PLoS ONE: Mincle, en medfødt Immune receptor, udtrykkes i urothelial Cancer Celler af Papillomavirus-associerede urothelial Tumorer af Kvæg

Abstrakt

Baggrund

Mincle, makrofag-inducerbare C-type lektin, er medlem af C-typen lectin-receptorer. Det spiller en vigtig rolle i anti-mycobakteriel og anti-svampe immunitet. Desuden registrerer døde celler gennem sin primære ligand SAP130.

Materialer og Fund

Vi undersøgte ti urothelial tumorer i urinblæren af ​​kvæg. Otte af dem udtrykte E5-cDNA af bovine papillomavirus type 2 (BPV-2) og type 13 (BPV-13), der hører til Deltapapillomavirus slægten. To af dem blev ikke undersøgt for detektion af E5-cDNA. Mincle ekspression synes at forekomme i kun urothelial neoplastiske celler. Nr mincle ekspression blev detekteret i urothelial celler fra sundt kvæg. Mincle udtryk var præget af en membranøs mønster i papillære urothelial kræftformer; isolerede og /eller grupperet urothelial celler viser en stærk cytoplasmatisk immunoreaktivitet primært ses i invasive urothelial kræftformer.

Konklusion

Dette er den første undersøgelse om ekspression af mincle i veterinær onkologi og den første rapport som beskriver ekspressionen af ​​funktionelt mincle receptor i neoplastiske celler i medicinsk litteratur. Som det er blevet vist, at urothelial cancerceller har evnen til at fungere som antigenpræsenterende celler (APC’er), er det tænkeligt, at mincle ekspression er involveret i præsentationen af ​​cancer-antigener til celler i immunsystemet. Da udtryk for mincle bidrager til kontrol af

Mycobacterium bovis

BCG-infektion, denne undersøgelse har spændende kliniske implikationer i komparativ medicin holde for øje, at Bacillus Calmette-Guérin (BCG) immunterapi er i øjeblikket den mest effektive behandling af non-muskel invasiv blærekræft i mennesket. Mincle udtryk i urothelial warrants tumorceller yderligere undersøgelse for bedre at forstå den rolle, om nogen, af denne receptor i blærekræft. Fremtidige studier vil give indsigt i rollen som mincle receptor af urothelial kræftceller i antitumor immunterapi

Henvisning:. Roperto S, Russo V, Esposito I, Ceccarelli DM, Paciello O, Avallone L, et al. (2015) Mincle, en medfødt Immune receptor, udtrykkes i urothelial Cancer Celler af Papillomavirus-associerede urothelial Tumorer af Kvæg. PLoS ONE 10 (10): e0141624. doi: 10,1371 /journal.pone.0141624

Redaktør: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, UNITED STATES

Modtaget: Maj 22, 2015; Accepteret: September 28, 2015; Udgivet: 29 oktober 2015

Copyright: © 2015 Roperto et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

finansiering:.. forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

C-type lectin receptorer (CLRS) omfatter en stor superfamilie af proteiner primært udtrykkes på myeloide celler, hvor de reelt fungerer som mønstergenkendelse receptorer (PRRS) [1]. CRL’er omfatter mere end tusinde identificerede medlemmer fra adskillige dyrearter [2] og menes at være den fjerde familie af mønster-genkendelse-receptorer [3]. CLR’er genkende en bred vifte af ligander fra ‘nonself “(patogen-associeret molekylære mønstre-PAMPs),” beskadigede selvstændige «(beskadigelse-associeret molekylære mønstre-dæmper) eller” ændret selv “(tumor-associerede molekylære mønstre-stødere) [1 ].

