PLoS ONE: En Kræft bestemt celle-Penetrerende peptid, BR2, for effektiv levering af et scFv i Cancer Cells

Abstrakt

Cell-gennemtrængende peptider (CPP) har vist sig meget effektive som intracellulære levering køretøjer til forskellige terapeutika. Der er dog nogle bekymringer om ikke-specifik penetration og cytotoksicitet af CPP for effektive kræftbehandling. Heri, baseret på celle-penetrerende motiv af et anticancer-peptid, buforin IIb, vi designet flere CPP derivater med kræftcelle specificitet. Blandt derivaterne, blev en 17-aminosyrepeptid (BR2) sig at have cancer-specificitet uden toksicitet for normale celler. Efter specifikt rettet kræftceller gennem interaktion med gangliosider, BR2 indtastet celler via lipid-medieret macropinocytosis. Desuden viste BR2 højere membran translokation effektivitet end den velkendte CPP Tat (49-57). Evnen til BR2 som en cancer-specifik lægemiddelbærer blev påvist ved fusion af BR2 til et enkelt-kæde variabelt fragment (scFv) rettet mod et muteret K-ras (G12V). BR2-fusioneret scFv inducerede en højere grad af apoptose end Tat-fusioneret scFv i K-ras muterede HCT116 celler. Disse resultater tyder på, at romanen celle-gennemtrængende peptid BR2 har et stort potentiale som et nyttigt drug delivery luftfartsselskab med kræft celle specificitet

Henvisning:. Lim KJ, Sung BH, Shin JR, Lee YW, Kim DJ, Yang KS et al. (2013) En Cancer bestemt celle-Penetrerende peptid, BR2, for effektiv levering af et scFv til kræftceller. PLoS ONE 8 (6): e66084. doi: 10,1371 /journal.pone.0066084

Redaktør: Robert W. Sobol, University of Pittsburgh, USA

Modtaget: November 2, 2012; Accepteret: 6 maj 2013; Udgivet: 11 juni, 2013 |

Copyright: © 2013 Lim et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Intelligent Synthetic Biology center of Global Frontier Projekt finansieret af Ministeriet for Uddannelse, Videnskab og Teknologi (2011 til 0.031.955). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

de gavnlige virkninger af mange nyopdagede potentielle terapeutiske midler, såsom proteiner, nukleinsyrer og hydrofile lægemidler, er begrænset på grund af deres manglende evne til at nå de ønskede intracellulære mål [1], [2]. Således er blevet udforsket talrige tilgange som mikroinjektion, eletroporation, liposomal formulering og anvendelse af virale vektorer til at fremme effektiv lægemiddelafgivelse [3], [4]. En stor bekymring om disse teknikker er deres dårlige cellespecificitet [4], [5]. Derfor er udviklingen af ​​en målspecifik lægemiddelafgivelsessystem er en primær bekymring for at forbedre den terapeutiske effektivitet af lægemidler og samtidig reducere deres effektive doser og bivirkninger [6], [7].

cellepenetrerende peptider ( CPP), også betegnet som protein transduktion domæner, har særligt opmærksom som alternativ intracellulær lægemiddelafgivelse køretøj siden opdagelsen af ​​den første CPP, Tat, i 1988 [8]. CPP er korte peptider bestående af færre end 30 aminosyrer og består hovedsagelig af grundlæggende, positivt ladede aminosyrer (fx Arg, Lys og His), der har kapacitet til at translokere gennem cellemembranen og til at levere en række celleimpermeable ladninger tværs cellemembranen [9], herunder proteiner [10], nukleinsyrer [11], siRNA [12], peptid (PNA’er) [13], småmolekyle- lægemidler [14], quantum dots [15], og MR kontrast midler [16]. Selv om den nøjagtige mekanisme af CPP er ukendt, de seneste mekanistiske undersøgelser indebærer, at deres cellulære optagelse resultater fra en initial hurtig elektrostatisk interaktion med plasmamembranen efterfulgt af endosomal optagelse [17], [18].

Brug CPP til intracellulær afgivelse af en bred vifte af makromolekyler er en kraftfuld fremgangsmåde på grund af deres alsidighed parret med let funktionalisering af forbundne laster og høje afgivelseseffektivitet i forskellige cellelinier, overvinde udfordringer ofte over for andre leveringsmetoder [19], [20]. Derfor har mange undersøgelser fokuseret på udviklingen af ​​nye CPP; antallet af tilgængelige CPP med forskellige karakteristika, såsom øget stabilitet og effektiv levering fragt, fortsætter med at stige [17].

