PLoS ONE: Nonsense Mediated Decay Resistant Mutationer er en kilde af udtrykte Mutant Proteiner i Colon Cancer cellelinjer med mikrosatelitter ustabilitet

Abstrakt

Baggrund

rammeskift mutationer i mikrosatellit ustabilitet høj (MSI-High) tarmkræft er en potentiel kilde til målsøgende neo-antigener. Mange nonsens udskrifter er genstand for hurtig nedbrydning som følge af nonsens-medieret henfald (NMD), men nonsens udskrifter med et CMS i den sidste exon eller nær sidste exon-exon junction har iboende modstand mod nonsens-medieret henfald (NMD). NMD-resistente udskrifter er derfor en sandsynlig kilde udtrykte mutant proteiner i MSI-High tumorer.

Metoder

Brug antistoffer mod det konserverede N-termini af forudsagte mutant proteiner, vi analyserede MSI-High kolorektale cancercellelinjer for eksempler på naturligt udtrykte mutantproteiner følge af rammeskift mutationer i kodende mikrosatellitter (CMS) ved immunopræcipitation og Western blot eksperimenter. Fundne mutante proteinbånd fra NMD-resistente transkripter blev yderligere valideret af genspecifikke korte interfererende RNA (siRNA) knockdown. En genom-dækkende søgning blev udført for at identificere CMS-indeholder gener, der kan generere NMD-resistente udskrifter, der kunne koder for antigen udtrykt mutant proteiner i MSI-High tyktarmskræft. Disse gener blev screenet for CMS mutationer i MSI-High tyktarmskræft cellelinjer.

Resultater

Mutant protein bånd med forventet molekylvægt blev påvist i muterede MSI-High cellelinjer til NMD-resistent udskrifter (CREBBP, EP300, TTK), men ikke NMD-følsomme udskrifter (BAX, CASP5, MSH3-). Ekspression af mutant CREBBP og EP300 proteinerne blev bekræftet ved siRNA knockdown. Fem CMS-bærer gener identificeret fra genomet hele søgning og uden eksisterende mutation data (SFRS12IP1, MED8, ASXL1, FBXL3 og RGS12) viste sig at være muteret i mindst 5 af 11 (45%) af de MSI-High cellelinjer testet.

Konklusion

NMD-resistente udskrifter kan give anledning til udtrykte mutant proteiner i MSI-High kolon kræftceller. Hvis almindeligt udtrykt i primære MSI-High kolon kræft, MSI-afledte mutantproteiner kunne være nyttige som kræft specifikke immunologiske mål i en vaccine rettet mod MSI-Høj colon tumorer

Henvisning:. Williams DS, Bird MJ, Jorissen RN Yu YL, Walker F, Zhang HH, et al. (2010) Nonsense Mediated Decay Resistant Mutationer er en kilde af udtrykte Mutant Proteiner i Colon Cancer cellelinjer med mikrosatelitter ustabilitet. PLoS ONE 5 (12): e16012. doi: 10,1371 /journal.pone.0016012

Redaktør: Ben C. B. Ko, kinesiske University of Hong Kong, Hongkong

Modtaget: 24 august 2010; Accepteret: December 3, 2010; Udgivet: December 31, 2010

Copyright: © 2010 Williams et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette projekt blev delvist finansieret af NHMRC Program Grant nummer 487922. Finansiering støtte til dette arbejde blev også leveret af en CASS (Bidrag til Australian Scholarship Science) Foundation Natur- og Sundhedsvidenskabelige Grant (DSW, AWB, ECN), Kræftens Råd Victoria (eN) og en Royal College of Pathologists af Australasien Kitamura /Kanematsu Memorial Award og teknisk Grant Assistance (DSW). Dette arbejde blev også støttet af midler fra det operationelle Support Infrastructure Program fra den victorianske regering, Australien. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Ca. 15% af tyktarmen og gastriske og livmoderkræft har defekt DNA mismatch repair og højt niveau mikrosatellit instabilitet (MSI-høj) [1], [2]. Mest MSI-Høje tumorer skyldes sporadisk hypermethylering af MLH1 genpromotoren [3], men mutation af et DNA mismatch reparation enzym er den underliggende defekt i tilfælde af arvelig ikke-polypose colorectal cancer (HNPCC) [4]. Tumorer med MSI har en form for genetisk ustabilitet, der manifesterer sig som rammeskift mutationer i repetitive mikrosatellit sekvenser af DNA [1]. Rammeskift mutationer i kodende mikrosatellitter (CMS) ændre den genetiske læseramme og i de fleste tilfælde koder for trunkerede proteiner med unikke C-terminale proteinsekvenser.