Mincle, makrofag-inducerbare C-type lektin (også kaldet som CLEC4E), er medlem af CLR’er. Det blev oprindeligt identificeret som en transkriptionel mål af NF-interleukin-6 (IL-6), hovedsagelig udtrykt på professionelle antigenpræsenterende celler (APC’er), såsom makrofager, dendritiske celler (DC’er), B-celler, og neutrofiler [4]. Ekspressionsniveauet af mincle i steady-state tilstand er meget lav; imidlertid er det stærkt opreguleres efter udsættelse for forskellige inflammatoriske signaler [5]. Mincle synes at være selektivt forbundet med Fc gamma-receptor (FcyR) og aktiverer makrofager til at producere inflammatoriske cytokiner og chemokiner [6]. Mincle er en vigtig receptor for det mycobakterielle ledningen faktor trehalosedimycolat (TDM) dermed et vigtig modulator af det antimikrobielle immunitet [7,8]. Mincle har en afgørende rolle i svampedræbende immunitet, som det genkender nogle patogene svampe såsom

Candida albicans

,

malassezia

arter og

Fonsecaea pedrosoi

, det agens af chromoblastomykose [9 -11]. Endvidere mincle sanser døde celler gennem sin primære ligand SAP130 (spliceosome-associeret protein 130), en lille ribonucleoprotein frigivet fra nekrotiske celler kun [6]. For nylig er det blevet vist, at det naturlige produkt brartemicin, en inhibitor af cancercelleinvasion, er en høj-affinitetsligand kulhydrat-genkendelse (CRD) af mincle receptor [12].

Mincle blev for nylig fundet skal udtrykkes i ikke-immune celler, såsom neuroner og endotelceller efter iskæmisk slagtilfælde hos både mus og mennesker; Derfor er det blevet foreslået, at mincle og dens ligand SAP130 deltage i patogenesen af ​​cerebral iskæmi ved igangsætning af inflammation [13, 14]. Salg

urinblæretumorer er meget sjældne hos kvæg tegner sig for 0,01% af alle bovine maligniteter [15]. Tværtimod blære neoplasmer er almindelige i voksent kvæg, der fodres med pasturelands rige på bregner bregne (

Pteridium

spp.) [16-19]. Ptaquiloside, et bregner sesquiterpenoid-, og smitstoffer menes at være ansvarlig for blære celle transformation. Selv om mange bakterier er fundet i urinen mikrobiota af kvæg er ramt af blæretumorer [20], bovine papillomavirus (BPVs) af Delta slægten synes at være de vigtigste smitsomme stoffer involveret i etio-patogenetiske mekanismer blære carcinogenese. Navnlig bovin papillomavirus type 2 (BPV-2) og type 13 (BPV-13) synes at være den mest fremherskende virus, der blære tumor hos kvæg [17, 21-26].

Formålet med den nuværende papir er at rapportere udtryk for mincle receptor i urothelial cancerceller af naturligt forekommende papillomavirus-associerede urothelial tumorer hos kvæg.

Materiale og metoder

Etik erklæring

i denne undersøgelse vi har ikke foretaget dyreforsøg. Vi indsamlede prøver direkte fra private og offentlige slagterier; dyrene er slagtet efter en obligatorisk undersøgelse klinisk før slagtning som krævet af Den Europæiske Union (EU) lovgivning.

tumorprøver

Ti kvæg urothelial tumor prøver og fem blære prøver fra tilsyneladende raske køer var indsamlet med tilladelse af de medicinske myndigheder på slagterierne med navnet “Barbara Rocco sas” af Simbario (Calabria-regionen), “Macello Comunale” Muro Lucano (regionen Basilicata), “Cestari Carni srl” af Montesano sulla Marcellana (regionen Campania), “Frigo Sud srl” i Nocera Superiore (regionen Campania), “Rigtig Beef srl” af Flumeri (regionen Campania).

for at undgå cross-forureninger, både neoplastiske og normale blære prøver blev straks delt i flere dele . Nogle dele blev frosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -80 ° C til efterfølgende molekylærbiologiske analyser. De resterende dele blev fikseret i 10% bufferet formalin til mikroskopiske undersøgelser.

