PLoS ONE: patobiologiske Konsekvenserne af MUC16 Expression i kræft i bugspytkirtlen

Abstrakte

MUC16 (CA125) tilhører en familie af høj molekylvægt O-glykosyleret proteiner kaldet muciner. Mens MUC16 er kendt som biomarkør i ovariecancer, dets ekspressionsmønster i pancreascancer (PC), den fjerde største årsag til cancerrelaterede dødsfald i USA, er stadig ukendt. Formålet med vores undersøgelse var at analysere udtryk for MUC16 under initiering, progression og metastase af PC til mulige konsekvenser i PC diagnose, prognose og terapi. I denne undersøgelse blev et mikroarray med væv fra raske og pc patienter anvendt til at undersøge den differentielle proteinekspression af MUC16 i PC. MUC16 mRNA niveauer blev også målt med RT-PCR i de normale humane pancreas, pancreatitis og PC væv. For at undersøge dets ekspressionsmønster under PC metastase, blev analyseret vævsprøver fra den primære pancreatiske tumor og metastaser (fra den samme patient) i lymfeknuder, lever, lunge og omentum fra trin IV PC patienter. For at bestemme sin forening i indledningen af ​​PC, blev væv fra PC patienter indeholder præneoplastiske læsioner af varierende grader farvet for MUC16. Endelig blev MUC16 ekspression analyseret i 18 humane PC cellelinier. MUC16 udtrykkes ikke i de normale pancreas kanaler og er stærkt opreguleret i PC og påvises i pancreatitis væv. Den er først opdaget i high-grade præneoplastiske forandringer forud invasiv adenokarcinom, tyder på, at dens opregulering er en sen begivenhed under indledningen af ​​denne sygdom. MUC16 ekspression synes at være stærkere i metastatiske læsioner sammenlignet med den primære tumor, hvilket antyder en rolle i PC metastase. Vi har også identificeret PC cellelinier, som udtrykker MUC16, som kan anvendes i fremtidige undersøgelser for at belyse dets funktionelle rolle i PC. Alt i alt, vores resultater viser, at MUC16 udtryk øges betydeligt i PC og kunne spille en potentiel rolle i udviklingen af ​​denne sygdom

Henvisning:. Haridas D, Chakraborty S, Ponnusamy MP, Lakshmanan I, Rachagani S, Cruz E, et al. (2011) patobiologiske Konsekvenserne af MUC16 Expression i kræft i bugspytkirtlen. PLoS ONE 6 (10): e26839. doi: 10,1371 /journal.pone.0026839

Redaktør: Rakesh K. Srivastava, The University of Kansas Medical Center, USA

Modtaget: Juli 30, 2011; Accepteret: 4 Oktober 2011; Udgivet 31. oktober, 2011

Copyright: © 2011 Haridas et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Institutes of Health (RO1 CA78590, RO1 CA131944, UO1 EDRN CA111294 og P50 SPORE CA127297), Department of Defense (BC101014), Susan G. Komen Foundation (KG070826), NCI Cancer center Support Grant 5 P30 CA036727-2452 og Nebraska Department of Health Institutional LB595 Grant for Cancer og Rygning Disease Research. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i bugspytkirtlen (PC) er en yderst dødelig malignitet. Ifølge American Cancer Society, det anslåede antal nye tilfælde og dødsfald som følge af PC i USA i 2010 var 43.140 og 36.800 henholdsvis med en 5 års overlevelse på 6% [1]. Adenocarcinom i pancreas kanaler udgør næsten 95% af alle pankreatiske tumorer [2] og er forbundet med en median overlevelse på kun 3-6 måneder. Den dårlige udsigter af pc patienter tilskrives en stor del af klinisk tavse karakter af denne malignitet som ofte fører til sin diagnose på et fremskredent og ofte inoperabel stadium af sygdommen.

Flere proteiner er blevet rapporteret at være dysreguleret under initiering og progression af PC. En sådan familie af proteiner, hvis ekspression er aberrerende opreguleret i PC er muciner. Disse er høj molekylvægt, stærkt glycosylerede proteiner, der tjener flere funktioner i normale væv, herunder smøring og indfangning af skadelige patogener [3] – [7]. Deres udtryk er tilsyneladende ændret i flere maligne tilstande, herunder PC [8].

