PLoS ONE: Fraktioneret ioniserende stråling Fremmer Epithelial-Mesenchymale Transition i Human kræft i spiserøret celler gennem PTEN Mangel-medieret Akt Aktivering

Abstrakt

I nogle esophageal kræftpatienter, kan strålebehandling ikke forhindre fjernmetastaser hvilket resulterer i dårlig overlevelse. Den underliggende mekanisme metastaser hos disse patienter er ikke veletableret. I denne undersøgelse har vi vist, at ioniserende stråling kan inducere epithelial-mesenchymal overgang (EMT) ledsaget med øget cellemigration og invasion, gennem nedregulering af phosphatase og tensin homolog (PTEN), og aktivering af Akt /GSK-3β /sneglen signalering. Vi udviklede en radioresistente (RR) esophageal skællede cancer cellelinje, Kyse-150 /RR, ved fraktioneret ioniserende stråling (IR) behandling, og bekræftede sin radioresistance ved hjælp af en klonogen overlevelse assay. Vi fandt, at Kyse-150 /RR cellelinie viste typiske morfologiske og molekylære karakteristika EMT. I sammenligning med de parentale celler, viste Kyse-150 /RR celler en stigning i post-IR koloni overlevelse, migration, og invasiv. Desuden blev der observeret et fald i PTEN i Kyse-150 /RR celler. Vi postuleret, at overekspression af PTEN kan inducere mesenchymale-epitelial overgang i Kyse-150 /RR celler og genskabe IR-induceret stigning i celle migration. Mekanistisk, fraktioneret IR inhiberer ekspression af PTEN, hvilket fører til aktivering af Akt /GSK-3β-signalering og er forbundet med de forhøjede niveauer af Snail protein, en transskriptionsfaktor involveret i EMT. Tilsvarende behandling med LY294002, en phosphotidylinositol-3-kinase-inhibitor, efterlignede PTEN overekspression virkning i Kyse-150 /RR-celler, hvilket yderligere antyder en rolle for Akt /GSK-3β /Snail signalering i virkninger medieret gennem PTEN. Tilsammen udgør disse resultater antyder kraftigt, at fraktioneret IR-medieret EMT i Kyse-150 /RR celler er gennem PTEN-afhængige veje, fremhæver en direkte proinvasive effekt af strålebehandling på tumorceller

Henvisning:. Han E, Pan F, Li G, Li J (2015) Fraktioneret ioniserende stråling Fremmer Epithelial-Mesenchymale Transition i human kræft i spiserøret Cells gennem PTEN Mangel-Mediated Akt aktivering. PLoS ONE 10 (5): e0126149. doi: 10,1371 /journal.pone.0126149

Modtaget: 27 oktober 2014; Accepteret: 29 2015; Udgivet: May 22, 2015

Copyright: © 2015 Han et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. forskningen blev støttet af den almindelige finansforordning Grant fra Kina Postdoc Science Foundation (til JL, Grant No. 2013M542451) (https://jj.chinapostdoctor.org.cn/V1/Program1/Info_Show.aspx?InfoID=270124f8-9c55-4916-ab8d-1ee53c952329). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i spiserøret er en af ​​de mest udfordrende kræftformer at behandle med den ottende højeste dødelighed blandt alle kræftformer i hele verden. [1] det er den fjerde hyppigst diagnosticeret kræft og den fjerde hyppigste årsag til kræft dødsfald i Kina. [2] esophageal pladecellecarcinom (ESCC) er den vigtigste histopatologisk undertype af esophageal cancer i Kina. Strålebehandling er grundlaget for behandling af ESCC, men lokal fiasko er forblevet et stort problem, med vedvarende eller tilbagevendende sygdom, der rapporteres i omkring 40-60% af patienterne. [3] En undergruppe af esophageal kræftpatienter ikke reagerer på strålebehandling på grund til fremkomsten af ​​radioresistente (RR) tumorceller. Den kliniske forløb hos disse patienter er præget af hyppige tilbagefald og fjerne metastatiske læsioner. Undersøge de underliggende mekanismer, der er involveret i udviklingen af ​​RR tumorceller er af afgørende betydning for at studere effekten af ​​strålebehandling på ESCC.