Histopatologi

væv fikseret i 10% bufferet formalin blev rutinemæssigt indlejret i paraffin. Histologisk diagnose blev vurderet på 5-um-tyk hæmatoxylin-eosin (HE) -stained sektioner ved hjælp af morfologiske kriterier foreslået i rapporten om den nye histologiske klassifikation af urothelial tumorer i urinblæren af ​​kvæg [19].

RNA-ekstraktion

Totalt RNA blev ekstraheret fra urin blærer af køer ved hjælp af RNeasy Mini Kit (Qiagen, Milano, Italien) i overensstemmelse med producentens anvisninger. Kvantiteten og kvaliteten af ​​RNA blev vurderet ved anvendelse af NanoVue Plus og elektroforese på 1% agarosegel. Genomisk DNA blev fjernet fra RNA-præparater ved anvendelse af RNase-fri DNase I Fermentas Life Sciences (Dasit, Milano, Italien).

revers transkription (RT) -PCR for BPV-2, BPV-13 E5, Mincle, FcyR og CXCL2

Totalt RNA blev transkriberet under anvendelse af iScript cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad Laboratories, Milano, Italien), og reaktionen blev inkuberet ved 25 ° C i 5 minutter, 42 ° C i 30 minutter, 85 ° C i 5 minutter, og derefter holdt ved 4 ° C i 5 min. Det syntetiserede cDNA blev analyseret ved PCR med specifikke primere for BPV-2 E5 ORF (fremad, 5′-CACTGCCATTTGTTTTTTTC-3 ‘; revers, 5′-GGAGCACTCAAAATGATCCC-3’), for BPV-13 E5 ORF (fremad, 5 »- CACTGCCATTTGGTGTTCTT-3 ‘; revers 5’AGCAGTCAAAATGATCCCAA-3′), for Mincle (fremadrettet primer, 5’GACTGAGGGTCAGTGGCAAT -3« revers primer, 5’- GTCCCTTATGGTGGCACAGT-3 ‘), for FcyR (fremadrettet, 5’ – TTTGGTTGAACAAGCAGCGG-3 ‘; revers 5’TGCAACTTGAGTCGGCAGTA 3′) og for CXCL2 (fremadrettet, 5’-GCCGCTCCCATGGTTAAGAA-3 ‘; revers 5’TCTGTAGGGGCAGGGTCTAC 3′). For at evaluere tilstrækkeligheden af ​​cDNA prøver, en kontrol-PCR for kvæg β-actin sekvens blev udført ved hjælp af et sæt af primere designet af Primer BLAST software (fremad, 5’-GAGCGTGGCTACAGCTTCAC-3 ‘; omvendt, 5′-CATTGCCGATGGTGATGA-3’ ). RT-PCR blev udført i en reaktionsblanding 25 pi indeholdende 2,5 pi 10 x buffer, 2 mM MgC

2, 2,5 U AmpliTaq Gold DNA Polymerase (Life Technologies, Monza, Italien), 480 nM af hver primer og 200 mM af hver dNTP og 50 ng DNA ekstrakt. PCR-programmet var 95 ° C i 3 minutter, efterfulgt af 35 cykler af denaturering ved 95 ° C i 30 s, annealing ved 60 ° C i 30 s og ekstension ved 72 ° C i 1 min. En endelig ekstension ved 72 ° C i 7 min blev udført i hver PCR-assay. Gelelektroforese af 20 pi amplificeret DNA demonstrerede et produkt med den forventede størrelse. I hvert forsøg blev en blindprøve bestående af reaktionsblandingen uden DNA inkluderet. Så vidt BPV E5-cDNA-analyse blev anvendt en positiv prøve bestående af klonet BPV-2 (en venlig gave af Dr. A. Venuti) og et BPV-13 positiv prøve (en venlig gave af Dr. A. A. Alfieri). Amplificeret DNA blev oprenset gennem kiselgelark membraner ved anvendelse af QIAquick PCR kvantificering kit ifølge producentens instruktioner (Qiagen, Milano, Italien). RT-PCR-produkter, efter separation ved gelelektroforese, blev sekventeret under anvendelse af en Sanger-metoden baseret automatisk sequencer (ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer, Life Technologies, Monza, Italien). Desuden blev den amplificeret Mincle DNA fra sunde og patologiske blærer klonet i pGEM-T-vektor ved anvendelse af pGEM-T Easy Vector System (Promega, Milano, Italien) og sekventeret i det automatisk virkende apparat (ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer, Life Technologies).