En spændende patologisk træk af MSI-High kolorektale cancere er en tendens til at have øget antallet af tumor infiltrerer lymfocytter (TIL’er) i forhold til MSI-Low og mikrosatellit stabil (MSS) tumorer [5]. Den TIL’er i MSI-Høje tumorer aktiveres CD8 + cytotoksiske T-lymfocytter (CTL’er) [6], tilpasset anerkende intracellulære peptider, såsom MSI-afledte neo-antigener, der præsenteres af HLA klasse I molekyler. En MSI-High fænotype og øget TIL’er i en kolorektal cancer associationer en bedre scene-matchede prognose i forhold til MSI-Lave eller MSS tumorer [7], [8]. Denne overlevelsesfordel kan afspejle en beskyttende fordel af immun infiltrat [9].

Syntetiske peptider svarende til mutantproteiner forudsagt at hidrøre fra MSI-associerede læserammeforskydningsmutationer har vist sig at være immunogene. Gennem det seneste årti, cytotoksisk T-lymfocyt (CTL) reaktioner er blevet beskrevet mod HLA-A2 bindende peptider som følge af rammeskift mutationer i A10 CMS TGFBR2 [10], [11], A10 CMS CASP5 [12], T10 CMS af OGT [13], og for nylig T15 CMS af U79260 (FTO) [14]. er blevet påvist CTL reaktioner på mutant proteiner hos patienter med MSI tilknyttede tyktarmskræft og raske HNPCC-mutation luftfartsselskaber, øge muligheden for beskyttende immunosurveillance i sidstnævnte population [15].

Der er publiceret mutation data til rådighed for mindst 1522 mononukleotid kodning mikrosatellitter fra 460 gener i MSI-High kolorektal kræft [16]. Der er en korrelation mellem CMS længde og mutation sats. Gener med CMS mutationer er potentielle kilder til målsøgende proteiner til immunterapi strategier. Da læserammeforskydningsmutationer påvirker CMS gentagelser på en forudsigelig måde, mutantproteinerne genererede vil sandsynligvis blive bevaret i en population af patienter med MSI-High tyktarmskræft [17], [18]. Selv om ingen mutant transskript er fælles for alle MSI-Høje tumorer, kan en vaccine, som målretter et sæt fælles muterede proteiner være en effektiv behandling til MSI-High coloncancerformer. Der er behov for nye terapier mod MSI-High coloncancere, idet flere undersøgelser har vist, at disse tumorer at være resistente over for standard kemoterapeutika, såsom 5-fluoruracil [19], [20], [21].

eksistensen af ​​MSI-afledte mutante proteiner er blevet udledt ved immunologiske undersøgelser, men der er en mangel på offentliggjorte data vedrørende direkte påvisning af de forudsagte MSI-afledte mutante proteiner. Western blot analyser er blevet offentliggjort, hvor der blev registreret mulige mutant protein bands for CREBBP, EP300 [22] og MBD4 gener [23], men der var ingen validering af disse bånd. Bekræftelse af ekspressionen af ​​mutant proteiner i MSI-High tumorer er vigtigt, hvis disse er til at være succesfulde terapeutiske mål for en vaccine. Stabil ekspression af mutantproteiner, som letter cross præsentation af tumorantigener af professionelle antigenpræsenterende celler og stimulerer et T hjælper respons er sandsynligvis give fremragende anti-tumor-immunitet [18]. mest mutant udskrifter genereret af MSI er imidlertid målrettet til hurtig nedbrydning af nonsens-medieret henfald (NMD) [24], [25] og i mangel af interventionen, lidt til ingen målrette mutant protein vil blive genereret fra disse afvigende udskrifter [24 ].

i denne undersøgelse har vi opdaget tre MSI-afledte mutant proteiner, som alle opstår fra NMD-resistente udskrifter. Efter en genom-dækkende søgen efter yderligere NMD-resistente transkripter, blev CMS-holdige gener screenes for mutationer i et panel af 11 MSI-High kolon cancercellelinjer. Gener blev udvalgt til mutation analyse på grundlag af sandsynlige høj mutationsfrekvens (baseret på CMS længde), sandsynligvis immunogenicitet (baseret på mutant C-terminus aminosyre længde) og sandsynligvis ekspression i colon cancer (baseret på gen- og protein udtryk data hvor det er muligt ). Almindeligt muterede NMD-resistente udskrifter blev vurderet for sandsynlige HLA-A * 0201 CTL epitoper ved hjælp af

i silico

prædiktiv software, SYFPEITHI [26], til sammenligning med MSI-afledte epitoper allerede vist sig at være immunogen

i vitro

.