Epithelial-mesenkymale overgang (EMT) er en proces, hvorved differentierede epitelceller undergår bemærkelsesværdige morfologiske ændringer fra en epithelial brosten fænotype til en aflang fibroblastisk fænotype [3], som er karakteriseret ved nedsat ekspression af epiteliale markører, såsom E-cadherin og forøget ekspression af mesenchymale markører, såsom vimentin og N-cadherin. [4] i øjeblikket EMT har været impliceret i to af de vigtigste processer, der er ansvarlige for kræft dødelighed dvs invasion og progression til fjern metastatisk sygdom, og erhvervelse af terapeutisk modstand. [5] Nylige undersøgelser tyder på, at EMT spiller en afgørende rolle i udviklingen af ​​kræft radioresistance. Stråling-medieret EMT er blevet bredt undersøgt i forskellige typer af tumorer, både

in vitro

in vivo

, såsom kolorektal, hals-, bryst- og lungekræft. [6-10] Men , forbliver den nøjagtige rolle EMT og de underliggende mekanismer involveret i udviklingen af ​​radioresistance i kræft i spiserøret at blive belyst.

Phosphatase og tensin homolog (PTEN) er en vigtig tumor-suppressor gen, som er en negativ regulator af phosphotidylinositol-3-kinase (PI3K) -Akt pathway, hvorved der deltager i reguleringen af ​​cellecyklussen, proliferation, apoptose, celleadhæsion og EMT under embryonisk udvikling og udviklingen af ​​kræft. [11, 12]. Det er blevet rapporteret, at nedsat ekspression af PTEN, post-IR, inducerer radioresistance gennem fremme af celleproliferation og inhibering af celle apoptose i ikke-småcellet lungekræft og nasopharyngeal carcinoma. [13, 14] Direkte genoprette PTEN funktion har tidligere været rapporteret at være en værdifuld tilgang til at opnå strålingssensibilisering

in vitro

. [15] Men om PTEN deltager i stråling-udløst EMT og tumormetastaser i ESCCs er endnu ikke klart.

Derfor, i den foreliggende undersøgelse hypotese vi rolle PTEN i udviklingen af ​​strålingsinduceret EMT i ESCC. Vi undersøgte, om (i) bestråling kan øge invasivitet af ESCCs ved induktion EMT, (ii) PTEN manglen er involveret i strålingsinduceret EMT, og (iii) strålingsinduceret EMT var gennem aktivering af Akt /GSK-3β /sneglen signalering .

Materialer og metoder

Materialer

Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-medium blev opnået fra Gibco (Life Technologies Corporation, IN), føtalt bovint serum (FBS) blev købt fra HyClone (Thermo, MA). Antistoffer til PTEN, E-cadherin, N-cadherin, Slug, snail, vimentin, Akt, phosphoryleret Akt (p-Akt), GSK-3β, phosphorylatedGSK-3β (p-GSK-3β) og peberrodsperoxidase (HRP) -konjugeret sekundært antistof blev indkøbt fra CST (Cell Signaling Technology, MA). PI3K-inhibitor, LY294002, blev købt fra Sigma (Sigma-Aldrich, MO). GoScript Reverse Transcription System og GoTaq qPCR Master Mix Kit var fra Promega (Promega, WI).

Cell linje og cellekultur

Menneskelig ESCC cellelinie, Kyse-150 (JCRB1095, forudsat af Dr. . Fangfang Bu) [16, 17], blev dyrket i RPMI 1640 medium med 10% FBS og 100 enheder penicillin-streptomycin og inkuberet ved 37 ° C med 5% CO

2 i en fugtig inkubator. Før kultur blev Kyse-150 cellelinje bekræftet af kort tandem repeat profilering (Beijing Microread Gene Technology Co Kina).