Kvantitativ Real Time-PCR-analyse (QRT-PCR) for Mincle

for QRT-PCR-analyse, 500 ng RNA blev revers transkriberet ved hjælp af iScript cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad Laboratories, Milano , Italien), og reaktionen blev inkuberet ved 25 ° C i 5 min, 42 ° C i 30 min, 85 ° C i 5 min, og derefter holdt ved 4 ° C i 5 min. Real Time reaktioner blev udført under anvendelse SsoFast EvaGreen Supermix (Bio-Rad Laboratories, Milano, Italien). Til påvisning af Mincle specifikke primere (som beskrevet ovenfor) blev anvendt. Alle reaktioner blev udført i tre eksemplarer og β-actin blev anvendt som intern standard (fremadrettet primer 5′- TAGCACAGGCCTCTCGCCTTCG-3 ‘; revers primer 5′- GCACATGCCGGAGCCGTTGT-3’).

Western blot-analyse på blære prøver for mincle protein

raske og syge blærer blev solubiliseret i 2 timer ved 4 ° C i lysisbuffer indeholdende 50 mM Tris-HCI pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100. Umiddelbart før anvendelse blev følgende reagenser tilsat: 1 mM DTT, 2 mM PMSF, 1,7 mg /ml aprotinin, 25 mM NaF, 1 mM Na

3VO

4 (Sigma-Aldrich, Milan, Italien).

Lysater blev afklaret ved 15000 rpm i 30 min. Proteinkoncentrationen blev målt under anvendelse af Bradford-assayet (Bio-Rad Laboratories, Milano, Italien). Til Western blotting blev 100 ug af lysat proteiner opvarmet ved 100 ° C i 4X forblandet Laemmli prøvebuffer (Bio-Rad Laboratories, Milano, Italien). Proteiner blev underkastet natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) under reducerende betingelser.

Efter elektroforese blev proteiner overført på nitrocellulose filter membraner (GE Healthcare Life Sciences, Chalfont St Giles, UK) i 1 time ved 10 V i 192 mM glycin /25 mM Tris-HCI (pH 7,5) /10% methanol ved anvendelse af en Trans-Blot SD Semi Dry celle (Bio-Rad Laboratories, Milano, Italien) ifølge producentens instruktioner. Membranerne blev blokeret med 5% bovint serumalbumin (BSA) i Tris-bufret saltvand (TBS, pH 7,5) i 1 time ved stuetemperatur, vasket med TBS-0,1% Tween. Derefter blev filtrene undersøgt med anti-Mincle (CLEC4E (P-15): sc-161.486, (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) fortyndet 1: 1000 i 5% BSA i inkubation natten over ved 4 ° C efter tre vaske. i Tris-bufret saltvand blev membraner inkuberet med peberrodsperoxidase-konjugeret anti-gede-IgG (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) i 1 time ved stuetemperatur. efter passende vasketrin, blev bundet antistof visualiseret ved et forøget kemiluminescens-systemet (Western blotting Luminol Reagent, Santa Cruz Biotechnology, CA, USA). Billeder blev erhvervet med Image Lab Software version 2.0.1 (Bio-Rad Laboratories, Milano, Italien).