Vores resultater bekræfter, at NMD-resistente udskrifter giver anledning til udtrykte mutant proteiner, og også viser, at almindeligt forekommende læserammeforskydningsmutationer der genererer NMD-resistente udskrifter er en lovende kilde til målsøgende tumorantigener i MSI- høj coloncancerformer. Et sæt af almindeligt udtrykte mutant proteiner har potentiale til at danne grundlag for en multivalent vaccine eller immunterapeutisk rettet mod MSI-High tumorer.

Resultater

MSI-High Tyktarmskræft cellelinjer havnen læserammeforskydningsmutationer i flere CMS

Screening af tyktarmskræft cellelinjer for afvigende udtryk DNA mismatch reparation proteiner afslørede en unormal fænotype overensstemmelse med MSI i 11 af 17 cellelinier (tabel 1). Cellelinierne blev vurderet for læserammeforskydningsmutationer i et udvalg af gener med CMS tidligere rapporteret at udvikle mutationer i MSI-High coloncancerformer. Talrige mutationer i overensstemmelse med en MSI-High fænotype blev detekteret i hver cellelinje med afvigende DNA mismatch reparation ekspression ved immunhistokemi, men få mutationer hvis nogen blev påvist i de resterende cellelinjer (tabel 2, tabel S1). Sletning af en DNA-basepar var den mest almindelige mutation, der tegner sig for 82% (214/262) af de observerede i denne undersøgelse mutationer (sandsynlige biallele mutationer tælles som 2 mutationer). De fleste læserammeforskydningsmutationer koder for trunkerede proteiner med lavere molekylvægt med et muteret C-terminalen (tabel 3). Vejviser

Detekterbare MSI-afledte mutant proteiner udtrykkes af NMD-resistente udskrifter

for at detektere udtrykte mutant proteiner, vi købte antistoffer mod det konserverede N-terminale del af udvalgte proteiner. Vi oprindeligt studerede et udvalg af almindeligt muterede gener rapporteret til at være potentielle “målgener” [1]. Western blot eksperimenter på hele cellelysater og immunopræcipitater af genotypede cellelinier identificeret proteinbånd svarende til den forventede molekylvægt for normal BAX (figur 1), MSH3- og CASP5 proteiner (upublicerede data) i cellelinier med ikke-muterede alleler af disse gener . Der blev imidlertid ikke påvist mutante proteinbånd for nogen af ​​disse gener. I tilfælde af BAX genereret vi polyklonale kanin-antistoffer til et syntetisk peptid svarende til det muterede C-terminalen. Disse antistoffer viste specifik binding til syntetisk mutant peptid i Biacore, ELISA og Western blot-analyser, men ikke registrerer en mutant BAX protein band i helcellelysater eller immunopræcipitater af BAX muteret cellelinjer (upublicerede data). Mutationer i BAX, MSH3- og CASP5 alle indkode til NMD-følsom (NMD-S) mutant udskrifter; mutant BAX og MSH3- vides at være følsomme for nedbrydning [27]. NMD-følsomhed kunne forklare vores manglende evne til at afsløre eventuelle mutantproteiner følge af disse tre gener, selvom unormal proteinfoldning med tab af antistof-epitoper kan også være en faktor.

(A) Normal BAX protein (21 kDa , pil), men ingen mutant BAX protein (forudsagt 6,4 kDa) blev påvist i Western Blot analyser på helcellelysater for tyktarmskræft cellelinjer. Cellelinjer med BAX G8 CMS mutation status: 1. LoVo (-1, +1), 2. SW480 (WT), 3. HCA7 (-1, vægt), 4. LS174T (-1), 5. HCT116 (- 1, vægt), 6. HeLa (wt), 7. LIM1215 (-1). (B) Homozygote -1 basemutation i G8 cm i LS174T-cellelinien (øverst) sammenlignet med ikke-muterede cellelinie, SW1222 (bund) (omvendt DNA-sekventering). (C) Normal BAX protein (pil), men ingen mutant BAX protein påvist ved immunfældning: 1. HeLa (wt), 2. LS174T (-1). IgG let kæde på 25 kDa.