Fraktioneret ioniserende stråling (FIR) behandling [18]

Kyse -150 celler blev dyrket i 25 cm

2 kolber. På at opnå ca. 75% konfluens blev cellerne bestrålet med 1 Gy røntgen ved stuetemperatur under anvendelse af Hitachi MBR-1520-R strålerøret (Hitachi Medical Corporation, Tokyo, Japan) ved en dosering på 4.73Gy /min, og cellerne blev returneret til inkubatoren umiddelbart efter bestråling. Celler blev subdyrket i nye kolber ved ca. 90% konfluens. Denne fremgangsmåde blev gentaget for at opnå udsættelse for stråling ved en dosis på 1 Gy, 3 gange; 2 Gy, 3 gange; og 4 Gy, 7 gange, og hver eksponering var med et interval på tre dage; med den totale dosis er 37 Gy over en 2-måneders periode. Adskillige kloner blev isoleret fra RR-celler og individuelt dyrket. De parentale celler blev behandlet ved samme fremgangsmåde, bortset fra at de ikke blev bestrålet. Klonogene assays blev anvendt til at bestemme modstanden niveau og en RR-klon ved navn Kyse-150 /RR blev udvalgt til vores eksperiment.

Klonogen overlevelse assay

Parental og RR-celler blev udpladet på seks brønde plader ved 500, 1000, 2000, 3000, 4000 celler pr. Fireogtyve timer senere blev cellerne behandlet med en individuel dosis af stråling (0, 2, 4, 6, eller 8Gy henholdsvis). Celler blev returneret til inkubatoren umiddelbart efter bestråling for at tillade kolonier til at danne. Efter 14 dage blev kolonierne fikseret med methanol og farvet med krystalviolet. Kolonier, der indeholder 50 celler blev talt under mikroskopet. Overlevende fraktion, (SF) blev beregnet som antallet af kolonier /(Celler Udsåede x Plating Effektivitet). En overlevelse kurve blev udledt ved hjælp af GraphPad Prism 5.0. Hvert eksperiment blev gentaget mindst tre gange.

Plasmidkonstruktion og transfektion

Rekombinant plasmid pcDNA3.0-PTEN blev konstrueret ved insertion af human PTEN cDNA i pcDNA3.0-vektoren (Invitrogen, CA ) med primere som følger: fremad, 5 ‘cggggtaccccggccaccATGACAGCCATCATCAAAGAGATC 3’ (understreget Kpn1 + Kozak) og omvendt, 5 ‘ccgctcgagcggTCAGACTTTTGTAATTTGTGTATGC 3’ (understreget Xho1). Kyse-150 /RR celler blev transficeret med pcDNA3.0-PTEN eller pcDNA3.0 vektor kontrol. Alle transfektioner blev udført under anvendelse ScreenFectA transfektionsreagens (InCellA, Egggenstein-Leopoldshafen, Tyskland) ifølge producentens instruktioner. Transficerede celler blev analyseret ved Western blotting eller kvantitativ revers transkription-polymerasekædereaktion (RT-qPCR).

RNA-interferens assay

Kyse-150-celler, som ikke blev bestrålet, blev transficeret med 100 nmol af små interfererende RNA (siRNA) -PTEN eller nontargeting scrambled-siRNA hjælp ScreenFectA transfektion reagens i henhold til producentens anvisninger. siRNA-PTEN blev syntetiseret under anvendelse af følgende sekvens: 5′-GGGCCAGGTCATAAATAAT-3 ‘; mens den Scrambled-siRNA sekvens var som følger: 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ‘

Western blot-analyse

Celler blev lyseret i natriumdodecylsulfat (SDS) lyseringsbuffer, og blev homogeniseret for. protein ekstraktion. Lige store mængder protein fra hvert lysat blev separeret ved SDS-PAGE (10% acrylamid) og blottet til PVDF Western blotting-membraner (Millipore Corporation, MA). Dette blev efterfulgt af inkubation med primære antistoffer mod PTEN, E-cadherin, N-cadherin, Slug, snail, vimentin, Akt, p-Akt og glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH, som ladningskontrol), og HRP-konjugeret sekundært antistof . Blottet signaler blev derefter visualiseret med forøget kemiluminescens (Thermo, MA).