Selvom potentialet i CPP som levering agenter er store, deres mangel på celle specificitet, cytotoksiske virkninger og uventede bivirkninger er store bekymringer for deres udvikling som drug delivery køretøjer [21]. Til cancerterapi, CPP cellespecificitet er især vigtigt, så bivirkninger på normale celler minimeres [22], [23]. Der er derfor et stort behov for udvikling af cancer-specifikke og ikke-toksiske CPP’er for effektive kræftbehandling.

Vi har tidligere rapporteret, at en potent antimikrobielt peptid, buforin IIb (RAGLQFPVG [RLLR]

3), har en stærk celle-gennemtrængende evne og anticanceraktivitet mod forskellige cancercellelinier [24], [25]. Selvom buforin IIb viste selektiv cytotoksicitet mod cancerceller, det også påvirket levedygtigheden af ​​normale celler ved høje koncentrationer. At udvikle buforin IIb som en effektiv lægemiddelafgivelse køretøj, bør minimeres sin cytotoksicitet mod normale celler samtidig bevare sin kræftcelle specificitet.

I denne undersøgelse har vi designet en hidtil ukendt cancer-specifik og ikke-toksisk cellepenetrerende peptid, BR2, baseret på cellepenetrerende motiv af buforin IIb og undersøgt den potentielle som en effektiv lægemiddelafgivelse køretøj til kræftceller ved fusionering BR2 til et enkelt-kæde variabelt fragment (scFv) antistof mod muterede K-ras.

Materialer og metoder Salg

Cell Culture

humane cervikale cancercellelinie HeLa, human coloncancer cellelinie HCT116, muse melanomacellelinie B16 /F10, muse fibroblast cellelinie NIH 3T3, menneske keratinocytcellelinje HaCat og human fibroblast cellelinje BJ blev alle opnået fra American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA) og dyrket i et komplet medium [Dulbeccos modificerede Eagle-medium] (DMEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) , 100 enheder /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin. Celler blev dyrket i befugtede betingelser ved 37 ° C med 5% CO

2.

Peptide Design og syntese

Vi har designet adskillige derivater af buforin IIb (BR3) ved trinvis eliminering af C-terminale regelmæssige a-spiralformet motiv RLLR gentagelser af buforin IIb at skabe en kræftcelle specifik og ikke-toksisk CPP. De designede peptider bestod af forskellige numre af C-terminale regelmæssig α-helix motiv RLLR og navngivet ÆB1 og BR2 (tabel 1).

CPP Tat, BR1, BR2 og BR3 blev kemisk syntetiseret ( Anygen, Kwangju, Korea) på en MilliGen 9050 peptidsynteseapparat. Fluoresceindelen (FITC) blev bundet til N-terminalen via en aminohexansyre spacer ved behandling af en harpiksbundne peptid (0,1 mM) med FITC (0,1 mM) og diisopropylethylamin (0,5 mM) i N, N-dimethylformamid ( DMF) i 12 timer. Alle rå peptider blev oprenset og analyseret ved omvendt-fase højtydende væskekromatografi (RP-HPLC) på en C18-søjle, og de oprensede peptider blev karakteriseret ved elektrospray ionisering massespektrometri (ESI-MS).

Konfokal Laser Scanning Microscopy

for at undersøge celle-gennemtrængende evne og den intracellulære fordeling af de internaliserede peptider, lever konfokal mikroskopi blev udført på tre kræft linjer (HeLa, HCT116 og B16 /F10) og tre normale cellelinier (HaCat, BJ og NIH 3T3). Kort beskrevet blev celler (2 x 10

5) blev udpladet på et dækglas anbringes i en 6-brønds plade, dyrket natten over, og derefter inkuberet med FITC-mærkede peptider (5 uM for hver cellelinie) i 30 min. Cellerne blev derefter skyllet tre gange med phosphatbufret saltvand (PBS, pH 7,4), og monteret på objektglas med fluorescens monterings opløsning (Dako Corp., Carpinteria, CA). Colokalisering af BR2 med lysosomer blev observeret ved anvendelse af LYSOTRACKER Red DND-99 (Molecular Probe, Eugene, OR). For at undgå virkningerne af fiksering artefakter, der involverer både methanol og paraformaldehyd blev cellerne ikke fast [26], [27]. Fordelingen af ​​FITC-mærkede peptider blev analyseret under anvendelse af et konfokalt scanning laser Zeiss LSM 510 mikroskop (Jena, Tyskland) udstyret med et 40 x og 20 x objektiv. Fluoroforer var begejstrede med en argon laser (488 nm) til FITC og en HeNe laser (543 nm) for LYSOTRACKER Red.

