrelation mellem ekspressionen af ​​HOXB5 og tumorklassificering eller stadiet (data ikke vist). Disse resultater antydede, at overekspression af HOXB5 kan være fælles i nogle blærekræft væv og i cellelinier.

A. Ekspression af HOXB5 i 35 blærekræft væv i forhold til normale tilstødende væv (NAT). Kolonner over X-aksen angiver overekspression af HOXB5; dem under x-aksen angiver down-ekspression af HOXB5 forhold til NAT. B. Ekspression af HOXB5 i otte blære kræft cellelinjer i forhold til normale blære celler. Kolonner over X-aksen angiver overekspression af HOXB5; dem under x-aksen angiver down-ekspression af HOXB5 forhold til normale celler. Fold ændringer 1 blev anset for at være positiv. C. HOXB5 udtryk i primære overgangsordninger celle blære kræft væv detekteret ved immunhistokemi. C1 og C2, blærekræft væv, G2 klasse. C3, Blærekræft væv, G3 klasse. C4, Normal blærevæv. Alle billeder er × 100. Farvning: brun, HOXB5

HOXB5 Fremmer Cell Proliferation og migration for blærekræft Cells

Vi fandt, at HOXB5 blev overudtrykt i blærekræft væv og cellelinier, hvilket indikerer, at. HOXB5 kan fungere som et onkogen. At undersøge onkogene funktion af HOXB5, vi transficeret si-HOXB5 og NC siRNA i T24, 5637 og TCCSUP celler. 48 timer efter transfektion, udviste en CCK8 assay, at cellevækst blev signifikant reduceret i SI-HOXB5 transficeret grupper sammenlignet med NC-gruppe eller mock gruppe (Lipofectamin kun) (figur 2A, s 0,05). Vi fandt også, at migrationen evne si-HOXB5 transficerede celler var signifikant inhiberet sammenlignet med NC-gruppe eller mock gruppe (figur 2B). Disse resultater viste, at HOXB5 kan fremme celle proliferation og migration af blærekræft celler, i overensstemmelse med en rolle et onkogen.

A. Proliferation af blærekræft cellelinjer T24, 5637 og TCCSUP. En CCK8 assay blev anvendt til at undersøge cellevækst af blære cancerceller. B. Migration af blære kræft cellelinjer. Venstre kolonne, si-HOXB5 transficeret gruppe; højre kolonne, NC siRNA transficeret gruppe. Alle billeder er × 10. Farvning: lilla, migration celler. C. Colony formation (C1) og kolonidannende effektivitet (C2) af blære cancerceller efter transfektion med si-HOXB5 eller NC siRNA. Kolonidannende effektivitet = kolonier /forgyldt celler × 100%. * P 0,05, ** p 0,01. NC, uspecifik kontrol. MOCK, Lipofectamine kun.

si-HOXB5 Undertrykker Clonogenicity

in vitro

For yderligere at udforske den potentielle rolle HOXB5 i tumorigenese, undersøgte vi effekten af ​​HOXB5 på koloni dannelsen af ​​kræftceller

in vitro

. Tre blære cancercellelinier (T24, 5637 og TCCSUP) blev transficeret med en si-HOXB5 eller NC duplex, og fik lov at vokse ved meget lav densitet (500 celler til T24, 1.000 celler til 5637 og TCCSUP) i ca. 14 dage. Navnlig si-HOXB5 inhiberes, både i størrelse og antal, evne til blæren cancerceller til at danne kolonier (figur 2 C1). Endvidere viste si-HOXB5 transficerede celler lavere kolonidannende effektivitet end NC-transficerede celler (figur 2 C2, s 0,01). Disse data understøttes yderligere onkogene effekt af HOXB5 i blæren kræftceller.

SNP-1010A /G er beliggende inden for miRNA-7 Binding stedet på HOXB5 3′-UTR

Vi fandt SNP rs9299 ( 1010 A /G) er placeret i 3′-UTR af HOXB5 genet under anvendelse af NCBI SNP database. HOXB5 blev også forudsagt at være et af de målgener af miRNA-7 ifølge 3 i forskellige systemiske bioinformatik software, som vi anvendte, og SNP (1010 A /G) blev placeret i miRNA-7 bindingssted (figur 3A) .