CA125 (MUC16) er en celleoverfladeglycoprotein, der først blev identificeret af Bast

et al

i 1981 [9]. MUC16 spaltes og udskilles til blodstrømmen og har været genstand for aktiv forskning som biomarkør i serummet for en række forskellige tumortyper [10]. Det er i øjeblikket det eneste serum tumormarkør rutinemæssigt anvendes i klinikker til diagnosticering og især forudsige prognosen i æggestokkene kræftpatienter [11]. CA125 er det bedst kendte antistof, der genkender MUC16 både i væv og i legemsvæsker og er rettet mod en epitop beliggende i tandemgentagelsesregionen af ​​MUC16 protein [4], [12].

Strukturelt den MUC16 proteinet består af et ekstracellulært N-terminale domæne består af mere end 22.000 aminosyrerester og menes at være stærkt glycosyleret. Den centrale domæne indeholder op til 60 glycosylerede peptidsekvenser gentaget i tandem (et karakteristisk træk ved mucin familien) efterfulgt af et C-terminalt domæne indeholdende en potentiel proteolytisk spaltningssted, et transmembrandomæne og en kort cytoplasmatisk hale med flere potentielle steder for phosphorylering [13], [14].

i den foreliggende undersøgelse har vi analyseret ekspressionen af ​​MUC16 i PC væv og cellelinjer under anvendelse ca125 monoklonalt antistof. Yderligere har vi analyseret ekspressionen af ​​dets mRNA i væv isoleret fra PC og pancreatitis patienter ved RT-PCR. Det overordnede formål med vores undersøgelse var at undersøge, om der er en differentieret udtryk for MUC16 under progression og udvikling af PC og at undersøge en mulig sammenhæng mellem MUC16 udtryk og tumor egenskaber. Vores undersøgelse tyder på, at MUC16 ikke udtrykkes i de normale pancreas kanaler men opreguleret under PC progression og udvikling, hvilket tyder på en potentiel rolle for MUC16 i PC patogenese og dets kliniske diagnose.

Materialer og metoder

Etik Statement

En skriftligt informeret samtykke blev opnået for alle ikke-arkivers væv før væv kollektion til alle prøver opnået gennem UNMC.

vævsprøve og cellelinier

Fifty -Otte PC og 8 normale pancreas vævsprøver (formalin faste og paraffin-embedded) blev opnået fra Accumax (Array nummer A207IV). Matrixen indeholdt væv, der er klassificeret som ikke-neoplastiske (8 spots), veldifferentieret adenocarcinom (12 pletter), moderat differentieret adenocarcinom (22 pletter) og dårligt differentieret adenocarcinom (24 pletter). Ekspression af MUC16 blev analyseret ved RT-PCR fra 2 normale humane pancreas væv, 6 pancreatitis og 17 pancreas cancer væv, som blev opnået efter godkendelse af protokollen af ​​IRB (IRB 491-97) på University of Nebraska Medical Center, Omaha , NE. MRNA blev omdannet til cDNA under anvendelse af oligo dT-primere. De anvendte primere til at kontrollere for MUC16 udtryk er MUC16_F-5 ‘GTCCCCAACAGGCACCACACCG-3’ og MUC16_R-5’GGGCACTGTTGCTGGACGTTGTATT-3 ‘og PCR-produktet blev sekvens verificeret på UNMC DNA-sekventering facilitet.

Endvidere formalin fast og paraffin indstøbt (FFPE) PC vævsprøver fra 34 PC patienter bestående af normal bugspytkirtlen (7 pletter), primær PC (31 pletter) og metastase til leveren (23 pletter), lunger (11 spots), lymfeknude (17 pletter) og omentum /membran (11 pletter) opnået fra University of Nebraska Medical center hurtige obduktion program (IRB-091-01) blev også analyseret for at undersøge ændringen i MUC16 udtryk under PC metastaser. Under den hurtige obduktionen programmet på UNMC, er væv fra donor patienter høstet inden for tre timer efter deres død, og prøverne flash frosset i flydende nitrogen eller anbringes i formalin til omgående fiksering. Tissue microarrays (TMAS) fremstillet af paraffinblokke af væv fra den hurtige obduktion program blev anvendt til MUC16 immunfarvning. Ud over de tumor kerner, hver blok indeholdt kontrolprøver fra de ikke-neoplastiske colon, nyre og tumor tilstødende pancreas fra de samme donorer. TMA blokke blev skåret i 4 uM sektioner og monteret på ladede dias