Immunhistokemi

Alle patologiske prøver blev immunfarvet og sektioner af normal bovin urinblære mucosa blev testet parallelt som kontrol under anvendelse af avidin-biotin-peroxidase-kompleks (ABC) -metoden med Vectastain ABC kit (Vector Laboratories, Inc., CA, USA). Kort fortalt, paraffinsnit blev afparaffiniseret, og blokeret for endogen peroxidase i 0,3% H

2O

2 i methanol i 20 min. Antigen forøgelse blev udført ved at forbehandle med mikrobølgeopvarmning (to gange i 5 min hver ved 750 W) i citratpuffer pH 6,0. Objektglassene blev vasket tre gange med phosphatbufret saltvand (PBS; pH 7,4, 0,01 M), derefter inkuberet i 1 time ved stuetemperatur med normalt kaninserum (Vector Laboratories Inc., CA, USA) fortyndet til 20%. Polyklonalt gede-anti-CLEC 4E, anti-Fc ε RIγ, anti-Card9 og et monoklonalt muse-anti-Syk (Santa Cruz Biotechnology Inc., CA, USA) primære antistoffer fortyndet med 1: 200, 1 i 400, 1 i 300 og 1 i 50, henholdsvis i phosphatpufret saltvand (PBS), blev påført natten over ved stuetemperatur i et fugtigt kammer. Objektglassene blev vasket tre gange med PBS, derefter inkuberet i 30 minutter med passende biotinyleret sekundært antistof-anti-ged (Vector Laboratories Inc., CA, USA) fortyndet med 1: 200 i PBS. Snit blev vasket tre gange med PBS og derefter inkuberet med Vectastain ABC-reagens (Vector Laboratories Inc., CA, USA) i et fugtigt kammer ved stuetemperatur. Farveudviklingen blev opnået ved behandling med 3, 3′-diaminobenzidin (Vector Laboratories Inc., CA, USA) i 2-10 min. Snit blev modfarvet med Mayers hæmatoxylin. Det primære antistof blev udeladt og erstattet af antistoffortyndingsmiddel i negative kontroller, hvor der ikke baggrundsfarvning blev detekteret.

Resultater Salg

Som mislykkede infektioner af BPV-2 og BPV-13 almindeligvis er forbundet med urotelial tumorer i urinblæren af ​​kvæg, dels studerede vi, om transkripter af E5 protein, virus større onkoprotein, var til stede i tumorer. RT-PCR viste både BPV-2 og BPV-13 E5 transkripter på kun tumorceller; ingen E5 transkripter blev detekteret i raske blære prøver. Tilstedeværelsen af ​​BPV-2 og BPV-13 E5 RNA blev bekræftet ved sekventering af amplikoner ifølge BPV-2-sekvensen M20219.1 og BPV-13 sekvensen JQ798171.1 (figurerne 1 og 2). Mikroskopiske mønstre af urothelial cancere og påvisning af papillomavirus E5 transkripter er opsummeret i tabel 1.

Vurdering af BPV-2 E5-cDNA ved revers transkriptase polymerasekædereaktion (RT-PCR). M: 50 bp molekylær markør (HyperLadder II Bioline); 2-3: sunde urinblære prøver; 4-6: blære tumorprøver; 7: positiv kontrol (klonet BPV-2 DNA); 8: negativ kontrol (intet DNA tilsat). Pilen angiver positionen af ​​154 bp BPV-2 E5 PCR-produkt.

Vurdering af BPV-13 E5-cDNA ved revers transkriptase polymerasekædereaktion (RT-PCR). M: 50 bp molekylær markør (HyperLadder II Bioline); 2-3: sunde urinblære prøver; 4-6: blære tumorprøver; 7: positiv kontrol (BPV-13 DNA); 8: negativ kontrol (intet DNA tilsat). Pilen angiver placeringen af ​​153 bp BPV-13 E5 PCR-produkt

Mincle protein blev afsløret både raske og patologiske prøver ved Western blot undersøgelse.; proteinet syntes at være overudtrykt i tumorprøver i sammenligning med sunde prøver (Fig 3). RT-PCR afslørede tilstedeværelsen af ​​mincle transkripter både i normale og cancer prøver. Efter kloning og sekventering viste mincle transkripter en 98% og 99% identitet med henholdsvis Bos taurus mincle gen deponeret i GenBank under accessionsnummer XM_010827920.1 (figur 4). QRT-PCR detekterede en statistisk signifikant stigning af mincle mRNA-niveauer i patologiske prøver (Fig 5).