RNA-ekstraktion og RT-qPCR assay

Totalt RNA fra dyrkede celler, efter forskellige behandlinger, blev ekstraheret med TRIZOL-reagens ( Life Technologies Corporation, IN) i overensstemmelse med producentens instruktioner. Et mikrogram af total RNA blev anvendt til revers transkription. En mikroliter af den samlede revers transkription Produktet blev realtid-qPCR blanding (20 pi) indeholdende 10 pi 2 × GoTaq qPCR Master Mix og primere (sense og anti-sense; 1 pi) for at bestemme mRNA-ekspression af human PTEN, E -cadherin, N-cadherin, sneglen, Slug, vimentin og β-actin. Genekspressionen af ​​mRNA fra hver prøve blev beregnet ved normalisering med β-actin. Alle primere blev udformet under anvendelse IDT PrimerQuest Input software (tabel 1). Prøver blev amplificeret med en precycling hold ved 95 ° C i 30 s, 40 cykler annealing og forlængelse ved 60 ° C i 34 s. Hver måling blev udført tre gange med ApplidBiosystems 7500 StepOne Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Inc., CA) og analyseret ved hjælp af Applied Biosystem 7500 software v2.0.1.

Migration og invasion assay

assayene migration blev udført i en 24-brønds transwell kammer indeholdende polycarbonatfiltre med 8 um porer (Corning, Acton, MA). I alt 500 pi medium indeholdende 20% FBS som den kemotaktiske faktor blev sat til det nedre rum og derefter 1 x 10

5 celler af hver gruppe i serumfrit DMEM blev tilsat til det øvre kammer af kammeret og inkuberet i 24 timer. Den øvre overflade af kammeret blev derefter skrabet for at fjerne ikke-migrerende celler. Migrerede celler blev farvet med 0,1% krystalviolet og fotograferet under et lysmikroskop (× 100). Kamrene blev vasket med 100 pi 10% eddikesyre, og OD af den farvede celle eluenten blev målt ved 560 nm. Hver gruppe blev fremstillet i tre dobbelte brønde. For invasion assay, et trans-brønd-system coatet med 2 mg /ml basalmembran, matrigel, (Corning, Acton, MA) blev anvendt. Resten af ​​proceduren var magen til migration assay som beskrevet ovenfor

sårheling assay

Celler blev podet i 12-brønds plader og dyrket indtil 40% konfluens.; den sammenflydende cellemonolag blev ridset med en 20 pi pipettespids for at frembringe en lodret linje hen over midten af ​​brøndene. Udbredelsen af ​​sårlukning blev observeret efter 0 og 24 timer interval og blev fotograferet under anvendelse af et lysmikroskop.

Statistisk analyse

Forskelle blev vurderet ved Students t-test til sammenligning af to grupper. Data blev udtrykt som middelværdi ± standardafvigelse (SD). En

P

værdi 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Effekt af bestråling på cellulær morfologi og EMT markører

Efter to måneder. af FIR med en samlet dosis på 37 Gy blev subkloner isoleret og betegnet Kyse-150 /RR-celler, og deres RR karakter blev påvist ved klonogenisk celleoverlevelse assay. Fig 1A viser, at Kyse-150 /RR-celler overlevede i en længere periode sammenlignet med parentale celler.

(A) Stråling celle overlevelseskurver og klonogene tal af kontrollen Kyse-150 celler uden bestråling og radioresistance subklon Kyse-150 /RR celler. (B) morfologi Kyse-150 og Kyse-150 /RR celler blev undersøgt med fase-kontrast mikroskopi. (C) Angivelse af EMT markører (E-cadherin og vimentin) og transskription repressorer af E-cadherin (Sneglen og Slug) blev påvist ved QRT-PCR, data vist som gennemsnit ± SD, *

P

0,05. Dataene repræsenterer midler med standardafvigelse fra tre uafhængige forsøg. (D) Repræsentative western blots af E-cadherin, vimentin, Sneglen og Slug var viste.