Vi søgte derfor at opdage mutant proteiner som følge af NMD-resistente (NMD-R) udskrifter. Tidligere offentliggjorte Western blot data viste potentielle mutant proteinbånd af CREBBP og EP300 gener, hver følger af en heterozygot (-1, vildtype) rammeskift mutation af en 5 mer Cms gentager i det sidste exon, detekteret i LoVo (CREBBP) og HCT116 (EP300) cellelinier henholdsvis [22]. Vi bekræftede tilstedeværelsen af ​​disse mutationer i LoVo og HCT116 cellelinjer ved PCR og DNA-sekventering. Disse CMS blev ikke muteret i nogen af ​​de andre MSI-høj eller MSS cellelinier. Bånd svarende til de forventede molekylvægte af den normale CREBBP og EP300 protein blev konsekvent detekteret i Western blot-analyser af ikke-muterede cellelinier. Vi har registreret unormale proteinbånd svarende til den forventede molekylvægt på mutant CREBBP og mutant EP300 i LoVo og HCT116 cellelinier henholdsvis i Western blots på helcellelysater (figur 2) og på immunpræcipitater (figur S1). Vores skamplet matchede de tidligere offentliggjorte data for EP300 [22]. De CREBBP oplysninger før matchede en region af ikke-specifikke bånd i vores blot, men proteinbånd af passende molekylvægt var også til stede i vores blots. De CREBBP bånd blev også påvist i forsøg, hvor man antistof blev brugt til en immunopræcipitation og et antistof til en anden CREBBP epitop blev anvendt til detektion.

blev opdaget Normale proteiner (hvid pil) og mutant proteiner (sort pil) i Western Blot analyser på helcellelysater til (A) CREBBP og (B) EP300. (A) CREBBP C5 CMS: 1. SW480 (wt), 2. LoVo (-1, wt), 3. HCT116 (wt), 4. LIM1215 (wt), 5. LS174T (wt). MW (kDa): vægt 265, mut 209. (B) EP300 A5 CMS: 1. LoVo (wt), 2. HCT116 (-1, wt), 3. HCA7 (wt), 4. LIM1215 (wt), 5 . LS174T (wt). MW (kDa): vægt 223, mut 187.

Validering af mutant proteiner

For at bekræfte identiteten af ​​de unormale protein bands og bevise, at disse repræsenterer ægte eksempler på den forventede mutantproteiner, vi indledningsvis udføres tandem-massespektrometri på immunopræcipitater af cellelinierne. Denne teknik bekræftede identiteten af ​​den normale CREBBP og EP300 proteinbånd (fig S1), derved valideret specificiteten af ​​antistofferne anvendte. De mutante proteiner blev ikke detekteret ved denne fremgangsmåde, muligvis på grund af co-immunoudfældning af mere rigelige proteiner af lignende molekylvægt såsom MYH9 (upublicerede data). Specificiteten af ​​de muterede protein bands blev i stedet bekræftet ved hjælp af små interfererende RNA (siRNA) til at udføre gen specifikke knockdowns af mutant CREBBP og EP300 proteiner. Nedsat ekspression af den mutante CREBBP protein i forhold til utransficerede og ikke-målrettede kontroller korrelerede med et signifikant fald i målrettet mRNA, bekræftet ved QRT-PCR (figur 3). Knockdown af den mutante EP300 proteinet blev ligeledes påvist i immunopræcipitater (figur 4). Disse resultater bekræfter, at de unormale proteinbånd påvist er muterede varianter af CREBBP og EP300 proteiner. Dette fund tyder på, at visse MSI-afledte mutant proteiner naturligt udtrykkes ved detekterbare niveauer.

Specificitet af mutant protein-båndet blev bekræftet ved gen-specifikke knockdown i transfektanter af siRNA målrettet CREBBP. (A) Detektion af mutant proteinbånd (sort pil) i hele cellelysater af LoVo cellelinie, men normalt protein kun (hvid pil) i ikke-muterede SW480-cellelinien. (B) Western blot af LoVo hele cellelysater fra siRNA SMARTpool transfektanter viser nedsat ekspression af normale (hvid pil) og mutant (sort pil) CREBBP proteinbånd i CREBBP målrettede lysater (bane 1). Beta-catenin ladningskontrol (grå pil) 92 kDa. (C) Relativ intensitet normal (blå) og mutant (rød) CREBBP proteinbånd i forhold til utransficerede celler (PBS). (D) Nedsat CREBBP mRNA-ekspression i CREBBP siRNA transfektanter (venstre vognbane) i forhold til utransficerede celler (højre bane).