A. HOXB5 blev forudsagt som et direkte mål for miR-7 af Miranda, PicTar og Targetscan. B. Luciferase-analyse i HEK-293T-celler. WT, vildtype. MUT, mutant type. C. Virkning af MIR-7 overekspression på ekspressionsniveauerne af endogen HOXB5 i T24, 5637 og TCCSUP celler. Endogen HOXB5 mRNA og proteinniveauer blev analyseret ved qPCR (C1) og Western blot (C2) hhv. p-actin, intern kontrol. ** P 0,01 sammenlignet med NC-transfektanter. NC, uspecifik kontrol.

For at validere HOXB5 som en bona fide mål for MIR-7, en human HOXB5 3′-UTR-fragmentet indeholdende enten vildtype eller mutant MIR-7-bindende sekvens blev subklonet nedstrøms for Renilla luciferase-reportergenet som beskrevet i materialer og fremgangsmåder. Den relative luciferase aktivitet af reporter indeholdende vildtype HOXB5 3′-UTR blev signifikant undertrykt, når MIR-7 blev co-transficeret (p 0,01). I modsætning hertil luciferaseaktiviteten af ​​reporteren indeholdende mutant MIR-7-bindingssted var næsten upåvirket (p 0,05). (Figur 3B)

For yderligere at undersøge reguleringen af ​​HOXB5 ekspression ved MIR-7, vi transficerede miR-7 efterligner og NC ind i cellelinjer T24, 5637 og TCCSUP. Efter 48 timer, vi undersøgte HOXB5 mRNA og protein niveauer ved hjælp af qPCR og western blot. Vi fandt, at HOXB5 mRNA og proteinniveauer blev nedreguleret i Mir-7 transficerede grupper sammenlignet med NC grupper (Figur 3 C1 C2).

Disse resultater viste, at MIR-7 kan regulere HOXB5 udtryk på både post-transskription og mRNA-niveauer.

SNP 1010A /G påvirker HOXB5 Expression

for at undersøge effekten af ​​SNP 1010A /G på ekspressionen af ​​HOXB5, vi undersøgte mRNA-niveauer af HOXB5 for 1010a og 1010G alleler i de heterozygote GA genotype blære kræft væv (13 tilfælde) og cellelinier (5637, RT4 og J82), ved hjælp af Taqman assay som beskrevet ovenfor. Vi fandt, at ekspressionen af ​​HOXB5 mRNA med 1010G allelen var signifikant højere end mRNA’et med 1010A allel i både væv og andre cellelinier (figur 4A1 og A2). Men udtrykket forholdet 1010G til 1010A i det genomiske DNA fra disse heterozygote cancer væv og cellelinier var i lighed (figur 4B1 og B2). Disse resultater viste, at 1010A /G SNP i HOXB5 3′-UTR påvirkede ekspressionen af ​​HOXB5 mRNA.

A1. Ekspression af mRNA for hver allel i de heterozygote GA genotype cellelinier (5637, RT4 og J82) og væv (13 tilfælde). A2. Ekspression af mRNA (Mean) for hver allel i heterozygote GA genotype cellelinjer og væv. Y-aksen, ekspression af HOXB5 mRNA. Ct: cyklus tærskel, beregnet ud fra Realtime-PCR-maskine. B1. Ekspression af den heterozygote genomisk DNA som en intern kontrol. B2. Ekspression af den heterozygote genomisk DNA (Mean) som en intern kontrol. Y-aksen, ekspression i genomisk DNA. *** P. 0,001

de forskellige alleler Affect mRNA Stabilitet og HOXB5 Expression Niveauer

For at forudsige mulige mekanismer, hvordan 1010A /G SNP resulterer i differentierede HOXB5 ekspressionsniveauerne, vi anvendes mRNA sekundær struktur forudsigelse værktøj MFOLD at forudsige den sekundære struktur af de mRNA’er med A og G alleler. Vi fandt, at den forudsagte minimal fri energi (MFE) af den sekundære struktur af mRNA’et med G-allelen var lavere end den af ​​mRNA’et med A-allelen (-5,4 vs -3.0). Dette resultat indikerede, at strukturen af ​​mRNA’et med G-allelen kan være mere stabil end for mRNA’et med A-allelen (figur 5A).