De RR celler demonstreret morfologiske ændringer. De kontrol Kyse-150 celler (Kyse-150 Ctrl) havde en epitel-lignende morfologi, med stram celle-celle sammen og brosten-lignende udseende (figur 1B venstre). De Kyse-150 /RR-celler udviklet en spindel-lignende morfologi, med øget dannelse af pseudopodia og tab af celle-til-celle-kontakt, som er karakteristisk for mesenchymale fænotype (Fig 1B højre). Forstærkningen af ​​disse morfologiske træk i RR underlinjer kunne antyde over for sine transformerede egenskaber, såsom migration og invasion. [19]

For at bekræfte, om denne fænotype ændring blev tilskrevet EMT, mRNA og protein udtryk for EMT- associerede gener blev detekteret ved QRT-PCR og Western blots. Kyse-150 /RR-celler viste nedregulering af epitelial markør E-cadherin, og opregulering af mesenchymale markør vimentin, sammenlignet med Kyse-150 Ctrl-celler (Fig 1C og 1D). Sneglen og Slug, negative regulatorer af E-cadherin, var afgørende for EMT. [19] I Kyse-150 /RR celler, blev både Sneglen og Slug steget markant på proteinniveauet (Fig 1D), men blev ikke ændret på mRNA niveau (fig 1C). Disse resultater viser, at bestråling er tilstrækkelig til at inducere EMT i ESCC cellelinje.

Virkninger af bestråling på cellemigrering og invasion

Tumorceller der undergår EMT har øget cellemigration og invasion evne. For at undersøge om Kyse-150 /RR celler vise sådanne træk, vi evalueret migration og invasion evne Kyse-150 Ctrl og Kyse-150 /RR celler

in vitro

. Sårheling assay viste, at Kyse-150 /RR celler havde signifikant hurtigere lukning af sår område sammenlignet med Kyse-150 Ctrl-celler (Fig 2A). Cellemigration og invasion af Kyse-150 /RR-celler viste sig at blive forøget med 50% og 33%, sammenlignet med Kyse-150 Ctrl-celler (fig 2C). Repræsentative billeder af migration og invasion evne fra hver af cellelinjen er vist i figur 2B.

(A) Kyse-150-celler blev udsat for en sårhelende assay med eller uden stråling ved 100 ganges forstørrelse. Repræsentative billeder blev fotograferet til højre og 24 timer efter bunden. (B) Repræsentative billeder af migration assay og invasion assay af Kyse-150 celler med eller uden stråling blev fotograferet efter 24 timer med krystalviolet pletten. (C) Resumé grafer for migration og invasion (data vist som middelværdi ± SD, *

P

0,05).

PTEN mangel er nødvendig for bestråling-induceret EMT

det er rapporteret, at ekspression af PTEN er nedsat hos RR tumorceller. [13, 14] Vi undersøgte mRNA og protein ekspression af PTEN i Kyse-150 Ctrl og Kyse-150 /RR-celler. Vores resultater viste, at strålingen faldt betydeligt ekspressionen af ​​PTEN både mRNA og protein niveauer (Fig 3A). For at bestemme virkningerne af PTEN mangel på celle migration og EMT, siRNA målretning af PTEN blev anvendt (Fig 3B venstre). Migration og invasion assay viste, at knockdown af PTEN resulterede i en klar vandrende fænotype i Kyse-150 celler sammenlignet med køretøjets transficerede celler (fig 3D). Western blots viste, at Kyse-150-siPTEN celler udviste tab af celleadhæsion markør E-cadherin og elevation i mesenchymal differentieringsmarkør vimentin (Fig 3C venstre).

(A) Stråling signifikant nedsætter ekspressionen af ​​PTEN i Kese-150 /RR celler uanset i mRNA-niveau (data præsenteres som gennemsnit ± SD, **

P

0,01) og protein niveau (repræsentative western blots). (B) Den transficerede effektivitet siPTEN i Kyse-150 (til venstre) og pcDNA-PTEN i Kyse-150 /RR celler (højre) (data præsenteret som gennemsnit ± SD, **

P

0,01) . (C) repræsentant western blot analyse viste ekspression af PTEN, E-cadherin og vimentin i Kyse-150-celler transficeret med siPTEN eller køretøj, eller Kyse-150 /RR-celler transficeret med pcDNA-PTEN eller pcDNA3.0. De viste data repræsenterer tre forskellige eksperimenter. (D) Repræsentative billeder af migration og invasion assay af Kyse-150 celler transficeret med siPTEN eller køretøj efter 48 h (til venstre); Resumé grafer er for migration og invasion (højre, data vist som gennemsnit ± SD, *

P

0,05). (E) Repræsentative billeder af migration assay og invasion assay af Kyse-150 /RR celler transficeret med pcDNA-PTEN eller pcDNA3.0 blev fotograferet efter 24 timer med krystalviolet farvning (til venstre); Resumé grafer for migration og invasion (højre, data vist som gennemsnit ± SD, *

P

0,05). siPTEN er en forkortelse for siRNA-PTEN.