Specificitet af mutant protein bandet bekræftet ved gen-specifikke knockdown i transfektanter af siRNA målrettet EP300. (A) QRT-PCR data til at vurdere siRNA’er rettet EP300 (bedste knockdown hjælp P300-1 og P300-3). (B-C) Nedsat mutant EP300 protein påvist i Western Blot analyser på immunopræcipitater af EP300 siRNA transfektanterne forhold til utransficerede kontrol (PBS).

Påvisning af yderligere potentielle mutant protein bands

i yderligere Western blot eksperimenter (Figur 5), mutante TTK proteinbånd blev påvist i flere muterede cellelinier ved lidt højere molekylvægt (101 kDa) end ikke-muterede TTK protein (97 kDa), i overensstemmelse med den forudsagte størrelse (tabel 3) . Forsøg på siRNA knockdown af mutant TTK blev hindret af vanskeligheder med at løse de muterede og normale protein bands. En AIM2 bånd blev detekteret ved ca. 46 kDa i Western blots på immunopræcipitater fra helcellelysater, konsekvent den påviste størrelse i tidligere undersøgelser under anvendelse dette antistof [28]. AIM2 protein blev påvist i flere ikke-muterede cellelinjer og også i homozygot AIM2 mutante LoVo celler. De mutante og vildtype AIM2 proteiner er af lignende forudsagte molekylvægte (39 kDa og 40 kDa). Fordi NMD-resistente transkripter har ofte et CMS i den sidste exon nær C-terminus, vil mutante proteiner ofte være af samme størrelse til normale proteiner. Dette gør validering af disse mutante proteinbånd ved teknikker, der anvendes til at bekræfte CREBBP og EP300 bands vanskeligere.

(A) Western blot-analyser på helcellelysater identificerede en potentiel mutant TTK proteinbånd (sort pil) i flere muterede cellelinjer og normal TTK protein (hvid pil) kun i ikke-muterede linjer: 1. LIM1863 (wT), 2. HCA7 (vægt), 3. LIM1899 (-1, vægt), 4. HCT116 (-1, vægt ), 5. LoVo (-1, wt), 6. LIM2537 (-1, wt), 7. LIM2551 (-1, wt). TTK MW (kDa): vægt 97, mut 101. (B) Western blot-analyser på immunopræcipitater af helcellelysater identificerede en AIM2 proteinbånd (sort pil) i alle cellelinjer, herunder den homozygote mutante LoVo cellelinie: 1. SW480 ( vægt), 2. LoVo (-1), 3. HCT116 (-1, wt). 4, LS174T (wt). AIM2 MW (kDa):. Wt 39,0, mut 40,4

Mutant proteinbånd blev ikke påvist for alle NMD-resistente udskrifter vurderes. I tilfælde af ACVR2A blev proteinbånd påvist ved de forventede molekylvægte for både normal og mutant protein, men på en ikke-specifik måde, at ikke korrelerer med mutationsdata. Flere proteinbånd blev påvist i blots for TCF7L2, et gen med talrige alternativt splejsede transkripter [29], men ingen mutante proteiner blev identificeret som korreleres med mutationsdata.

Genom-dækkende søgning efter NMD-resistente transkripter som en kilde, der kan målrettes proteiner

Efter at have konstateret, at NMD-resistente udskrifter kan give anledning til udtrykte MSI-afledte mutant proteiner, vi søgte at identificere yderligere CMS-indeholder gener, der kan generere udtrykte mutant proteiner i MSI-High tyktarmskræft der kan tjene som terapeutiske mål. Ved hjælp af en bioinformatisk strategi, vi udførte en genom-dækkende søgen efter CMS-holdige gener ud fra kriterier forudsagt at kode for NMD-irrelevante mutant udskrifter [24], som i sig selv NMD-resistente (tabel S2). Vi identificerede 1511 ikke-redundant mononukleotid CMS gentager ≥7 mer i længde (herunder hypotetiske gener) forventes at generere NMD-resistente mutant udskrifter. Dette skal sammenholdes med 17.654 mononukleotidbyggeblokken CMS (≥6 mer) identificeret (uanset NMD status) i en tidligere undersøgelse [17].