Femogtyve PC vævsprøver indeholder Pancreas intraepitelial Neoplasmer (Panin) læsioner af varierende grader (Antal læsioner identificeret-Panin I- 163;. Panin II-197, Panin III-26 og normale kanaler-140) støder op til de områder, PC blev også opnået efter godkendelse af protokollen af ​​Institutional Review Board (IRB-491-97) på University of Nebraska Medical center, Omaha, NE. Fire mikrometer tykke paraffinsnit blev skåret og farvet med hematoxylin og eosin til patologisk evaluering. Karakteren af ​​PanINs og MUC16 udtryk i hver type Panin læsion blev vurderet ved den kirurgiske patolog (SMG).

udtryk for MUC16 mRNA og protein blev også analyseret i et panel af pc cellelinier (MiaPaCa, Panc89 , dang, HPAC, SU86.86, Colo357, CD18 /HPAF, HUPT3, Capan1, Suit2, CD11, T3M4, FG, Aspc1, Panc1, HG625, Capan2 og BxPC3) ved anvendelse af primere tidligere nævnt. Cellelinierne blev dyrket ved 37 ° C i nærvær af 5% CO

2 i DMEM suppleret med 10% føtalt kalveserum og antibiotika (penicillin og streptomycin 100 ug /ml). Alle cellelinier blev opnået fra ATCC.

Immunhistokemi

Glassene blev behandlet for immunfarvning som beskrevet tidligere [15], [16]. Anti MUC16 muse monoklonalt antistof (M11 klon, fremstillet af Dako, Carpinteria, CA, USA) blev anvendt som det primære antistof. (Stock: 764 ug /ml fortyndingsfaktor 1:500) Salg

Alle farvede objektglas blev scoret af en patolog under et Nikon E400 Light Microscope og repræsentative fotografier taget. Farvningsintensitet for MUC16 (CA125) blev bedømt på en skala fra 0-3 (0-negativ, 1-svag, 2-moderat, 3-stærk immunoreaktivitet). Procentdelen af ​​celler positive for MUC16 inden for en given læsion blev scoret på en skala fra 1-4 som følger: 1: 0-25% celler positiv; 2: 26-50% positive; 3: 51-75% positive; og 4: 76-100% positive. Score af farvning intensitet og procentdelen af ​​immunoreaktive celler blev derefter multipliceret til opnåelse af en sammensat score i området fra 0 til 12. Et afsnit blev betragtet som “positive” for MUC16 hvis intensiteten af ​​MUC16 var 1. Følgelig væv blev også klassificeret som “positive” eller “negative” for MUC16 ekspression.

Konfokal immunfluorescensmikroskopi

PC celler blev forarbejdet til konfokal mikroskopi som tidligere beskrevet [17], [18] . Kort fortalt blev cellerne dyrket ved 37 ° C i 48 h på sterile dækglas, vaskes med Hanks puffer indeholdende 0,1 M HEPES og rettet i iskold methanol ved 20 ° C i 2 min. Celler blev blokeret med 10% gedeserum i phosphatpufret saltvand (PBS) i 30 minutter, efterfulgt af inkubation med anti-MUC16 monoklonalt antistof (CA125) fortyndet i PBS (CA125 lager: 764 ug /ml; fortyndingsfaktor 1:500) for 1 time ved stuetemperatur. Celler blev vasket i 10 minutter (× 4 gange) med PBS og derefter inkuberet med FITC-konjugeret ged anti-mus sekundært antistof i 30 min. Celler blev igen vasket (10 min × 4) og monteret på objektglas i anti-fade Vectashield montering medium (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA).