In vitro

cytotoksicitetsanalyse

cytotoksicitet af peptider til pattedyrceller blev undersøgt ved at vurdere frigivelsen af ​​lactat dehydrogenase (LDH) fra cancer og normale celler. Mængden af ​​LDH frigivet fra beskadigede celler i supernatanten blev målt under anvendelse af cytotoksiciteten Detection Kit (Roche Applied Science, Tyskland) ifølge producentens instruktioner. Kort fortalt blev celler udpladet på 96-brønds mikroplader (1 × 10

4 celler pr brønd) i komplet DMEM suppleret med 10% FBS og inkuberet natten over ved 37 ° C for at tillade fastgørelse og spredning af celler. Efter 24 timers inkubation blev celler behandlet med forskellige koncentrationer af peptider (0-100 uM) og inkuberet i yderligere 24 timer ved 37 ° C. Det ekstracellulære medium fra hver brønd blev overført til et nyt mikroplade og inkuberet i 10 min med 100 pl /brønd reaktionsblandingen, efterfulgt af en stopopløsning. Absorbans blev målt ved 490 nm ved anvendelse af en ELISA-pladelæser. LDH-frigivelse fra celler lyseret med 0,2% Triton X-100 i PBS blev defineret som 100% lækage og LDH-frigivelse fra ubehandlede celler som 0% lækage.

Hæmolyse Assay

Hæmolytisk aktivitet blev analyseret som beskrevet af Aboudy

et al

med små modifikationer [28].; 3 ml frisk fremstillede humane erythrocytter blev vasket med isotonisk PBS, pH 7,4, indtil farven af ​​supernatanten blev klar. De vaskede erythrocytter blev derefter fortyndet til et slutvolumen på 20 ml med den samme buffer. Peptidprøver (10 pi), serielt fortyndet i PBS, blev tilsat til 190 pi af cellesuspensionen i mikrocentrifugerør. Efter forsigtig blanding blev rørene inkuberet ved 37 ° C i 30 minutter og derefter centrifugeret ved 4.000 x g i 5 min. Supernatanten (100 pi) blev fjernet til et nyt rør, og absorbansen ved 567 nm blev bestemt. Den relative optiske densitet i sammenligning med den af ​​cellesuspensionen behandlet med 0,2% Triton X-100, blev defineret som procentdelen af ​​hæmolyse. Den hæmolyse procent blev beregnet under anvendelse af følgende ligning: Procent hæmolyse = [(Abs

567 nm i peptidopløsningen – Abs

567 nm i PBS) /(Abs

567 nm i 0,2% Triton X-100 – Abs

567 nm i PBS)] × 100

Karakterisering af peptid optagelse

for at vurdere internalisering af FITC-mærkede peptider blev HeLa-celler podet på plader med 12 brønde på. en densitet på 2 x 10

5 celler per brønd og inkuberet i 24 timer. FITC-mærkede peptider i forskellige koncentrationer i området fra 2 til 10 uM, blev derefter inkuberet med cellerne i 30 minutter ved 37 ° C. For at sammenligne den cellulære optagelse af peptider, cancer og normale celler blev behandlet med FITC-mærkede peptider (hver, 10 uM) og inkuberet i 30 minutter ved 37 ° C. Efter inkubation blev cellerne vasket tre gange med iskold PBS for at fjerne overskydende ekstracellulære komplekser. Dernæst blev cellerne behandlet med trypsin (1 mg /ml) i 10 minutter for at fjerne eventuelle resterende peptider bundet til celleoverfladen. Efter trypsinisering blev cellerne opsamlet ved centrifugering (1.000 x g i 5 minutter), resuspenderet med 500 pi iskold 2% FBS /PBS indeholdende propidiumiodid (PI), og derefter straks analyseret (10.000 hændelser /prøve) efter fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS).

for at forstå yderligere cellepenetrerende mekanisme af peptider, virkningerne af temperatur og metaboliske inhibitorer blev undersøgt. At belyse temperatur afhængighed, blev HeLa-celler inkuberet ved 4 ° C i 30 minutter før tilsætning af peptiderne. Dernæst blev celler behandlet med FITC-mærkede peptider (hver, 5 uM) ved 4 ° C i 30 minutter. For den energi-depletion undersøgelse blev HeLa-celler præinkuberet med natriumazid (NaN

3, 10 mM) ved 37 ° C i 1 time og derefter inkuberet med FITC-mærkede peptider (hver, 5 uM) ved 37 ° C i . 30 min

for at studere rollen af ​​endocytose i peptid-optagelse blev celler forbehandlet med flere endocytose inhibitorer ved 37 ° C i 1 time: (i) amilorid (5 mM), som er kendt for at blokere macropinocytosis af inhibering af en natriumkanal; (Ii) nocodazol (100 ng /ml), som inhiberer clathrin-medieret vej; og (iii) methyl-ß-cyclodextrin (MßCD, 5 mM), der inhiberer lipidklump-medierede processer ved at nedbryde kolesterol fra plasmamembranen [29]. Alle inhibitorer blev købt fra Sigma (St. Louis, MO).