Gener blev udvalgt til CMS mutation analyse baseret på udvælgelseskriterier, der kan være vigtigt at nytte som en målrettes protein. Vi begrænset undersøgelsen til 316 mononukleotid CMS gentager ≥8 mer i længden, da der er en korrelation mellem mikrosatellit længde og sandsynligvis mutationsfrekvens. Væsentlige mutationsrater ( 40%) er blevet rapporteret for nogle 8 mer gentagelser [16]. Gener med korte forudsagte neo-C-terminale proteinsekvenser ( 10 aminosyrer) blev udelukket, da disse er usandsynligt at generere anvendelige T-celleepitoper for en række almindelige HLA-typer, som er nødvendig for at overvinde MHC-restriktion. Eksklusive hypotetiske gener (præfiks LOC eller KIAA), 179 cm-holdige gener opfyldt vores udvælgelseskriterier (Tabel S3). Evidens for proteinekspression i kolon kræft i shortlistes gener blev også søgt som et yderligere udvælgelseskriterium for at indikere sandsynligvis ekspression af de mutante proteiner. The Human Protein Atlas [30] indeholder data viser proteinekspression i tarmkræft senest immunhistokemi. Men disse oplysninger er ikke tilgængelige for mange gener, som følge af afhængighed af IHC af tilgængeligheden af ​​egnede antistoffer. Derfor blev genekspression profilering data også bruges til at identificere gener med de højeste mRNA ekspressionsniveauerne baseret på data fra to undersøgelser [31], [32] af MSI og MSS tyktarmskræft (figur S2).

udvalgte gener (tabel 4) blev screenet for Cms mutationer i et panel af 5 MSI og 1 MSS cellelinjer og en efterfølgende panel af 6 MSI cellelinjer blev testet, hvis den første skærm afsløret nogen CMS mutationer. Tre gener (SFRS12IP1, MED8 og ASXL1) blev muteret i 6/11 (55%) af MSI-High cellelinier og to gener (FBXL3 og RGS12) blev muteret i 5/11 (45%). Adskillige gener med mindre mutationsrater blev også identificeret (tabel S4).

I silico

epitop analyse for NMD-resistente udskrift afledt mutant proteiner

For at være nyttig som terapeutiske vaccine /immunterapi mål, mutantproteinerne identificerede behov for at generere CTL epitoper for fælles HLA-typer.

I silico

analyse ved hjælp af den offentligt tilgængelige software såsom SYFPEITHI tidligere er blevet identificeret nye CTL epitoper, der efterfølgende blev valideret i funktionelle assays [26]. At identificere, hvilke MSI-afledte mutante proteiner vil sandsynligvis være immunogene, vi vurderet mutantproteiner følger af NMD-resistente transkripter for potentielle HLA-A * 0201 epitoperne. HLA-A * 0201 er den mest almindelige HLA-type, til stede i omkring 50% af befolkningen [33]. SYFPEITHI Resultaterne er baseret på binding motiver fælles for kendte naturligt forekommende epitoper. Ifølge SYFPEITHI scoring retningslinjerne for, bør et naturligt udtryk epitop være blandt top 2% af alle peptid scores vurderet i 80% af tilfældene [26]. Vi vurderede mutant C-terminale ender som følge af fælles NMD-R mutationer (tabel S5) og top 2% af HLA-A * 0201 SYFPEITHI binding scores genereret fra de mutante proteiner blev bestemt (tabel 5). De top-ranking peptider havde SYFPEITHI bindende scoringer spænder fra 23 til 31. Disse scorer kan sammenlignes med de bindende score på 135 kendte HLA-A * 0201 CTL cancerepitoper [26], herunder de 4 offentliggjorte MSI-afledte epitoper, som har en median score på 24 og en middelværdi på 23,4 (tabel S6).