Western blot-analyse

PC celle linjer blev forarbejdet til protein ekstraktion og blev efterfulgt af western blotting ved SDS-agarose som beskrevet tidligere [17], [18]. Varmedenatureret lysater blev opløst på en 2% SDS-agarosegel ved elektroforese og efterfølgende overført til PVDF-membraner. Efter overførsel blev membranen blokeret med 5% fedtfri tørmælk i PBS i 2 timer, og inkuberet med anti-MUC16 mAb (lager: 764 ug /ml fortyndingsfaktor 1:1000) eller anti-β-actin monoklonalt antistof natten over ved 4 ° C. Membranerne blev vasket med PBS indeholdende 0,1% Tween-20 og derefter inkuberet med peberrod peroxidase- konjugeret ged anti-mus sekundære antistoffer (fortyndet 1:2000 i 5% fedtfri tørmælk i PBS) (Amersham Biosciences Buckinghamshire, UK) i 1 time . Signalet blev detekteret ved anvendelse forøget kemiluminescens (ECL, Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK).

RNA Extraction og RT-PCR

Totalt RNA blev isoleret fra væv ved hjælp af

mir

Vana miRNA isolation kit (Ambion, Foster city, CA, USA) og fra cellelinjer under anvendelse af QIAGEN RNeasy Mini kit (QIAGEN, Valencia, CA, USA) ifølge producentens protokol. Den mRNA isoleret blev omdannet til cDNA under anvendelse af oligo dT-primere. CDNA’et fortyndet 1:05 blev anvendt til bestemmelse af ekspressionen af ​​MUC16 mRNA under anvendelse af PCR i overensstemmelse med tidligere beskrevne protokol [19]. Produkterne blev kørt på en 1,5% agarosegel indeholdende ethidiumbromid (10 ug /ml). Primerne anvendt til at kontrollere for MUC16 ekspression er dem, der tidligere er blevet nævnt.

Statistisk analyse

kontinuerlige variabler (egcomposite score) blev sammenlignet ved anvendelse af en Students to-halet t-test under forudsætning af ulige varians. Kategoriske variable (fase, karakteren af ​​tumor, organ for fjernmetastaser) blev sammenlignet under anvendelse af Kruskal Wallis ANOVA-test eller Fishers eksakte test. En p-værdi 0,05 blev anset for at være statistisk signifikant. Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp MedCalc til Windows-version 9.6.4.0 software (MedCalc software bvba, Mariakerke, Belgien).

Resultater

MUC16 er forskelligt overudtrykt i pancreas adenocarcinom væv

at identificere ekspressionsmønsteret for MUC16 i PC patogenese, dets ekspression blev sammenlignet mellem ikke-neoplastiske kanaler og pancreas adenocarcinom bruger væv microarray omfattende ikke-neoplastiske pancreas (n = 8) og væv fra primær PC med varierende kvaliteter (n = 58 ). En vævsprøve blev anset for positiv, hvis mindst 5% af cellerne udtrykte MUC16. MUC16 ekspression blev ikke iagttaget i de ikke-neoplastiske kanaler (figur 1A). Men i 38/58 (65%) tilfælde af PC, de maligne kanalerne var, positive for MUC16. Ekspressionen af ​​MUC16 var signifikant højere i PC sammenlignet med de ikke-neoplastiske kanaler (p = 0,003 ved den tosidede Fishers eksakte test). Endvidere at afgøre, om der er en variation i MUC16 udtryk med udviklingen af ​​PC, vi sammenlignet sit udtryk mellem PC væv klassificeret af tumor scenen og lønklasse. Der var en progressiv stigning i ekspressionen af ​​MUC16 med tab af tumor differentiering, med 50% af veldifferentieret (6/12), 59% af den moderat differentieret (13/22) og 66% af de ringe differentierede PC væv (16/24) er positiv (figur 1A). Mens ekspressionen af ​​MUC16 ikke var signifikant forskellig mellem de tre grupper, var den gennemsnitlige sammensat score var signifikant højere i moderat og dårligt differentieret PC sammenlignet med veldifferentierede adenocarcinomer (p = 0,02 og 0,001 henholdsvis). Men det sammensatte score var ikke signifikant forskellig mellem moderate og dårligt differentierede tilfælde PC. Dette antyder, at MUC16 ekspression øges betydeligt med tab af differentiering af PC væv.