For at undersøge effekten af ​​negativt ladede komponenter på celleoverfladen for peptid internalisering blev HeLa-celler forbehandlet med gangliosider (monosialogangliosid GM3 fra hunde blod), heparinsulfat, eller sialinsyre (Neu5Ac, alle fra Sigma) (20 ug /ml) i 30 min. Til inhibering af gangliosid biosyntese blev celler forbehandlet med D-

threo

-1-phenyl-2-hexadecanoyl amino-3-morpholino-1-propanol (PPMP, 5 uM) i 48 timer.

i alle disse eksperimentelle betingelser, flowcytometri analyser blev udført med levende celler under anvendelse af en Becton Dickinson FACSCalibur flowcytometer (BD Biosciences, San Diego, CA). I hvert tilfælde blev fluorescensen på 10.000 levedygtige celler erhvervet. Levedygtige celler blev gated baseret på en sidelæns og forward scatter. For dataanalyse, WinMDI software (Joe Trotter, Scripps Research Institute, La Jolla, CA) blev anvendt. Den statistiske signifikans blev vurderet ved t-test på et 95% konfidensinterval.

Kloning og ekspression af peptid-fusionsproteiner

For at ansætte BR2 som et middel til levering af terapeutiske proteiner, et cDNA af Y13-259 enkeltkædet variabelt fragment (scFv) genet blev syntetiseret på Bioneer (Daejeon, Sydkorea). De Tat- eller BR2-kondenseret Y13-259 scFv-gener blev opnået ved rekombinant PCR. De rekombinante cDNA’er kodende for anti-Ras scFv, Tat-scFv og BR2-scFv-fusioner blev spaltet med

Nco

I og

EcoR

I (begge fra New England Biolabs, Beverly, MA), og klonet ind i

Nco

i og

EcoR

sites i pET21c, der producerer pscFv, PTAT-scFv- og pBR2-scFv- hhv. Anti-Ras scFv, Tat-scFv og BR2-scFv fusionsproteiner blev udtrykt i

E. coli

Origami (DE3) efter induktion med 0,1 mM IPTG i 4 timer ved 37 ° C. Celler blev høstet ved centrifugering ved 3000 x g i 15 minutter ved 4 ° C. Cellepelleten blev resuspenderet i phosphatbuffer (10 mM natriumphosphat, 150 mM NaCl, pH 7,4); Cellerne blev sprængt ved sonikering ved 4 ° C (B. Braun instrumenter, Allentown, PA). Proteaseinhibitoren phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF, 1 mM) blev tilsat før sonikering. De opløselige og uopløselige fraktioner blev adskilt ved centrifugering ved 14.000 x g i 15 minutter ved 4 ° C. Pelleten indeholdende inklusionslegemerne blev resuspenderet i vaskebuffer (20 mM Tris-HCI, 5 mM EDTA og 1% Triton X-100, pH 8,0) og centrifugeret ved 8.000 x g i 10 minutter ved 4 ° C.

De vaskede inklusionslegemer blev denatureret og solubiliseret i lysepuffer (0,3% N-lauroylsarcosin, 50 mM CAPS-buffer, og 0,3 M NaCl, pH 11,0) i 3 timer og centrifugeret ved 14.000 x g i 15 minutter ved 4 ° C . Alle proteiner blev affinitetsoprenset ved hjælp af Ni-IDA agarose resin (Elpis biotech, Daejeon, Sydkorea). Kort fortalt blev Ni-IDA His-Bind Resin pakket i en søjle ækvilibreret med bindingspuffer (identisk med lysepuffer). Supernatanten blev langsomt påført søjlen, hvorefter vaskebuffer (0,3% N-lauroylsarcosin, 50 mM CAPS-buffer, 150 mM NaCl, og 30 mM imidazol, pH 11,0) blev påført. Proteinerne blev elueret med elueringsbuffer (0,3% N-lauroylsarcosin, 50 mM CAPS-buffer, 150 mM NaCl, og 250 mM imidazol, pH 11,0) og analyseret ved 10% SDS-PAGE. De eluerede proteiner blev refoldet ved dialyse i PBS indeholdende 200 mM NaCl, 10% glycerol, 1 mM GSH, 0,2 mM GSSG og 0,4 M arginin med gradvis pH-reduktion (pH 10, pH 9, pH 8 og pH 7,4). Hver dialyse trin blev udført ved 4 ° C i 12 timer mod 20 × prøvevolumen at fjerne rengøringsmidlet helt.