Vi brugte derefter en vektor, der koder for PTEN (Fig 3B til højre), for at bekræfte rolle PTEN i stråling-induceret EMT og tumormetastaser. Vi fandt, at overekspression af PTEN forårsaget Kyse-150 /RR-celler til at genoprette ekspressionen af ​​E-cadherin og formindske ekspressionen af ​​vimentin (Fig 3C højre). Desuden blev de øgede migration og invasion evner Kyse-150 /RR celler betydeligt hæmmet af overekspression af PTEN (Fig 3E). Dataene viser, at PTEN mangel er nødvendig for stråling-induceret EMT og vandrende /invasive fænotype.

PTEN faldt Snail udtryk gennem aktivering af PI3K /Akt /GSK-3β signalering

Sneglen og Slug er transkriptionelle repressorer, som spiller vigtige roller i tumormetastase ved at nedregulere E-cadherin. [19] som tidligere nævnt, blev sneglen og Slug opreguleret i Kyse-150 /RR cellerne på proteinniveauet, men ikke på mRNA-niveauet. For at bestemme om den forhøjede ekspression af Sneglen og Slug skyldtes PTEN mangel ved bestråling, ændrede vi PTEN ekspression ved transfektion med siRNA mod PTEN eller PTEN ekspressionsvektor, og derefter Western-blots blev udført for at bestemme ekspressionen af ​​Sneglen og Slug. Som vist i figur 4A, Snail udtryk steget betydeligt i Kyse-150 Ctrl-siPTEN celler sammenlignet med Kyse-150 Ctrl-siCtrl celle, mens det faldt i Kyse-150 /RR-pcDNA-PTEN celler sammenlignet med Kyse-150 /RR-pcDNA-celler. I modsætning hertil blev der udtryk for Slug ikke ændret sig væsentligt på PTEN udtryk. Desuden viste QRT-PCR ingen signifikant ændring i sneglen mRNA-niveauer (fig 4B). Disse resultater indikerer, at opregulering af sneglen ved bestråling skyldes nedgangen i PTEN niveauer.

(A) Ekspression af Sneglen og Slug detekteret ved western blot-analyse i Kyse-150-celler transficeret med siPTEN eller køretøj, eller Kyse-150 /RR-celler transficeret med pcDNA-PTEN eller pcDNA3.0. (B) Ekspression af Snail blev påvist ved QRT-PCR, data vist som middelværdi ± SD. (C) repræsentant western blot analyse viste ekspression af Akt, p-Akt, GSK-3β og p-GSK-3β. De viste data repræsenterer tre forskellige eksperimenter. siPTEN er en forkortelse for siRNA-PTEN. (D) repræsentant western blot analyse viste ekspression af Akt, p-Akt, GSK-3β, p-GSK-3β, Sneglen og E-cadherin i Kyse-150 /RR-celler med eller uden phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) inhibitor, LY294002 (40 uM).