vævssnit blev opnået fra Accumax i form af et array og blev farvet med anti-MUC16 monoklonalt antistof. De farvede sektioner blev observeret under mikroskop og immunoreaktiviteten blev bedømt ved intensiteten og spredes af den mørke farve. Anti-MUC16 antistof viste ingen farvning i det normale pancreas væv (både kanaler og acini), mens en stærk farvning blev observeret i cancervæv. (A) Box plot repræsenterer score på MUC16 på tværs af de forskellige kvaliteter af PC. Fra boksen plot vi observerede immunreaktivitet at være højere i de dårligt (D) og moderat differentierede (C) væv sammenlignet med godt differentierede (B) væv. Den normale pancreas (A) væv er også negativ. Repræsentative sektioner demonstrerer MUC16 ekspression i normale pancreas kanaler og forskellige kvaliteter af invasiv adenokarcinom er vist. Bemærk den dominerende membran farvning af MUC16 i PC. (B) Expression undersøgelser af MUC16 i normal, pancreatitis og pancreas cancer væv ved RT-PCR. RT-PCR blev udført på mRNA isoleret fra normalt humant pancreasvæv (N1, N2), human pancreatitis væv (Pt1-Pt6) og human bugspytkirtelkræft væv (PC1-PC17). Ingen amplifikation blev observeret i normale væv, men amplifikation blev observeret i bugspytkirtelkræft og pancreatitis væv. Actin blev anvendt som en intern kontrol.

Den differentierede udtryk for MUC16 i PC blev også undersøgt ved at kontrollere ekspressionen af ​​MUC16 på det transkriptionelle niveau ved at isolere mRNA fra normal human pancreas, pancreatitis og pc væv. MUC16 mRNA-ekspression var til stede i normale pancreas væv (0/2, 0%), men var til stede i 12/17 (71%) PC og 1/6 (16,7%) pancreatitis væv (figur 1b). De fleste af de pc-væv blev klassificeret som moderat til dårligt differentieret PC (8/17). Der var 1 tilfælde af godt differentieret PC, en af ​​pseudopapillary neoplasma og en af ​​hver af en mucinøs cystisk adenocarcinom og giant cell tumor. 5/8 (62,5%) af moderat dårligt differentieret, 1/1 (100%) af godt differentieret, 1/1 giant cell tumor og 1/1 af mucinøs cystisk adenocarcinom udtrykt MUC16. Seks PC patienter havde også en historie af kronisk betændelse i bugspytkirtlen (CP). 5/6 (83%) af disse tumorer var også positive for MUC16. Til sammenligning havde 7 PC patienter ikke har nogen historie CP. Af disse sager, 5/7 (71,4%) var positive for MUC16. Udtrykket af MUC16 var ikke signifikant forskellig mellem dem med eller uden en historie af CP (tabel 1).

Differential opregulering af MUC16 i høj kvalitet i bugspytkirtlen dysplasi

Efter at have observeret, at MUC16 er afvigende udtrykt i pancreas duktalt adenokarcinom vi næste forsøgt at undersøge ekspressionen af ​​MUC16 under udviklingen af ​​PC. Til dette, studerede vi til udtryk i præmaligne læsioner kendt for at gå forud for invasiv adenokarcinom, betegnes som pancreas intraepitelialneoplasi (PanINs). Panin læsioner er klassificeret som Panin I, Panin II og Panin III, der svarer til lav, mellem og høj kvalitet dysplasi og er kendetegnet ved veldefinerede histologiske forandringer, herunder nukleare atypia, nuklear fortrængning, pseudostratification og i høje kvalitet PanINs, cribriforming [20] . Vi observerede, at 20% af Panin-I (33/163), 28% af Panin-II (55/197) og 42% af Panin-III læsioner (11/26) var positive for MUC16 udtryk, men dens udtryk blev ikke påvist i de tilstødende normale kanaler (n = 140) som vist i figur 2A. MUC16 udtryk var signifikant højere i alle tre faser af dysplasi (p 0,00001) sammenlignet med de normale kanaler. Men MUC16 udtryk var signifikant højere i høj kvalitet dysplasi (Panin-III) i forhold til lav-grade dysplasi (Panin-I, p = 0,02). Der var imidlertid ingen signifikant forskel i MUC16 positivitet mellem Panin-I og Panin-II (figur 2B). Ligesom i invasive carcinom, MUC16 overvejende lokaliseret til cellemembranen af ​​dysplastiske celler.

