PLoS ONE: glycogensyntasekinase-3 Hæmning sensitizes bugspytkirtelkræftceller til Trail-induceret apoptose

abstrakt

Tumornekrosefaktor-relateret apoptoseinducerende ligand (TRAIL) inducerer apoptose i en række cancercellelinier med ringe eller ingen virkning på normale celler. Imidlertid er dens virkning begrænset, da nogle kræftformer, herunder kræft i bugspytkirtlen show de novo resistens over Trail induceret apoptose. I denne undersøgelse rapporterer vi, at GSK-3-inhibering ved hjælp af farmakologiske middel AR-18, forstærket TRAIL følsomhed i en række bugspytkirtlen og prostatakræft-cellelinier. Denne sensibilisering blev fundet at være caspase-afhængig, og begge farmakologisk og genetisk knock-down af GSK-3 isoformer resulterede i apoptotiske funktioner, som vist ved spaltning af PARP og caspase-3. Forhøjede niveauer af reaktive oxygen mellemprodukter og forstyrrelse af mitokondrie membranpotentiale punkt til et mitokondrie forstærkning loop for TRAIL-induceret apoptose efter GSK-3-hæmning. I overensstemmelse hermed overekspression af anti-apoptotiske mitokondriske mål som Bd-XL, Mcl-1, og Bcl-2 reddet PANC-1 og PPC-1-celler fra TRAIL sensibilisering. Imidlertid overekspression af caspase-8 inhibitor CrmA inhiberede også den allergifremkaldende effekt ved GSK-3-inhibitor, hvilket antyder en yderligere rolle for GSK-3 som inhiberer døden receptorsignalering. Akut behandling af mus med PANC-1-xenografter med en kombination af AR-18 og TRAIL resulterede også i en signifikant stigning i apoptose som målt ved caspase-3-spaltning. Sensibilisering til TRAIL skete trods en stigning i β-catenin grundet GSK-3-hæmning, hvilket tyder på, at tilgangen kan være effektiv, selv i kræft med dysreguleret β-catenin. Disse resultater antyder, at GSK-3-inhibitorer kan kombineres effektivt med TRAIL til behandling af pancreascancer

Henvisning:. Mamaghani S, Simpson CD, Cao PM, Cheung M, Chow S, Bandarchi B, et al. (2012) glycogensyntasekinase-3 Hæmning sensitizes bugspytkirtelkræftceller til Trail-induceret apoptose. PLoS ONE 7 (7): e41102. doi: 10,1371 /journal.pone.0041102

Redaktør: Shawn B. Bratton, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, USA

Modtaget: December 2, 2011; Accepteret: 21 Juni 2012; Publiceret: 19 jul 2012

Copyright: © 2012 Mamaghani et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Funding var leveres af Campbell Family Institute for Cancer Research. Den bidragyder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Rekombinant human Apo2L /TRAIL var en gave fra Genentech, South San Francisco, CA. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle de PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Den ydre apoptose pathway starter med binding af død receptor-ligander såsom Fas-ligand, tumor nekrose faktor-α (TNF-α), og tumornekrosefaktor-relateret apoptoseinducerende ligand (TRAIL) til dødsreceptorer, aktivering af en række signaler, der kan føre til to separate, men indbyrdes forbundne, former for apoptose induktion. I nogle tilfælde, aktivering af dødsreceptor-4 (DR-4) og død receptor-5 (DR-5) fører til rekruttering af adapter proteiner til dannelse af død-fremkaldende signaler kompleks (DISC), og efterfølgende aktivering af initiatoren caspase-8 eller -10 er tilstrækkelig til at aktivere effektor caspase-3, -6 og -7, og apoptose resultater [1]. Men bindingen af ​​TRAIL til DR-4 eller DR-5 og aktivering af caspase-8 eller -10 er ofte utilstrækkelig til at inducere apoptose, og kræver frigivelse af mitokondrielle mediatorer, såsom cytochrom C til amplifikation døden inducerende signal [2]. Denne krydstale mellem ydre og indre apoptoseveje kræver caspase-8-medieret spaltning af Bcl-2 familiemedlem Bud [2], [3]. Trunkeret Bud (tBid) virker som en blokerende mekanisme til at inhibere virkningen af ​​anti-apoptotiske Bcl-2-proteiner, såsom Bcl-2, Mcl-1, og Bcl-XL, hvilket fører til mitokondrier-induceret celledød [3].