Western Blotting

At overvåge peptid-medierede intracellulære optagelse af scFv proteiner, den internaliserede fusionsproteiner blev undersøgt ved Western blotting. HCT116-celler (1 x 10

6) blev behandlet med PBS, oprenset scFv, Tat-scFv eller BR2-scFv-fusionsproteiner (hver, 2 uM) i 2 timer ved 37 ° C. Cellerne blev derefter vasket to gange med PBS (4 ° C), skrabet over i 0,5 ml PBS og centrifugeret ved 1.000 x g ved 4 ° C i 5 min. Cellepellets blev resuspenderet i 100 pi lysisbuffer (20 mM Tris-HCI (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM Na

2EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton, 2,5 mM natriumpyrophosphat, 1 mM beta glycerophosphat, 1 mM Na

3VO

4, 1 ug /ml leupeptin og 1 mM PMSF (Cell Signaling Tech., Danvers, MA) og holdt på is i 30 minutter. cellelysaterne blev derefter centrifugeret ved 12.000 × g ved 4 ° C i 15 minutter og supernatanterne blev opsamlet. Proteinkoncentrationer i celleekstrakterne blev bestemt ved Bradford-metoden [30] (Bio-Rad, Hercules, CA). 50 ug protein fra celleekstrakter blev fraktioneret på en 10% SDS-PAGE-gel. efter elektroforese proteiner blev overført til en nitrocellulosemembran i transfer-buffer (192 mM glycin, 25 mM Tris-HCI, pH 8,8, og 20% ​​methanol [v /v]) ved elektroblotting. efter blokering med 5% skummetmælk i 1 time blev membranen inkuberet med et 1:1,000-fortyndet anti-His primære antistof (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), vasket tre gange med TTBS (50 mM Tris, 150 mM NaCl, og 0,5% Tween-20), og efterfølgende inkuberet med et peroxidase-konjugeret anti-kanin sekundært antistof (GE Healthcare, Uppsala, Sverige) i mælk indeholdende TTBS i 1 time. Efter den endelige vask blev membranen derefter udsat og proteinbånd blev påvist under anvendelse Enhanced Kemiluminescens (WESTSAVE GULD, AbFrontier, Seoul, Korea).

Cell Proliferation Analyser (MTT Assay)

For at vurdere anti-proliferative aktivitet af peptider og anti-Ras scFv-fusionsproteiner, HCT116 celler (K-ras muterede celler) blev podet i plader med 96 brønde i en densitet på 2 x 10

4 celler /brønd i 100 pi DMEM suppleret med 10% FBS og dyrket i 24 timer ved 37 ° C. Efter 24 timers inkubation blev celler behandlet med scFv eller peptid-scFv-fusionsproteiner (0, 0,5, 1 og 2 uM) og inkuberet i yderligere 24 timer. Cellelevedygtighed blev målt med 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl tetrazoliumbromid (MTT) assay under anvendelse af CellTiter 96® Ikke-radioaktivt celleproliferationsassay (Promega, Madison, WI) ifølge producentens instruktioner. Absorbansen af ​​opløsningen blev målt ved 570 nm under anvendelse af en mikropladelæser (Bio-Rad). Cellelevedygtighed blev udtrykt som procentdelen af ​​levedygtige celler behandlet med scFv eller peptid-scFv-fusionsproteiner sammenlignet med PBS-behandlede kontrol (100%). Alle eksperimenter blev udført tre gange.