Baseret på tilgængelige rapporterede CMS mutationsrater for EPHB2, TTK og RGS12 (C8), vil en vaccine, herunder disse tre muterede proteiner omfatter mindst én sandsynlig HLA-a * 0201 epitop for 69% af patienterne ( 1- (1-41%) x (1-27%) x (1-28%)). Yderligere HLA-A * 0201-epitoper blev identificeret flere gener (TMEM97, ASXL1, SFRS12IP1, RGS12 (A9), RTKN2) med fælles mutationer i dette studie, hvilket indikerer, at også målrette disse gener kunne udvide HLA-A * 0201-dækning. Nogle sjældne mutationer (f.eks NTAN1, RAPH1) producerer også immunogene epitoper, der ikke ville give bred befolkningsmæssig dækning, men kan også være værd at målrette i udvalgte patienter.

Diskussion

mikrosatelitter ustabilitet giver anledning til forudsigelige læserammeforskydningsmutationer involverer CMS af mange gener. Mutantproteiner følger af disse mutationer er en logisk kilde til tumorspecifikke antigener, der kunne forklare både tilstedeværelsen af ​​forøget TIL’er og bedre prognose forbundet med en MSI-High fænotype. Dette koncept understøttes af en nylig konstateret en sammenhæng mellem immun infiltrat tæthed og antallet af Cms læserammeforskydningsmutationer påvist i et sæt af MSI-High coloncancerformer [34]. Vi har valideret mindst to eksempler (CREBBP og EP300) af naturligt udtrykte mutant proteiner i MSI-High Tyktarmskræft cellelinjer, både som følge af NMD-resistente udskrifter. Disse resultater bekræfter, at NMD-resistente udskrifter kan generere naturligt udtrykt MSI-afledte mutant proteiner [34], [35]. CMS gentager i CREBBP og EP300 er korte og sandsynligvis ikke vil blive muteret i en høj andel af MSI-High tumorer. Det er imidlertid sandsynligt, at nogle almindelige NMD-resistente mutationer såsom TTK også vil generere målrettes mod mutantproteiner i MSI-High cancere. Vores genom-dækkende strategi for at identificere immunogene NMD-resistente udskrifter har identificeret fem roman CMS mutationer (SFRS12IP1, MED8, ASXL1, FBXL3, RGS12) i mindst 45% af elleve MSI-High kolon testede cancer cellelinjer. Mutation analyse i et større serie af primære MSI-High tyktarmskræft vil gøre det muligt for mutation frekvenser af disse potentielle terapeutiske mål, der skal mere nøjagtigt.

In vitro

studier har identificeret CTL reaktioner på syntetisk mutante peptider skyldes fælles CMS-mutationer, der anvender mononukleære celler fra perifert blod fra patienter med MSI coloncancerformer [10], [11], [12], [13], [14], [36] og intriguingly, også hos raske individer med HNPCC [15]. Disse undersøgelser har vist, at tumorspecifikke mutantproteiner kan stimulere

in vitro

T-celle immunitet og støtter idéen om en vaccinationsstrategi. Den offentliggjorte HLA-A * 0201 CTL epitoper for TGFBR2 [10], [11], CASP5 [12], OGT [13] og U79260 (FTO) [14] alle skyldes NMD-følsomme mutant udskrifter. NMD-inhiberingseksperimenter har vist, at mutant TGFBR2 er en af ​​de mest opreguleres transkripter, med 10 gange forøget mRNA-ekspression i en undersøgelse [27], [37]. Den celle responser konflikt T med den forventede virkning af NMD på mutant protein-ekspression. En transfektion undersøgelse viste, at mutant TGFBR2 protein er påviselig i transfektanter af mutant-cDNA (NMD-resistent), men ikke mutant gDNA (NMD-sensitive) [35]. Vi har ikke afsløre mutant proteiner fra NMD-følsomme udskrifter (BAX, CASP5 og MSH3-). NMD er imidlertid en oversættelse-afhængig proces [24] og lavt niveau mutantprotein ekspression fra den indledende runde af oversættelse kan være tilstrækkelig til at stimulere immunresponser. CTL kan vise udsøgt følsomhed over for en bestemt peptid /HLA-ligand, med så få som tre mål peptid /MHC-komplekser er tilstrækkelig til CTL-specifik cellelyse

in vitro

[38]. Humorale reaktioner på mutant TGFBR2 protein er blevet identificeret ved ELISA, men kun i et mindretal (10%) af MSI-High patienter tyktarmskræft [39].