TRAIL kan også binde to sæt af ikke-funktionelle lokkemad receptorer, i hvilke tilfælde er apoptoseinduktion blokerede [1]. Balancen mellem døden overtalelse receptorer og lokkefugle receptorer er en vigtig faktor for apoptose induktion i målcellerne [4]. I modsætning til TNF-α og Fas, TRAIL synes at udvise større specificitet mod apoptose induktion i tumorceller

in vivo

, med tilsvarende mindre toksicitet for værten [1], [4], [5], [ ,,,0],6]. Selv om den nøjagtige mekanisme for målspecificitet ved TRAIL ikke er kendt, er manglen på toksicitet i normale celler delvis tilskrives den lavere ekspression af dødsreceptorer (DR-4 og DR-5) og den øgede ekspression af decoy receptorer på overfladen af de normale celler [4], [7]. I modsætning hertil en række af cancere viser en øget ekspression af DR-4 og -5-receptorer, hvilket gør dem modtagelige for trail induceret apoptose [3]. Mens den tumoricidal effekt af TRAIL er lovende, har det begrænset effekt og mange tumorer er resistente over for TRAIL [5], [8], [9], [10], [11].

Tidligere arbejde med vores laboratorie- og andre foreslår, at NF-KB positivt reguleres af glycogensyntasekinase-3 (GSK-3) og er involveret i kemo-resistens cancercelle overlevelse, vækst og metastase [12], [13], [14]. GSK-3-hæmning induceret anti-overlevelsesvirkninger i bugspytkirtelkræftceller, der er forbundet med nedregulering af NF-KB-aktivitet og reduceret ekspression af anti-apoptotiske target gener, såsom XIAP, Bd-XL, og cyclin D1 [14].

GSK-3 kan også beskytte celler fra TNF-α-medieret cytotoxicitet, hvilket indikerer, at GSK-3 har en rolle i blokerende død receptormedieret apoptose [15], [16], [17]. Interessant nok har de inhiberende virkninger af GSK-3 blevet udvidet til andre dødsreceptorer såsom TRAIL og Fas [18], [19]. Inhibering af GSK-3 vist sig at forstærke TRAIL-induceret apoptose i humane hepatomaceller og prostatakræft-cellelinier [10], [20]. I løbet af forsøgene beskrevet i vores tidligere arbejde blev det bemærket, at GSK-3-inhibering blokerede aktiveringen af ​​NF-KB af TNF-α [14]. Da NF-KB-aktivering er tidligere blevet foreslået at undertrykke TRAIL-induceret apoptose i bugspytkirtelkræftceller [21], dette fund foreslog potentialet for GSK-3-hæmning at bevidstgøre kræft i bugspytkirtlen til TRAIL. I denne rapport, vi testede, om GSK-3-hæmning havde en sensibiliserende effekt på TRAIL-induceret apoptose både

in vitro

hjælp i bugspytkirtlen og prostatakræft-cellelinier og

in vivo

hjælp Panc-1-xenografter .

Materialer og metoder Salg

cellelinier og reagenser

pancreasadenocarcinom cellelinier PANC-1 og BxPC-3 (ATCC, Rockville, MD) blev opretholdt som tidligere beskrevet [ ,,,0],14]. PPC-1 prostatacancercellelinjer blev dyrket i RPMI 1640 indeholdende 10% FBS, 100 enheder /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin ved 37 ° C og 5% CO2 i luft.

Rekombinant human Apo2L /TRAIL var en gave fra Genentech, South San Francisco CA. Den generelle caspaseinhibitor z-VAD-FMK var fra Alexis-Enzo Life Sciences, Inc. Plymouth Meeting, PA.

Stabil Transfektioner

For overekspression studier, pcDNA3,1-Myc konstruktioner indeholdende anti -apoptotic markører: bcl-2, Bd-XL, CrmA, og MCL-1, som indeholder pcDNA3.1-His-tag-konstruktionen blev anvendt (Sidnet, Toronto, Canada)

PANC-1 og PPC-1 celler. blev transficeret under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) med 0,95 ug /brønd DNA. Transfektanter blev selekteret med G418 i 14 dage for at generere stabile kloner som tidligere [22] beskrevne. Funktionaliteten af ​​de udtrykte proteiner blev bekræftet ved hjælp af staurosporin apoptoseinduktion assay [23].

celleproliferationsassay

Den dosisafhængige virkning af AR-A014418 (AR-18) (syntetiseret, Toronto Research Chemicals Inc., North York, Ontario, Canada), TRAIL (rh-TRAIL, R 0,05