(A) MUC16 ekspression blev vurderet i væv, som indeholder både de normale pancreas, og tilstødende dysplastiske læsioner. Mens MUC16 udtryk var svag i lav kvalitet, tidlig stadie Panin læsioner (Panin I), det gradvist stiger med stigende dysplasi med det højeste udtryk observeret i high-grade dysplasi (Panin III) og PC. Bemærk den dominerende membran farvning af MUC16 i alle kvaliteter af PanINs (Original forstørrelse x 200). (B) Box plot repræsenterer den sammensatte score på MUC16 på tværs af de forskellige kvaliteter af Panin læsioner og normale kanaler. Fra boksen plot vi konstatere, at MUC16 stærkt udtrykkes i Panin II og III i forhold til Panin I.

Sammenligning af MUC16 udtryk mellem primær og metastatisk bugspytkirtelkræft

Flere proteiner er kendt for at have en differentiel ekspression i primær vs. metastatisk cancer [21], [22]. For at undersøge om ekspressionen af ​​MUC16 ændres under metastase af PC til fjerne steder, undersøgte vi dens ekspression i matchede (opnået fra den samme patient) primære pancreatiske adenocarcinomer og metastase til lymfeknuder, lunger, lever og omentum /membran (opnået som en del af den hurtige obduktion program). MUC16 blev ikke udtrykt i nogen af ​​de ikke-neoplastiske kanaler, mens de primære og metastatiske tumorer fra den samme patient udtrykte MUC16 med næsten samme intensitet. Resultaterne er opsummeret i figur 3A og 3B. Der var ingen signifikant forskel i den sammensatte score mellem de primære og metastatiske steder (sammenfattet i boxplot). Men patienter, der udtrykte MUC16 i deres primære tumor udtrykte også MUC16 ved metastatiske steder. Dette antyder, at pancreas tumorer opretholde MUC16 udtryk under deres spredning, muligvis peger på den rolle, MUC16 i formidlingen PC celle.

For at undersøge ændringen i MUC16 udtryk med progression, vi undersøgte udtryk for MUC16 i matchede primære pancreas cancer og metastase til enten lunge, lymfeknude, leveren eller omentum /membranen. I (A), mens ekspressionen af ​​MUC16 var højere i metastatiske PC end i den primære tumor, var dette ikke signifikant. A-Normale pancreas; B- kræft i bugspytkirtlen; C- levermetastaser; D- Lung metastase; E- lymfeknudemetastase; F- omentum /Membran metastase. Yderligere, (B) viser, at i den samme patient, de ikke neoplastiske kanaler var negative, mens der var en stærk ekspression af MUC16 i den primære pancreatiske tumor, og dette blev opretholdt selv i metastase.

Angivelse af MUC16 i de forskellige menneskelige bugspytkirtelkræftceller

Efter at have demonstreret, at MUC16 differentielt blev udtrykt i pc-væv, vi yderligere undersøgt sit udtryk i pc-cellelinjer. Ekspression af MUC16 både mRNA (PCR produkt størrelse er 341 bp) og proteinniveau blev observeret i Colo357, T3M4, HPAF /CD18, Dang, HPAC, SU86.86, FG og Capan-1-celler (figur 4A og 4B). Alle andre PC testede cellelinjer var negative for MUC16 udtryk. At afgrænse den subcellulære lokalisering af MUC16, blev immunofluorescens udført in Capan1 og HPAF /CD18-celler (MUC16 udtrykkende) og SUIT2 og CD11 (MUC16 ikke-udtrykkende) celler. Farvning blev bemærket i både de positive cellelinier samstemmende med fordelingen af ​​MUC16 i væv og ingen farvning blev observeret i de negative cellelinier (figur 4C).

(A) Western blot-analyse af MUC16 ekspression i PC cellelinier. Proteinlysater fra atten PC cellelinier blev opløst på en 2% SDS-agarosegel. MUC16 ekspression blev observeret i dang, HPAC, SU86.86, Colo357, CD18 /HPAF, Capan1 og T3M4 cellelinjer. β-actin blev anvendt som en intern kontrol (B) RT-PCR-analyse af MUC16 ekspression i forskellige PC cellelinier. Actin blev anvendt som en intern kontrol. (C) Immunofluorescens studier af to cellelinjer (CD18 og Capan1), der udtrykker MUC16 og to cellelinjer (CD11 og SUIT2), som ikke udtrykker MUC16.