(x) Western blot-analyse, der viser en statistisk signifikant overekspression af Mincle protein i tumor blærer. Bane 1-3: urinblæren fra sunde dyr. Bane 4-6: neoplastisk væv fra repræsentative tre dyr med papillomavirus-associerede tumorer i urinblæren. Actin proteinniveauer blev påvist at sikre lige protein loading. (Y) Kvantitativ densitometrisk analyse af filtrene blev udført med Image Lab software (ChemiDoc; Bio-Rad Laboratories) og betydning bestemmes af Student T-test (*, p ≤ 0,05)

Lane. M, Molecular massemarkør (1 kb DNA-stige, Microtech). Bane 2-4: Fire normale (kontrol) prøver fra raske kvæg. Banerne 5-7: ni repræsentative tumor prøver. Bane 8: negativ kontrol (intet DNA tilsat). De øvre og nedre dele af figuren viser 99% og 98% homologi, henholdsvis mellem sekvensen af ​​amplikoner, efter kloning, og sekvensen af ​​bovint MINCLE deponeret i GenBank (XM_010827920.1).

Den relative ekspression af MINCLE niveauer i neoplastiske væv. Relative mRNA-niveauer, beregnet ved hjælp af den ΔΔCT metode, repræsenterer fold ændringer i forhold til blære prøver fra sundt kvæg. Alle værdier blev normaliseret til den interne kontrol β-actin. Resultaterne repræsenterer de midler og standardafvigelser af tre uafhængige forsøg udført in triplo. (*, P ≤ 0,05, vs urinblære fra sunde dyr).

Morfologisk blev mincle protein opdaget af immunhistokemiske procedurer i urothelial tumorceller kun og ikke i normale urothelial celler. En membranøs mønster af mincle immunoreaktivitet sås i neoplastiske celler af både lav- og høj kvalitet papillære urothelial tumorer (Fig 6); desuden spredt og grupperet neoplastiske urothelial celler af både lav- og høj kvalitet invasiv urotelial cancer udviste en stærk immunoreaktivitet for mincle, overvejende i et cytoplasmatisk mønster udseende. Mincle ekspression blev også påvist i inflammatoriske celler spredt blandt kræftceller; navnlig blev receptorekspression set i tumorassocierede makrofager (TAM) (Fig 7).

En membranøs mønster af mincle ekspression blev set i endoluminale urotelial celleproliferation (pile). Indsat: Non immunoreaktivitet sås i normale urothelial celler. Mag. 40X; Bar:. 100 um

Grupperet af neoplastiske celler viste en stærk cytoplasmatisk immunoreaktivitet for mincle (sorte pile). Isolerede immunreaktive neoplastiske celler blev også set spredt i blærevæggen. Immunoreaktivitet var også tydeligt i tumor-associerede makrofager (Tams) (rød pil). Mag. 40X. Bar: 100 um

Det er kendt, at Mincle forbinder med adapteren protein FcyR som er nødvendig for initiering af signalering ved at binde Syk, som igen, aktiverer en signaleringskaskade gennem Card9 og denne begivenhed kundeemner. til induktion af cytokin og kemokin såsom CXCL2 [5, 6]. Derfor undersøgte vi FcyR mRNA-ekspression i både normale og patologiske blære prøver ved RT-PCR. Amplikoner, sekventering af som viste sig at være FcyR transkripter viser en identitet på 97% med Bos taurus FcyRI (GenBank Accessionsnummer: AF316499.1), blev påvist i prøver kun cancerpatienter (figur 8). Morfologisk, en stærk cytoplasmatisk og membranøs immunreaktivitet afslører en uventet, afvigende ekspression af FcyRI var tydelig i urothelial cancerceller (fig 9). Derefter undersøgte vi, om der kunne påvises en morfologisk udtryk for Syk-Card9 aksen i urothelial celler af sunde og neoplastiske prøver. En stærk immunoreaktivitet afslører en tydelig Syk-ekspression blev tydeligt detekteret i urotelial cancerceller (Fig 10). Endvidere også Card9 proteinekspression blev immunhistokemisk set i urothelial tumorceller. Nr immunoreaktivitet for Card9 viste sig i urothelial celler fra raske prøver (Fig 11).