Resultater

GSK-3 Hæmning sensibiliserer trail Resistente bugspytkirtelkræftceller til Apoptose

Behandling af PANC-1 og BxPC-3-celler med AR-18 (25 og 50 uM) eller DMSO i 24 timer, efterfulgt af tilsætning af TRAIL (5, 10, 20, 40 ng /ml) i yderligere 24 timer viste, at behandling med begge lægemidler ledninger til koncentrationsafhængig vækstinhibering som bestemt ved SRB-assayet, selvom PANC-1-celler var relativt resistente over for TRAIL (figur 1). Væsentligt større toksicitet blev set i begge cellelinier upon kombination af de to midler, og denne virkning er stærkt synergistisk ved analyse som tidligere beskrevet [14] (for BxPC-3, p = 0,0002 anvendes en kombination af 40 ng /ml TRAIL og 50 iM AR-18 og p 0,005 for alle de resterende doser tidsplaner, for PANC-1, s 0,005 for alle dosis tidsplaner undtagen 25 uM AR-18 kombineret med 5 og 10 ng /mL TRAIL som ikke var signifikant) (figur 1 og tabel S1). Effekten var mere tydelig efter forbehandling med 50 pM AR-18, hvilket tyder på, at den synergistiske virkning afhænger af omfanget af GSK-3-hæmning stedet TRAIL koncentration.

PANC-1 (A) og BxPC- 3 (B) blev behandlet med TRAIL efter 24 timer forud for eksponering til AR-18 ved de angivne koncentrationer, og celleproliferation måles ved SRB-assay. Hver bar graf betegner betyder fra tre separate forsøg med seks gentagelser. fejllinjer = ± SEM.

Immunoblotanalyse af PARP-spaltning i cellelysater ekstraheret fra PANC-1 og BxPC-3-celler behandlet med 25 pM AR-18, 10 ng /mL TRAIL, eller kombinationen viste, at mens der ikke var nogen påviselig PARP-spaltning under anvendelse af AR-18 alene, den kombinerede behandling med TRAIL signifikant forøget PARP-spaltning i begge cellelinier. I overensstemmelse med de observerede ved SRB assay effekter viste BxPC-3 celler følsomhed over for TRAIL baseret på PARP spaltning, mens PANC-1 celler var resistente.

For at teste, om TRAIL sensibilisering af bugspytkirtelkræftceller af GSK-3 hæmningen er caspase-afhængig, PANC-1 og BxPC-3-celler blev behandlet med 25 pM AR-18 og /eller 10 ng /mL TRAIL i nærvær af den generelle caspaseinhibitor z-VAD-fmk. Som vist i figur 2B, selvom z-VAD selv producerede nogle toksiske virkninger, men det betydeligt reddet både cellelinierne fra kombinationen AR-18 plus TRAIL. Endvidere TRAIL havde en caspase-afhængig virkning på BxPC-3, men ikke PANC-1 celler, i overensstemmelse med deres større TRAIL følsomhed vist ved SRB-assay. Som det ses i figur 2B, delvis redning fra AR-18 forekom med z-VAD-fmk, hvilket antyder, at de inhiberende virkninger af GSK3-inhibering er til en vis grad, caspase-afhængig. Disse data viser, at TRAIL overfølsomhed ved GSK-3-inhibering involverer caspaseaktivering.

(A) BxPC-3 og Panc-1-celler blev behandlet med AR-18, i kombination med eller uden TRAIL i 24 timer og analyseret ved for PARP-spaltning. (B) BxPC-3 (venstre) og PANC-1 (højre) celler blev behandlet med AR-18 (25 pM), TRAIL (10 ng /ml), z-VAD-fmk 50 uM, eller kombinationerne angivne og SRB assay efter 22 timers inkubation. Hver bar graf betegner betyder fra tre forsøg med seks gentagelser. fejllinjer = ± SEM. * P 0,005, ** p. 0,0001

Virkninger af Genetisk Knockdown af GSK-3 på TRAIL Sensibilisering af bugspytkirtelkræftceller