Diskussion

PC er den fjerde hyppigste årsag til kræft dødsfald i USA med kun omkring 20% ​​af de patienter, der overlever i 2 år og kun 6% i fem år. Dens forekomst til dødelighed forholdet har været stort set uændret de sidste mange årtier på trods af en betydelig forståelse af dens biologi [23], [24]. Denne høje dødelighed blandt PC patienter skyldes tendensen af ​​cancercellerne til at metastasere tidligt. Dette, sammen med de fattige respons på behandlingen og høj sats for fornyet gør den til en af ​​de mest dødelige kræftformer, man kender [24]. PC er ofte diagnosticeret på et fremskredent stadium, primært på grund af manglen på pålidelige tidlige diagnostiske markører [24]. Derfor er der et presserende behov for at identificere specifikke tidlig påvisning markør (er) og egnede molekylære mål for bekæmpelse af PC. Muciner er en af ​​de store biomarkører, der er opstået i de seneste år som meget specifikke diagnostiske markører i flere maligniteter, herunder bugspytkirtlen, gynækologisk og aerodigestive tarmkanalen maligniteter [25]. Endvidere har deres afvigende udtryk blevet påvist at modulere cellevækst, differentiering, transformation, vedhæftning, invasion og immun overvågning [7].

CA125 /MUC16 er en tumor biomarkør, der i øjeblikket anvendes til opfølgning af patienter med ovariecancer [26]. Men dens rolle i PC patogenese forbliver uudforsket. I den foreliggende undersøgelse undersøgte vi ekspressionsmønsteret for MUC16 i PC væv og sammenlignet det med den i normale pancreas. Endvidere har vi studerede også sit samarbejde med PC udvikling og med tumor stadie, grad og metastase. Interessant, viste vores resultater, at den normale bugspytkirtlen ikke udtrykker MUC16 men dens udtryk er betydeligt opreguleret i 12/17 PC og 1/6 pancreatitis væv. Det er tidligere blevet påvist, at der er en sammenhæng mellem karcinom i bugspytkirtlen og kronisk pancreatitis (sporadisk og familiær) og den standardiserede hændelse forholdet udvikle PC i kronisk pancreatitis patienter 14-18 [27]. Denne observation af MUC16 bliver markant opreguleret i PC er sammenhængende med ekspressionen af ​​andre membranbundne muciner MUC4 og MUC1 som også afvigende udtrykt i PC og er blevet identificeret som potentielle diagnostiske markører for denne malignitet [24], [28] – [31 ] Vi observerede også, at MUC16 udtryk steget progressivt med tab af differentiering af PC tumor. Det er tidligere blevet observeret, at PC patienter, der er diagnosticeret med fjernmetastaser havde tendens til at have dårligt differentieret pancreasadenocarcinom [32], [33]. Således er vores resultater tyder på, at MUC16 kan have en vigtig rolle at spille i udviklingen og metastase af PC.

Ifølge den kendte progression model til PC, duktalt karcinom udvikler sig fra ikke-neoplastiske kanaler selvom en serie af præmaligne læsioner betegnes som PanINs [33]. Vi observerede, MUC16 ekspression øges progressivt fra Panin I til Panin III. Især andelen af ​​MUC16 positivitet i high-grade Panin læsioner var signifikant højere end for lav kvalitet PanINs. Dette antyder, at MUC16 ekspression er ændret i den fase af pancreas dysplasi og kan spille en kritisk rolle i udviklingen af ​​PC. MUC4, har en anden membran bundet mucin tidligere vist sig at være forskelligt opreguleret med progressivt stigende dysplasi, hvilket tyder på muligheden for, at der kan være visse fælles lovgivningsmæssige veje, der modulerer ekspressionen af ​​både disse muciner under PC udvikling [28], [34], [ ,,,0],35]