Vurdering af FcyR-mRNA-ekspression ved revers transkriptase polymerasekædereaktion (RT-PCR). M: molekylær markør (HyperLadder II Bioline); 2-4: sunde urinblære prøver; 5-7: blære tumorprøver; 8: negativ kontrol (intet DNA tilsat). Den nederste del af figuren viser en identitet på 97% med Bos taurus FcγR1 (GenBank nummer: AF316499.1).

En stærk cytoplasmatisk og membranøs immunreaktivitet viser en afvigende ekspression af FcyR blev set i urothelial cancerceller. Indsat: Nej FcyR ekspression blev detekteret i normale urothelial celler. Mag. 40X; Bar: 100 um

En stærk immunoreaktivitet viser en tydelig udtryk for Syk blev set i urothelial kræftceller.. Indsat: Ingen immunoreaktivitet for Syk blev detekteret i normale urothelial celler. Mag. 40X; Bar:. 100 um

En stærk cytoplasmatisk immunoreaktivitet viser et klart udtryk for Card9 blev set i urothelial kræftceller. Indsat: Ingen immunoreaktivitet for Card9 blev set i normale urothelial celler. Mag. 40X; Bar:. 100 um

Endelig har vi studerede mRNA udtryk for CXCL2, en pro-inflammatorisk chemokin. RT-PCR afslørede en tilstedeværelse af cDNA i prøver kun kræft; sekvenser opnået fra amplikoner bekræftet at være CXCL2 udskrifter som viste en 98% identitet med Bos taurus CXCL2 (GenBank nummer: NM_174299.3). (Fig 12)

Vurdering af CXCL2 mnRNA udtryk ved revers transkriptase polymerasekædereaktion reaktion (RT-PCR). M: molekylær markør (HyperLadder II Bioline); 2-4: sunde urinblære prøver; 5-7: blære tumorprøver; 8: negativ kontrol (intet DNA tilsat). Den nederste del af figuren viser en 98% identitet med Bos taurus CXCL2 (GenBank nummer: NM_1742993).

Diskussion

Vi har registreret mincle udtryk i papillomavirus-associerede urothelial tumorer i urinblæren hos kvæg. Dette er den første rapport af ekspressionen af ​​mincle i veterinær onkologi og den første observation beskriver ekspressionen af ​​funktionelt mincle receptor i neoplastiske celler i medicinsk litteratur. Morfologisk blev mincle protein ses i urothelial neoplastiske celler kun men ikke i normale urothelial celler, som kan betyde, at niveauet af mincle ekspression er så lav i steady-state tilstand for ikke at blive opdaget af immunohistokemiske fremgangsmåder. Vi udelukker ikke, at mincle detekteret i raske blære kommer fra klynger af lymfoide og makrofagceller, der normalt er til stede i blærevæggen af ​​sunde køer.

Det er muligt, at genomiske ændringer fører til dysregulering af nogle CLR gener kan være ansvarlig for mincle samt FcyRI ekspression i urothelial tumorceller; Det er også tænkeligt, at mincle ekspression kunne aktiveres af nogle endogene ligander, fordi mange nekrotisk foci, der kan forårsage frigivelse af selv-komponenter ses i urothelial tumorer i urinblæren af ​​kvæg. Derfor kan mincle være involveret i induktionen af ​​en pro-inflammatorisk respons efter sensing komponenter frigivet fra døde celler. Ifølge Suzuki et al. [13], mange endogene ligander for mincle receptor stadig at blive identificeret.