For at teste, om TRAIL-sensibiliserende virkning af AR-18 skyldtes GSK-3-inhibering, og at teste for funktionel redundans i GSK-3 isoformer, vi undersøgte dernæst ekspressionsniveauerne af spaltet PARP og spaltes caspase-3 i cellelysater fra Panc-1-celler transient transficeret med siRNA målrettet mod GSK-3α, β eller begge, i nærvær eller fravær af 10 ng /ml TRAIL. Celler transficeret med scrambled siRNA eller modtager ingen behandling blev anvendt som negative kontroller, mens celler behandlet med AR-18 alene eller i kombination med TRAIL blev betragtet den positive kontrol. Immunoblotting viste 80% reduktion af total protein af hver isoform (figur 3) som svar på 3 dages inkubation med siRNA’er mod GSK-3 isoformer hvis sammenlignet med de ubehandlede eller krypterede behandlede celler. Behandling med TRAIL (10 ng /ml) alene havde en mindre effekt på apoptose som målt ved PARP eller caspase-3 spaltning, mens forbigående knockdown af GSK-3 α eller p-isoformer alene havde nogen signifikante virkninger. Kombinationen af ​​TRAIL med GSK-3β genetiske Knockdown derimod væsentligt forbedret PARP og caspase-3-spaltning i sammenligning med ubehandlede, enkelte behandlinger, eller scrambled siRNA. GSK-3α knockdown i kombination med TRAIL inducerede mindre indvirkning på PARP og caspase-3-spaltning, men samtidig knockdown med GSK-3 havde en signifikant virkning, der var sammenlignelig med AR-18 (figur 3). Disse resultater understøtter idéen om, at GSK-3-inhibering er ansvarlig for TRAIL sensibiliserende virkninger af AR-18, og tyder endvidere på, at GSK-3β spiller en mere fremtrædende rolle. Men er mindre klar, fordi vi ikke var i stand til at opnå den samme grad af knockdown som GSK-3β rolle GSK-3α.

Panc-1 celler blev forbehandlet ved hjælp AR-18 eller siRNA mod både isoformer af GSK-3, og derefter udsat for TRAIL. Immunblotting bekræfter vellykket knockdown af GSK3α og β. Dette resulterede i øget kløvning af PARP og caspase-3 efter eksponering for TRAIL. Scr:. Scrambled uspecifik siRNA

TRAIL Sensibilisering upon GSK-3 Hæmning Involverer Mitokondrier

Død receptor signalering initierer en kaskade af begivenheder, der resulterer i aktivering af effektor caspase- 3 og induktion af apoptose [6]. Men i nogle celler caspase-3-aktivering kræver, signalforstærkning via Bid spaltning og mitokondrier aktivering [2], [6]. Dette fører igen til en ubalanceret fysiologiske status af mitokondrier resulterer i øget produktion af reaktive oxygen mellemprodukter og forstyrrelse af den mitokondriske membranpotentiale [24]. For at teste for inddragelse af mitokondrierne under TRAIL overfølsomhed ved AR-18, flowcytometri blev brugt til at måle mitokondrielle membran potentiale (A ^ m) og generation ROI. Kombination af TRAIL og AR-18 induceret dannelse af heterogene populationer af Panc-1 og BxPC-3-celler, der havde karakter af øget produktion ROI, tab af ATm, og PI-optagelse i sammenligning med ubehandlet kontrol eller enkelt behandlinger (figur 4) . I overensstemmelse med resultaterne fra SRB-assayet og PARP-spaltning, havde AR-18 behandling ikke fremkalde apoptotiske funktioner i nogen af ​​de testede cellelinier. Behandling med TRAIL alene produceret nogle tab af A ^ m og øget ROI i BxPC-3, men ikke PANC-1 celler, selvom denne effekt var ikke så omfattende som kombinationsbehandlingen. Disse resultater antyder, at TRAIL overfølsomhed ved GSK-3-inhibering involverer mitokondrier.

PANC-1 og BxPC-3-celler var ubehandlede eller inkuberet med AR-18 (25 pM), TRAIL (10 ng /ml), eller deres kombination i 24 timer og derefter analyseret ved flowcytometri. Dot tæthed plot af propidiumiodid (PI) optagelse vs A ^ m viser, at tabet af A ^ m forud PI-optagelse. TRAIL induceret tab af A ^ m i BxPC-3, men ikke i PANC-1, i overensstemmelse med deres større følsomhed ses ved anvendelse af SRB-assayet (figur 1). Kombineret behandling med TRAIL og AR18 klart sensibiliserede begge cellelinier til tab af A ^ m, og dette blev ledsaget af øget produktion og tab af ud membran integritet ROI.