Påvisning af apoptose

HCT116-celler (1 x 10

6 /brønd i en 6-brønds plade) blev behandlet med peptid-kondenserede scFv’er (hver , 2 uM) eller et velkendt apoptoseinducer staurosporin (0,5 uM) i 24 timer ved 37 ° C og celleekstrakter blev fremstillet som beskrevet ovenfor. Spaltet poly (ADP ribose) polymerase (PARP), en indikator for apoptose, blev påvist ved Western blotting som beskrevet ovenfor. Anti-PARP og anti-α-tubulin antistoffer (Cell Signaling Tech.) Blev anvendt i en 1:1,000 fortynding som de primære antistoffer, hvorimod peberrodsperoxidase-konjugeret anti-kanin IgG (GE Healthcare, Uppsala, Sverige) blev anvendt i en . 1:10,000 fortynding som det sekundære antistof

Desuden blev apoptotiske celler identificeret ved farvning med annexin V-FITC (150 ng /ml) og 7 amino-actinomycin D (7-AAD, BD Biosciences, San Diego, CA). 1 × 10

6 HCT116-celler blev behandlet med PBS, staurosporin (0,5 uM) eller peptid-kondenserede scFv’er (hver, 2 uM) som beskrevet ovenfor. På det angivne tidspunkt blev celler vasket to gange med PBS (pH 7,4), høstet og resuspenderet i 500 pi bindingsbuffer suppleret med Annexin-V fluos (1:100 fortyndet; BioBud, Seoul, Korea), og inkuberet i 15 minutter ved 25 ° C i mørke. For at detektere nekrose blev 7AAD tilsat før måling. Prøverne blev straks udsat for FACS-analyse med en FACSCalibur flowcytometer (FL1 og FL3) og WinMDI software (Joe Trotter, Scripps Research Institute). 1 × 10

4 celler per prøve blev analyseret ved flowcytometri.

Ras Activation Assay

For at undersøge peptid-scFv-fusionsproteinet-afhængige undertrykkelse af Ras aktivitet, omfanget af Ras GTP (aktiv form) blev målt under anvendelse af et Ras-aktivering assaykit (Millipore, Billecia, MA) ifølge producentens instruktioner. Denne metode er baseret på en selektiv binding af Ras-GTP hjælp af Ras-bindingsdomænet (RBD) af Raf-1 (en kinase nedstrøms for Ras), der formår at binde Ras-BNP (inaktiv form). Kort fortalt, 50 pi RBD-protein fusioneret til glutathion transferase (GST) blev coatet på en 96-brønd glutathion-coatede plade ved 4 ° C i 1 time og vasket med TBST (50 mM Tris, 150 mM NaCl og 0,05% Tween -20, pH 7,6). HCT116-celler blev behandlet med scFv, Tat-scFv eller BR2-scFv til 1 eller 2 timer, hvorefter cellerne blev lyseret ved anvendelse af 1 × Mg

2+ Lysis /Wash Buffer (Millipore). Proteinkoncentrationen blev beregnet ved hjælp af Bradford-assayet. Cellelysater indeholdende 50 ug protein blev inkuberet i 1 time i RBD-GST-overtrukne brønde ved 25 ° C. Efter vask tre gange med TBST blev primært antistof tilsat og inkuberet ved 4 ° C i 1 time. Efter vask med TBST blev den sekundære HRP-konjugeret anti-muse-antistof tilsat og inkuberet ved 25 ° C i 1 time. Efter en sidste vask med TBS (50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,6), blev 50 pi af den kemiluminescerende substrater til hver brønd. Kemiluminescens-signaler fra hver brønd blev overvåget under anvendelse af Berthold luminometer (MicroLumat LB96P; Berthold Technologies, Oak Ridge, TN). Resultaterne blev udtrykt som relativ Ras aktivitet.

Resultater

BR2 effektivt internaliserer i forskellige kræftceller uden cytotoksicitet til normale celler

Den cellulære optagelse og intracellulær fordeling af de designede peptider , BR1 og BR2, blev undersøgt ved anvendelse af konfokal mikroskopi. BR2 blev let internaliseres i cancerceller (HeLa, HCT116 og B16 /F10) inden 30 minutter og fordelt i hele cytoplasmaet og kernen af ​​cancerceller (fig. 1A). Det blev dog meget dårligt internaliseres i normale celler (HaCat, BJ og NIH 3T3) under de samme forsøgsbetingelser. I modsætning hertil BR1 viste ubetydelige cellulær optagelse niveauer i både cancer og normale celler, hvilket indikerer, at den ikke kunne translokere over cellemembranen (fig. 1A). Fluorescens fra Tat-behandlede celler blev også tydeligt påvist i både kernen og cytoplasmaet af cancer og normale celler. Mere Tat akkumuleret i kernen end cytoplasma, hvorimod de fleste BR2 var jævnt fordelt i de intracellulære regioner (fig. 1a).