Det er blevet foreslået, at urothelial celler (herunder blære cancerceller selv) er i stand til at producere cytokiner og chemokin og er involveret i præsentationen af cancercelle antigener til celler i immunsystemet [27]. Faktisk er der fundet nogle kemokinreceptorer på urothelial kræftceller [28]. For nylig er der fundet nogle ligander for kemokinreceptorer CXCR4 og CXCR7 at blive udskilt ved urotelial kræft i humane urinblære [29]. Derfor er det blevet foreslået, at urothelial cancerceller har evnen til at fungere som antigenpræsenterende celler (APC’er). Denne evne synes at være klinisk relevant, da det ville påvirke gentagelse af blærekræft [30].

Selvom mincle udtryk i urothelial warrants tumorceller yderligere undersøgelse for bedre at forstå den rolle af denne receptor i blærekræft, har denne rapport spændende kliniske implikationer i komparativ medicin. Bacillus Calmette-Guérin (BCG) immunterapi er i øjeblikket den mest effektive behandling af ikke-muskel invasiv blærekræft i mennesket [31]. Selv BCG har været anvendt til behandling af blærekræft i næsten 40 år, den måde, hvorpå den opnår sin terapeutiske effekt er stadig et spørgsmål om undersøgelse [27]. Det er blevet vist, at blærekræft cellelinier er i stand til at internalisere BCG [32]. Det er blevet antaget, at internalisering af BCG ved blære cancerceller reguleres af tilstedeværelsen af ​​visse ukendte oncogene aberrationer, der aktiverer macropinocytosis [27]. Derfor kan blære tumorceller har en rolle i den første indregning og forarbejdning af BCG, hvilket fører til immunsystemet rekruttering; dog skal patogenetiske mekanisme (r) blive belyst [27]. Toll-lignende receptorer er blevet fundet på dyrkede normale og urothelial tumorceller og kan have en rolle i antitumor immunitet nonmuscle invasive tumorer [33].

Mange spørgsmål forbliver stadig ubesvarede og mange områder kræver yderligere undersøgelser, da undersøgelser har endnu ikke evalueret rolle internalisering af BCG ved blære cancerceller

in vivo

[27]. Vores undersøgelse giver os mulighed for at hypotesen, at funktionelle mincle receptor af neoplastiske urothelial celler kan have en afgørende rolle i at anerkende og internalisere BCG. Vores forslag synes at være bekræftet af de seneste rapporter viser, at ekspressionen af ​​mincle bidrager til kontrol af

Mycobacterium bovis

BCG-infektion [34].

Fremtidige undersøgelser vil forhåbentlig være meget nyttigt at give indsigt i rolle mincle receptor urothelial cancerceller i antitumor immunterapi. I denne sammenhæng kan mincle receptor undersøges i dybden i naturligt forekommende bovine urothelial tumorer og kvæg kan tjene som en naturlig dyremodel. Det har vist sig, at der er en høj grad af sekvens identitet mellem den menneskelige og bovine form for mincle og de interagerer med ligander i en meget lignende måde [35].

Støtte Information

S1 Fig. S1 sekventering efter kloning af Mincle fra heathy prøver

doi:. 10,1371 /journal.pone.0141624.s001

(PDF)

S2 Fig. S2 sekventering efter kloning af Mincle fra patologiske prøver

doi:. 10,1371 /journal.pone.0141624.s002

(PDF)

Tak

Vi takker Prof. A. Venuti , Istituto dei Tumori ‘Regina Elena «, Roma, for at give BPV-2 DNA-plasmid; Prof. A. A. Alfieri, Laboratoriet for Animal Virologi, Institut for Veterinær forebyggende medicin, Universidade Estadual de Londrina, Brasilien for at levere de BPV-13 DNA-husly prøver og Dr. G. Salvatore, Regione Basilicata, og Dr. F. Luposella for deres tekniske hjælp.