molekylære mekanismer i TRAIL Sensibilisering af GSK-3 Hæmning

for yderligere at undersøge mekanismerne i TRAIL overfølsomhed ved GSK-3-hæmning, vi ansat PPC-1 prostatakræft celle overudtrykker Bcl-2, Bcl-XL, og Mcl-1 til at hæmme mitokondrielle pathway, eller cytokin respons modifier A (CrmA) at inhibere død receptor pathway caspaseaktivering. Vurdering af vildtype PPC-1 celler ved anvendelse af SRB og flowcytometri assays viste, at lægemidlet kombinationen var mere effektiv end de enkelte midler (Figur S1). Dernæst vi vurderet virkningerne af anti-apoptotiske proteiner på følsomhed over for TRAIL og AR-18. PPC-1 celler, der overudtrykker CrmA, Mcl-1, Bcl-XL, og Bcl-2 udviste signifikant forøget celleproliferation efter behandling med TRAIL + AR-18 kombination, sammenlignet med celler der ikke overudtrykker nogen anti-apoptotiske markører (figur 5A) .

PPC-1 (A) og PANC-1 (B) stabile kloner transficeret med Bcl-2, Bcl-XL, CrmA, og MCL-1 indeholdende pcDNA3.1-His-tag-konstruktionen blev behandlet med kombination af AR-18 (50 pM) og TRAIL (10 ng /ml) i 24 timer. Resultater udtrykkes som cellelevedygtighed målt ved SRB-assayet. Hver graf betegner betyder fra tre forsøg med seks gentagelser. fejllinjer = ± SEM.

Svarende til resultaterne opnået under anvendelse af de PPC-1-celler, overekspression af CrmA og Bcl-2 i Panc-1-celler beskyttet mod TRAIL + AR-18 kombination, selv om der var forskelle i de relative virkninger af Bcl-2-familiemedlemmer og virkningerne af Bd-XL blev ikke statistisk signifikant i PANC-1-celler. Den beskyttende virkning overudtrykker CrmA, som virker til at undertrykke dødsreceptor caspaseaktivering, antyder den mulighed, at GSK-3-inhibering kan sensibilisere at sti gennem forøgelse af initiator caspaser, såsom caspase-8, samt via anti-apoptotiske molekyler, såsom Bcl- 2 og Mcl-1 i bugspytkirtelkræftceller. Dog vil yderligere arbejde være behov for at etablere dette.

AR-18 sensibiliserer Panc-1 celler til TRAIL

in vivo

For at undersøge effekten af ​​kortsigtede eksponering for kombinationen af ​​AR-18 og TRAIL om apoptose induktion i Panc-1 xenotransplantattumorer, vi først fastslået, at den maksimale dosis på AR-18 tolereres af SCID-mus, der bruges af vores laboratorium var 20 mg /kg, to gange dagligt ved intraperitoneal injektion (ip). Mandlige SCID mus, der bærer PANC-1-xenografter blev inddelt i fire forskellige behandlingsgrupper og behandlet i.p. injektion med DMSO eller AR-18 (20 mg /kg; hver 12. time i 2 dage) efterfulgt af i.p. injektion af TRAIL (25 mg /kg) inden for 24 timer efter den sidste AR-18-dosis. 24 timer efter den sidste behandling blev musene aflivet, og tumorerne høstes (figur 6A).

(A) Skematisk af

in vivo

behandlingsprotokol. (B) β-catenin-ekspressionsniveauer blev kvantificeret under anvendelse af densitometri og de resulterende værdier blev normaliseret mod α-tubulin. T-test viste, at kombinationen vs kontrol: p = 0,0012, og for AR-18 vs kontrol: p 0,0001. (C) Kvantificering af apoptose i tumoren prøver under anvendelse H- score. Spaltet caspase-3 farvede objektglas (som vist i fig S2) blev bedømt for intensiteten af ​​farvning (I) samt procentdelen af ​​celler positive for den tilsvarende farve (H = I × P). Resultater af uparret student t-test (n = 5 i hver behandlingsgruppe) er som følger: TRAIL vs kontrol (p = 0,0002), kombination vs kontrol (p = 0,0004), kombination vs TRAIL (p = 0,0261), kombination vs AR -18 (p = 0,0035). (D) Evaluering af dyr vægt under behandlingen.