Aktivering af PI3K /Akt /GSK-3β vej fremstår som et centralt element i EMT, med GSK-3β regulerer sneglen udtryk gennem posttranslationel modifikation. [20, 21] Vi hypotesen om PTEN regulerer Snail udtryk gennem PI3K /Akt /GSK-3β vej hos ESCC celler. Som vist i fig 4C, phosphorylering af Akt og GSK-3β blev opreguleret i Kyse-150 /RR-celler, men ikke i Kyse-150 Ctrl celler. Og knockout af PTEN faktisk lettet phosphorylering af Akt i Kyse-150 Ctrl celler, ledsaget af en stigning i phosphorylering af GSK-3β (figur 4C, midten). I modsætning hertil overekspression af PTEN inhiberede Akt og GSK-3β phosphorylering i Kyse-150 /RR-celler (Fig 4C, højre). For yderligere at dokumentere PTEN-afhængig inhibering af PI3K /Akt /GSK-3β-signalering, PI3K-inhibitor, LY294002, blev anvendt til at efterligne virkningen af ​​PTEN overekspression i Kyse-150 /RR-celler. LY294002 (40 uM) inhiberede Akt og GSK-3β phosphorylering i Kyse-150 /RR celler, og ekspressionen af ​​sneglen blev nedreguleret og af E-cadherin-protein blev opreguleret (Fig 4D). Disse resultater tyder på, at PTEN mangel aktiverer Akt /GSK-3β /Snail vej ved bestråling.

Diskussion

Strålebehandling er en effektiv behandling for kræft i spiserøret, selv på et fremskredent stadium. gentagelse og metastase grund udvikling af radioresistance blandt tumorceller er dog fortsat en stor udfordring. Tidligere undersøgelser har vist, at RR fænotype var korreleret med flere faktorer, herunder ændringer i cellecykluskontrolpunkter, bremset vækst og nedsat apoptose. [22, 23] Epithelial mesenkymal overgang menes også at være reguleret af udsættelse for stråling. Akkumulerede beviser indikerer, at ioniserende stråling er en af ​​de induktorer af EMT, som har vist sig at forekomme på tidspunktet for indledning af metastase, hvilket fører til udviklingen af ​​kræft, og er forbundet med udviklingen af ​​resistens over for strålebehandling i oral, bryst- og lungecancere . [6, 7, 24]

for at undersøge den kliniske radioresistance, regimer af FIR er blevet brugt

in vitro

at bestemme molekylære mekanismer, der ligger radioresistance. I denne undersøgelse har vi udviklet Kyse-150 /RR celler afledt fra kloner, som havde overlevet efter FIR behandling, [18], der på passende efterligner strålebehandling resistens i ESCC. Kyse-150 celle er et udbredt esophageal cancer cellelinje til undersøgelse af stråling resistens i esophageal carcinoma. [18, 25-27] Kyse-150 cellelinjen blev udviklet af Dr. Yutaka Shimada i 1991 fra dårligt differentieret ESCC resekteret fra den øvre spiserøret af en 49-årig japansk kvinde modtager strålebehandling. [16] Derfor er denne cellelinie kan let ændres i en RR cellelinie. Vi fandt, at fænotypen af ​​Kyse-150 /RR celler skiftede fra en epitelial morfologi til en mesenchymal morfologi efter bestråling. Samtidig gennemførte vi migration og invasion assay og fandt, at migration og invasion evne Kyse-150 /RR celler blev forøget sammenlignet med de parentale celler, tyder på, at EMT er involveret i udvikling af radioresistance og metastase i ESCC.

Et vigtigt skridt i EMT er nedregulering af E-cadherin. E-cadherin reguleres enten ved transkriptionsfaktorer, såsom Snail-relateret zink-finger transkriptionelle repressorer (Sneglen og Slug), SIP-1 /ZEB-2 og grundlæggende helix-loop-helix transcription faktor, Twist, eller ved ubiquitylering-induceret endocytose. I vores undersøgelse fandt vi FIR forøget ekspression af både Sneglen og Slug på proteinniveau og ikke ændre deres mRNA-ekspression. Ektopisk overekspression af Snail fører også til køb af øget resistens over for apoptose og kræft stamceller celle-lignende egenskaber i forskellige epitelceller. [28] Aktiveringen af ​​Sneglen og Slug kan være en af ​​mekanismer involveret i udviklingen af ​​radioresistance i ESCC efter strålebehandling .