En fordel ved NMD-resistente udskrifter som en kilde til målrettes mutantproteiner er, at stabilt udtrykte tumorantigener kan være cross-præsenteret for immunsystemet ved dendritiske celler til at stimulere CTL og T hjælper celle responser [40]. Cross-præsentation er sandsynligvis vil resultere i overlegen anti-tumor immunitet og NMD-resistente udskrifter som en kilde til målsøgende mutant proteiner. En fusion-genet assay rapporteret en signifikant korrelation mellem ekspressionen af ​​transficerede MSI-afledte mutante proteiner og cross-præsentation af co-udtrykkes ovalbumin antigen [18]. For gener med ubetydelig påviseligt protein, blev nogle moderat til stærk CTL-responser påvises, men uden cross-præsentation [18]. En begrænsning af transfektionsassayet er, at mutante cDNA-konstruktioner blev anvendt, og derfor eksperimenterne ikke vurdere virkningen af ​​NMD upon mutantprotein ekspression. Vores fremgangsmåde overvinder dette ved direkte påvisning af mutant protein ekspression. En modificeret transfektionsassay kræver naturlig splejsning af C-terminalen kan også identificere biologisk relevante mål vaccination.

NMD-hæmning eksperimenter har identificeret nogle “NMD-escape” udskrifter, som delvist modstå nedbrydning som følge af NMD [27], . MBD4 forudsiges generere en NMD-sensitive transkript, men en svag unormal proteinbånd er blevet rapporteret i Western blot-analyser af MBD4 muteret cellelinier. Dette kan repræsentere mutant MBD4 proteinekspression grund NMD-escape [23]. NMD-escape udskrifter kan være en nyttig kilde til protein-targets, men disse er ikke forudsiges og videre arbejde er nødvendigt for at afgøre, hvilke NMD-escape udskrifter producere målsøgende mutant proteiner. Strategier, som interfererer med NMD uden at inhibere proteintranslation skulle forårsage en generaliseret opregulering i NMD-mutant-transkripter, demaskering en række tumorantigener. Denne tilgang kan supplere en vaccine rettet mod MSI-High tumorer ved at udvide rækken af ​​tilgængelige immun mål uden NMD-resistente udskrifter. NMD-inhibering med siRNA målretning af NMD regulatoriske gener SMG1 eller UPF2 har for nylig vist stand til at inducere beskyttende

in vivo

immunresponser på tumorceller transficeret med et NMD-sensitive målantigen [41].

Vores bekræftelse af mutant protein-ekspression af MSI-High tumorer kan have vigtige kliniske anvendelser. En vaccine målretning almindeligt udtrykte mutantproteiner er blevet foreslået som en lovende strategi til behandling af MSI-High tumorer [15], [18], [34], [42]. Med tilstrækkelige mål, kan vaccination være muligt, forudsat at mutant proteiner udtrykkes, er antigene epitoper genereret og antigen præsentation er funktionel. Yderligere arbejde er nødvendigt for at afgøre, hvilke mutant protein immunreaktioner kan give en overlevelse fordel for patienter med MSI-High tumorer. Mutant proteiner udskilt i serummet kunne tjene som nyttige biomarkører for tidlig påvisning af MSI-Høje tumorer, især i HNPCC berørte befolkning. Sådanne biomarkører vil være et nyttigt supplement til coloskopisk screening, da MSI-High kolorektal kræft har en tilbøjelighed til interval adenomer og tumorer udvikle sig i perioden mellem screening colonoscopies [43], [44]. Den fælles, forudsigelig og tumor-specifikke karakter MSI-afledte mutant proteiner gør dem ideelle kandidater som terapeutiske mål eller diagnostiske markører.

Materialer og metoder

cellelinjer og kultur

LIM kolorektal cancer cellelinjer blev etableret fra tumor biopsier ved Ludwig Institute for Cancer Research (LICR) Melbourne Branch som tidligere beskrevet: LIM1215 [45], LIM1899 [46], LIM1863 [47], LIM2463 [48] og (LIM2099, LIM2405, LIM2408, LIM2537, LIM2550 og LIM2551) [49]. De LIM cellelinjer blev etableret fra både sporadiske og familiære kolorektal kræft [49], og kan fås fra CellBank Australien (www.cellbankaustralia.com) eller fra LICR Melbourne Branch ved afslutningen af ​​en standard akademiske materialer overdragelsesaftale. SW1222 kolorektal cancer celler blev leveret af Ludwig Institute for Cancer Research, New York Branch, (New York, NY) og HCA7 kolorektal cancer celler blev opnået fra European Collection of Cell Cultures (Porton Down, UK).