(A) Intracellulær fordeling af FITC-mærkede peptider undersøgt ved konfokal laser mikroskopi. Begge cancerceller (HeLa, HCT116 og B16 /F10) og normale celler (HaCat, BJ og NIH 3T3) blev podet i plader med 6 brønde 1 dag før forsøget for at nå 70% konfluens. Celler blev inkuberet med FITC-mærkede peptider (5 uM) i 30 minutter ved 37 ° C og vasket tre gange med phosphatpufret saltvand (PBS). Peptid fordeling blev derefter analyseret under anvendelse af et konfokalt scanning LSM 510 laser mikroskop udstyret med en 40 × objektiv. (B, C)

In vitro

cytotoksicitet af peptider. (B) Membran forstyrrelse blev målt ved lactatdehydrogenase (LDH) udsivning fra de angivne cellelinjer 24 timer efter peptid behandling. LDH lækage fra celler podet i en 96-brønds plade ved 10.000 celler /brønd blev målt efter eksponering for 1, 2, 5, 10, 20, 50 eller 100 uM peptider i 24 timer. LDH-frigivelse fra PBS-behandlede celler blev betragtet som 0% lækage og LDH frigivet fra 0,2% Triton X-100 behandlede celler som 100% lækage. (C) Den hæmolytiske aktivitet af hvert peptid mod humane erythrocytter blev analyseret ved graduerede koncentrationer (0-200 uM) og sammenlignet med en 0,2% Triton X-100 positiv kontrol, for hvilken hæmolyse blev defineret som 100%. Fejl barer i alle tal repræsenterer standard fejl af de midler (n = 3).

For at vurdere

in vitro

cytotoksicitet af de designede peptider, LDH lækage blev målt i cancer cellelinier (HeLa, HCT116 og B16 /F10) og normale cellelinier (HaCat, BJ og NIH 3T3). BR2 behandling (20-100 uM) var forbundet med LDH lækage fra cancerceller; lækagen gradvist øges med BR2 koncentrationer, nåede omkring 40-60% ved 100 uM (fig. 1B

a-c

). Imidlertid blev LDH lækage fra BR2-behandlede normale celler ikke påvist ved BR2 koncentrationer under 70 uM, og en svag lækage (~17%) blev observeret ved 100 pM (Fig. 1B

d-f

). BR3 inducerede betydelig LDH lækage fra både kræft (ca.. 80-90%) og normale cellelinier (cirka. 30%), selv ved 50 uM (fig. 1B

a-f

).

til undersøgelse af cytotoksiciteten af ​​peptider endvidere blev hæmolytiske aktivitet af BR1, BR2, BR3 og Tat mod humane erythrocytter også undersøgt. I overensstemmelse med LDH lækage resultater blev ingen hæmolyse induceret selv efter erytrocytterne blev behandlet med Tat, BR1 eller BR2 på ≥200 uM, hvorimod BR3 udløst hæmolyse (≥5%) ved ≥ 25 pM (Fig. 1C). Efterfølgende ca. 34,3% af erythrocytter blev lyseret efter at være blevet behandlet med 200 pM BR3. Tilsammen indikerer disse resultater, at BR2 effektivt trænger kræftceller uden cytotoksiske virkninger i normale celler, hvorimod Tat viste lignende indtrængen i begge celletyper.

BR2 Konkret Trænger kræftceller i en koncentrationsafhængig måde

for at sammenligne mængden af ​​de internaliserede peptider i forskellige celletyper, vi udførte flowcytometrisk analyse. BR2 blev internaliseret mere effektivt ind i kræftceller (HeLa, HCT116 og B16 /F10) end i normale celler (HaCat, BJ og NIH 3T3); mere end 95% af BR2-behandlede cancerceller internaliseres BR2, mens kun 23-34% af BR2-behandlede normale celler gjorde. Imidlertid Tat trængte både cancer og normale celler uden megen diskrimination (fig. 2A). Specifik penetration af BR2 og Tat til kræftceller blev også analyseret i nærvær af både HeLa og BJ fibroblastceller ved konfokal laser mikroskopi. BR2 blev fortrinsvis uptaken af ​​HeLa-celler, mens den cellulære optagelse af Tat var ens i begge HeLa og BJ fibroblastceller (fig. S1). Disse resultater viser klart, at buforin-derivatet BR2 har kræft celle specificitet, hvorimod Tat ikke.