For yderligere at undersøge hvilke allel (A eller G) tillægges mere stabilitet målte vi mRNA halveringstiden fordi det er blevet vist, at steady state af mRNA er nært beslægtet med mRNA halveringstiden [21]. Vi undersøgte halveringstid HOXB5 mRNA i homozygot T24 og TCCSUP blære cancerceller (GG for T24 og AA til TCCSUP) efter behandling med actinomycin D, under anvendelse af qPCR. Resultaterne viste, at halveringstiden for HOXB5 mRNA i cellerne med GG-genotypen var 3,5 gange (11 timer) end mRNA halveringstiden (3,4 timer) i cellerne med AA-genotypen (figur 5B), hvilket indikerer, at mRNA med G-allelen var mere stabil end mRNA’et med A-allelen. Denne anderledes stabilitet på de to mRNA kan være den mulige mekanisme, der forklarer den anden effekt af SNP på HOXB5 udtryk.

A. Sekundære strukturer af HOXB5 mRNA forudsagt af MFOLD. Minimal fri energi (MFE) kan afspejle mRNA stabilitet. B. Halveringstiden af ​​HOXB5 mRNA i T24 (GG genotype) og TCCSUP (AA genotype) celler. Halveringstiden for mRNA’et med G-allelen var omkring 11 timer, og ca. 3,7 timer med A-allelen. C. HOXB5 ekspressionsniveauet efter transfektion med MIR-7 i forhold til NC i 5637 celler (GA genotype). Både A og G alleler af mRNA transficeret med MIR-7 udviste nedregulering i forhold til NC-gruppen. Niveauet af HOXB5 mRNA med A-allelen faldt mere end mRNA med G-allelen. D. Luciferase-analyse i HEK-293T celler af MIR-7 aktivitet. Vector, psiCHECK-2-vektor. * P 0,05, ** p 0,01, *** p. 0,001

bindingsaktiviteten af ​​miR-7 for forskellige alleler af mRNA påvirker HOXB5 Expression Level

Vi transficeret mIR-7 til en blærecancer-cellelinie (5637) med den heterozygote GA genotype for 48 timer og målte HOXB5 mRNA-niveauet ved hjælp af Taqman assay. Vi observerede, at overekspressionen af ​​MIR-7 i væsentlig grad kan inhibere ekspressionsniveauet af HOXB5 mRNA sammenlignet med NC gruppe? Interessant, ekspressionsniveauet af HOXB5 mRNA med A allelen faldt meget mere end niveauet af mRNA’et med G-allelen (figur 5C), hvilket indikerer, at bindingen af ​​MIR-7 til HOXB5 mRNA med A allelen var større end mRNA med G-allelen.

for at validere vores hypotese, gennemførte vi en luciferaseanalyse. Den relative luciferase aktivitet blev undertrykt meget mere i reporteren indeholdende 1010A transficeret med MIR-7 end den, som 1010G allel (figur 5D). Disse resultater viste, at den bindende virkning af miR-7 med enten 1010A eller 1010G allel kan være en anden vigtig mekanisme er involveret i de forskellige HOXB5 ekspressionsniveauerne ramt af SNP.

Foreningen mellem 1010A /G HOXB5 Genotype frekvens og blærekræft

Dernæst undersøgte vi sammenhængen mellem 1010A /G HOXB5 genotype frekvens og de kliniske funktioner i blærekræft. DNA blev ekstraheret fra 391 patienter med blærekræft, der blev bekræftet af patologer, og fra 391 normale kontroller, og SNP (1010A /G) genotyper for hver prøve blev analyseret. Vi fandt, at G allel (AG + GG) genotyper var forbundet med risiko for høj bedømmelse (grad 2 og 3, AOR = 4,25, p 0,001, tabel 1) og høj fase (T2-T4, muskel invasiv type, AOR = 2.25, p = 0,003, tabel 2) kræftformer som mod lav kvalitet (Grade1) og lav fase (T1, non-muskel invasiv type) kræftformer. Vi viste også, at hyppigheden af ​​G-genotyper (AG + GG) var højere i blærekræft sammenlignet med de normale kontroller (AOR = 1.48, p = 0,017) (tabel 3).