den høje dødelighed i pc-patienter skyldes den hyppige forekomst af fjernmetastaser. I en analyse af 4.012 obduktioner udført på PC patienter mellem 1914 og 1943 blev det rapporteret, at den mest almindelige sted for fjernmetastaser var leveren efterfulgt af peritoneum, lunge og pleura, knogler og binyrerne [33], [36] . Men PC er ikke begrænset til disse organer. Selv små pc’er ( 2 cm i diameter) udviser metastase, støtter den forudsætning, at PC er en malignitet, der metastaserer meget tidligt under dens progression [33], [37] Blandt de mange molekyler observeret at spille en rolle i metastasen af ​​PC celler, har muciner dukket op som en af ​​de vigtigste faktorer. Vi har tidligere vist, at MUC4, anden transmembrane mucin når det udtrykkes fremmer metastase og invasivitet i PC celler [18], [38], [39]. I den foreliggende undersøgelse, bemærkede vi, at de primære pc’er, der udtrykker MUC16 også udtrykke MUC16 med næsten samme intensitet i metastatiske steder. Dette antyder, at pc-celler kan opretholde deres udtryk MUC16 under metastatiske proces. MUC16 er tidligere påvist at være vigtige i metastase af faste tumorer til centralnervesystemet via dens interaktion med mesothelin, et protein udtrykkes forskelligt i normale mesotelceller, mesotheliomas og nogle andre mesenkyme maligniteter [40], [41]. Derfor er det muligt, at MUC16 kunne interagere med mesothelin og letter metastaser i PC.

De molekylære mekanismer kørsel metastaser i PC kræver en bedre forståelse af proteiner, som modulerer epitelial-mesenkymale overgang (EMT), og den omvendte proces (MET ), som er nødvendige for frigørelsen og re-binding af tumorceller ved stedet for metastase henholdsvis. Resultaterne af vores undersøgelse tyder på, at MUC16 kan have en rolle i udviklingen og progressionen af ​​PC og studere dens særlige rolle i progressionen af ​​PC vil være grundlaget for vores næste undersøgelse. Dens opregulering, som var særlig stærk i de sene stadier af PC dysplasi, antyder, at de mekanismer, som tændes sit udtryk muligvis tændes sent under PC udvikling. Undersøgelser af MUC4 mucin har afsløret, at dens ekspression er stumme i normale kanaler i kraft af hypermethylering af dets promotor [42], [43]. Hvorvidt lignende epigenetiske ændringer også regulere MUC16 udtryk mangler at blive undersøgt i fremtidige studier. Påvisning af MUC16 i høj kvalitet PanINs (anses for at være de sande dysplastiske læsioner med en høj risiko for invasiv kræft) antyder dens potentielle anvendelse i tidlig påvisning af potentielt maligne læsioner i bugspytkirtlen. MUC16 er også kaste i blodbanen (kendt som CA125), hvilket gør det til et attraktivt molekyle til undersøgelse som en potentiel udskilles biomarkør til PC [44].

Yderligere at identificere en egnet

in vitro

model til at undersøge den funktionelle rolle af MUC16, blev et panel af PC cellelinjer screenet for MUC16 ekspression både proteinet og mRNA-niveauet. Om at udføre western blot-analyse, blev det observeret, MUC16 ekspression enten optrådte som et enkelt bånd eller som en stribet bånd. Det er tidligere blevet vist, at når muciner behandles med 2-mercaptoethanol og analyseret på en SDS-PAGE-gel, er et stribet bånd opnået som muciner er reduceret fra dets oligomere struktur til dens monomere form. Denne monomere form muliggør muciner at migrere hurtigere på gelen og de intakte oligomerer forbliver i brønden [45]. Dette forklarer således den differentielle ekspression mønster af MUC16 opnået på tværs af de forskellige PC cellelinier screenet. Derudover har vi også observeret, at MUC16 udtrykkende cellelinier, såsom Capan 1 (lever opfyldt), Colo 357 (lymfeknude opfyldt) og T3M4 (lymfeknude opfyldt) blev afledt fra metastatiske steder mens MUC16 non udtrykkende cellelinjer, såsom Panc1 , AsPC1 og BxPC3 blev isoleret fra den primære tumor stedet (bugspytkirtlen). Endvidere fra RT-PCR undersøgelser observerede vi, at mRNA-niveauer af visse PC cellelinier ikke bekræfte med deres tilsvarende proteinniveauer. Vi spekulere, at MUC16 mRNA gennemgår skrive transkriptionel bearbejdning i visse cellelinjer.