(A) Analyse af cellepenetrerende effektiviteten af ​​hvert peptid i forskellige celletyper ved flowcytometri. FITC-mærket Tat, BR1 og BR2 peptider (10 uM) blev tilsat til forskellige celletyper: HeLa, HCT116 og B16 /F10 cancerceller og HaCat, BJ og NIH 3T3 normale celler. Efter 30 min inkubation ved 37 ° C blev FITC-positive celler talt ved flowcytometri. Værdier repræsenterer procentdelen af ​​fluorescens-positive celler i den totale cellepopulation. (B) Kvantitativ vurdering af celle penetration af hvert peptid ved flowcytometri. HeLa-celler blev inkuberet med FITC-mærkede peptider ved koncentrationer på 1, 2, 5 eller 10 uM i 30 minutter ved 37 ° C. Derefter blev cellerne vasket med koldt PBS og høstet, og cellulært fluorescens blev analyseret ved flowcytometri. Kontrolceller modtog ikke peptid behandling. Før analyse blev ekstracellulær fluorescens af overfladebundne peptider fjernes ved en trypsinbehandling (1 mg /ml i 10 min).

Fluorescensintensiteten af ​​peptid-behandlede celler var forøget med stigende koncentrationer af BR2 eller Tat. Ved koncentrationer over 5 uM, BR2 indtastet mere end 80% af HeLa-celler inden for 30 minutter (fig. 2B). BR2 trængt celler mere effektivt end gjorde Tat peptidet ved hvert testede koncentration. Desuden BR2 internalisering for alle cancercellelinier (HCT116 og B16 /F10, data ikke vist) viste sig at være homogen i hele cellepopulationen som en enkelt top på histogrammet. Blandt de peptider, BR1 viste den laveste optagelse, angiver dens manglende evne til at trænge ind i cellemembranen selv ved 10 uM.

Initial Elektrostatisk Interaktion med positivt ladet BR2 og negativt ladede Gangliosider på kræftcellen Membrane er afgørende for Energi -afhængige Endocytose af BR2

den cellulære optagelse mekanisme BR2 blev analyseret med HeLa, de mest repræsentative og udbredte kræft cellelinje, at sammenligne med andre celle-gennemtrængende peptider. Vi først undersøgte effekten af ​​temperatur på BR2 penetration. Sænkning af temperaturen dramatisk reduceret peptid optagelse i HeLa-celler (figur 3A.); den cellulære optagelse af BR2 og Tat ved 4 ° C blev reduceret med 88,5% og 31,6%, sammenlignet med det observerede ved 37 ° C. Desuden blev også observeret en energi-afhængig optagelse af peptider, når den cellulære ATP puljen blev depleteret ved præinkubation af cellerne med natriumazid (NaN

3). ATP udtynding reducerede også optagelsen af ​​BR2 og Tat i HeLa-celler, med 67,7% og 42,5%, henholdsvis (fig. 3A). Disse resultater understøtter inddragelsen af ​​endocytose for BR2 og Tat optagelse.

(A) Virkninger af lav temperatur og energi udtynding på internalisering af FITC-mærkede peptider i HeLa-celler. HeLa-celler blev enten præinkuberet ved 4 ° C eller forbehandlet med natriumazid (NaN

3) for at depletere ATP i 1 time og derefter inkuberet med 5 uM Tat eller BR2 i 30 minutter under de samme betingelser, som beskrevet i Materialer og Metoder. Peptid optagelse blev bestemt ved flowcytometri. (B) Virkninger af endocytiske inhibitorer på optagelse af BR2 og Tat. Indflydelsen af ​​hæmmende lægemidler på peptid optagelse blev bestemt ved præinkubering af HeLa-celler med endocytose inhibitorer nocodazol, amilorid eller methyl-ß-cyclodextrin i 1 time før tilsætning af FITC-mærkede peptider. Efter peptid behandling i 30 min ved 37 ° C blev FITC-positive celler talt ved flowcytometri. Værdier repræsenterer procentdelen af ​​fluorescens-positive celler i den totale cellepopulation. Dataene repræsenterer gennemsnittet ± s.d. af tre uafhængige forsøg. (C) co-lokalisering af BR2 med lysosomale markør LYSOTRACKER red DND-99 i levende HeLa celler. Efter 30 minutters inkubation af BR2 (5 uM) med LYSOTRACKER blev levende HeLa-billeder opnået ved konfokal mikroskopi. (D) Virkninger af negativt ladede molekyler (gangliosider, hepariner og sialinsyrer) på peptid-optagelse. (A, b) HeLa-celler blev behandlet med BR2 og Tat i nærvær af gangliosider, hepariner eller sialinsyrer (hver, 20 ug /ml) i 30 min. I (c, d), blev HeLa-celler forbehandlet med PPMP (5 uM) at nedbryder gangliosider. Cellulære optagelse af BR2 og Tat blev bestemt ved flowcytometri. Som vist i fig. Cellelevedygtighed blev målt ved MTT-assayet.