Aktivering af proteinkinase B (AKT) pathway spiller en central rolle i de tre store radioresistance mekanismer, som er iboende radioresistance; tumor-celleproliferation og hypoxi. PTEN, som en inhibitor af Akt, er rapporteret at associere med radiosensitivitet. Det er blevet rapporteret, at ekspressionen af ​​PTEN blev reduceret i RR celler af gastrisk [15] og nasopharyngeal [14] carcinom, i mellemtiden, andre finder PTEN at være afgørende for dæmpning af invasion og EMT. [11, 29] Vi fandt udtryk af PTEN skal nedreguleres efter FIR, og overekspression af PTEN restaureret fænotypen af ​​Kyse /150 /RR celler fra mesenchymale morfologi til epithelmorfologi, ledsaget af nedsat migration og invasion.

for yderligere at undersøge den rolle, PTEN i stråling-udløst EMT, Akt /GSK-3β /sneglen pathway blev undersøgt, som tidligere er blevet impliceret i udviklingen af ​​strålingsinduceret lungekræft. [10, 30] Vores hypotese en rolle for PTEN, der fører til den forøgede E -cadherin ekspression via Akt /GSK-3β /sneglen pathway. Aktiv GSK-3β kan phosphorylere sneglen at lette dens nedbrydning, [20, 21] omvendt inaktivering af GSK-3β kan stabilisere sneglen. [30] Vore data viser, at overekspression af PTEN kan dæmpe stråling-induceret ekspression af Snail via dephosphorylering af Akt i Kyse-150 /RR celler, som accelererede den nedregulering af p-GSK-3β og fremmes Snail nedbrydning. Snegl, som en af ​​transskription repressorer af E-cadherin, ved at blive nedreguleret forårsaget opregulering af E-cadherin ekspression. For yderligere at bevise inddragelse af PI3K /Akt /GSK-3β signalering i et PTEN afhængig måde, PI3K-inhibitor, LY294002, blev anvendt til at efterligne virkningen af ​​PTEN overekspression i Kyse-150 /RR-celler. LY294002 inhiberede Akt og GSK-3β phosphorylering i Kyse-150 /RR celler, og ekspressionen af ​​sneglen blev nedreguleret og E-cadherin-protein blev opreguleret. Betragtet sammen, data tyder på, at nedregulering af PTEN er forbundet med inaktivering af GSK-3β, og PTEN-afhængige PI3K /Akt /GSK-3β signalering er nødvendig for at opregulere Snail for stråling-induceret EMT at udvikle sig i ESCCs.

vimentin, en vigtig cytoskelet bestanddel af mesenchymale celler, anvendes ofte som en markør for EMT under metastatisk progression. Det er blevet rapporteret, at blokering af PI3K /Akt signalering svækket vimentin ekspression i orale carcinomceller. [31] I vores undersøgelse vimentin var opreguleret i Kyse-150 /RR-celler (Fig 1D) og overekspression af PTEN inaktiveret PI3K /Akt signalering fører til nedregulering af vimentin ekspression i disse celler (fig 1C). Dette antyder, at PTEN mangel er påkrævet for strålingsinduceret EMT. Det er bemærkelsesværdigt, at Slug, en anden E-cadherin transkription repressor, opreguleres i stråling (figur 1D); blev dog Slug niveauer ikke fundet at være påvirket af PTEN udtryk (figur 4A). Dette resultat indikerer, at strålingsinduceret EMT er en kompleks proces, og andre veje kan også være involveret.

Vores undersøgelse har belyst detaljerne i EMT vej hos stråling udløst ESCC (figur 5). Denne undersøgelse understreger betydningen af ​​PTEN som et potentielt terapeutisk mål. Den nedregulering af PTEN og opregulering af PI3K pathway udløst af stråling fremkalder de kaskader fører til EMT. Alle disse effekter tilsammen bidrager til tumor metastase og tilbagefald efter strålebehandling. foreslår derfor, vi, at PTEN mangel efter strålebehandling for kræft i spiserøret spiller en vigtig rolle i udviklingen af ​​RR tumormetastase. Således kan overekspression af PTEN vise sig at være en nyttig strategi for at hindre cancercelleinvasion og metastase, der kan udvikle efter strålebehandling i ESCC.

PTEN virker som en opstrøms regulator af PI3K /Akt /GSK-3β-signalering netværk til at fremkalde de kaskader af EMT. Slug regulerer E-cadherinekspression i en PTEN uafhængig måde.