Som udlæsning for de farmakodynamiske virkninger af AR-18, vi målte niveauet af β-catenin som reguleres af GSK-3 gennem Wnt-vejen. Der var en signifikant (p 0,0001) stigning i β-catenin-niveauer i sammenligning med DMSO behandlede prøver efter behandling med AR18 (figur 6B), hvilket antyder, at GSK-3-inhibering lykkedes frem i PANC-1-xenografter. Uventet blev niveauerne af β-catenin signifikant forøget i TRAIL-behandlede mus. Dette synes at være en hidtil ukendt konstatering, hvis betydning er i øjeblikket usikkert. Endvidere kombinationen af ​​begge lægemidler signifikant forøget β-catenin-niveauer i sammenligning med DMSO kontroller, men værdierne var ikke signifikant højere end AR-18 alene.

kombinationsterapi Øger spaltet caspase-3

in vivo

H-score målinger af kløvet caspase-3 angav, at TRAIL alene producerede signifikant (p = 0,0002) apoptose induktion i PANC-1 tumorer (Figur 6C og figur S2), mens AR-18 som en enkelt agent havde ubetydelige virkninger. Men kombinationen af ​​AR-18 og TRAIL viste, en større effekt til at inducere apoptose i forhold til enkelte behandlinger eller DMSO behandlede kontroller: kombination vs. kontrol (p = 0,0004), kombination vs. TRAIL (p = 0,0261), kombination vs. AR-18 (p = 0,0035). For at undersøge eventuelle potentielle toksiske virkninger i dyr, der modtog 20 mg /kg AR-18 alene eller i kombination med TRAIL, lever og nyrer blev fikseret i formalin, paraffin indlejret og snit blev farvet med H & E og spaltes caspase-3. Ingen åbenlyse morfologiske ændringer af skader, herunder nekrose eller apoptose blev set. Kropsvægten af ​​dyrene målt dagligt i løbet af denne akut dosering eksperiment viser ingen signifikante forskelle mellem behandlingsgrupper, bortset fra, at dyr, der modtager TRAIL alene opretholdt deres veje i forhold til DMSO-kontrol (figur 6D).

Diskussion

Denne undersøgelse tyder potentiale til at bevidstgøre pancreascancer til TRAIL af GSK-3-hæmning. Først observerede vi TRAIL sensibilisering via GSK-3-hæmning i både prostata og kræft i bugspytkirtlen cellelinjer. For det andet blev fremgangsmåden ifølge TRAIL sensibilisering vist at være caspase-afhængig. Tredje, genetiske knockdown af GSK-3 under anvendelse isoformspecifik siRNA’er var lige effektive i TRAIL-sensibilisering som var lille molekyle inhibitor AR-18. For det fjerde blev GSK-3-inhibitor-induceret TRAIL sensibilisering forbundet med tabet af mitochondriemembranpotential ledsaget af øget produktion ROI. Femte overekspression studier i bugspytkirtelkræftceller indikerede, at begge caspase-8 (CrmA) og NF-KB-afhængige mitokondrielle proteiner (Bcl-2, og MCL-1) var involveret i processen med TRAIL sensibilisering. Anvendelse af TRAIL i kombination med GSK-3-inhibering har relevans for behandlingen af ​​pancreascancer som disse tumorer har en høj frekvens af K-ras og p53-mutationer, der sandsynligvis bidrager til deres modstand mod faste stoffer [27], [28], hvorimod TRAIL følsomhed er rapporteret at være p53-uafhængig og TRAIL er effektiv i tumorer med inaktiv p53 [29]. Desuden har aktiverende K-ras-mutationer er rapporteret til at sensibilisere cancerceller for TRAIL-induceret apoptose [30], [31].

Vi først testet TRAIL sensibilisering fænomen og optimeret vores undersøgelse under anvendelse prostata cancerceller på grund af den tidligere proof of concept i disse cancere [20]. Interessant, selv om der var variation i TRAIL følsomhed blandt de testede cellelinier, med PANC-1 som den mest TRAIL resistente, kombinationen med GSK-3 suppression billede en konsekvent og særdeles signifikant sensibilisering over for TRAIL i alle de testede cellelinjer. Denne sensibilisering forekom at være mere afhængig af niveauet af GSK-3-inhibering, snarere end på TRAIL koncentration. Salg

Tidligere undersøgelser har tilskrevet TRAIL modstand bugspytkirtelkræftceller til overekspressionen af ​​X-bundet inhibitor af apoptose (XIAP ) [32]. Volger

et al.

Viste, at blokering XIAP sensibiliserede bugspytkirtelkræftceller til Trail-induceret apoptose både

in vitro

in vivo

[33]. Andre undersøgelser har understreget betydningen af ​​NF-KB i modstanden mod TRAIL gennem opregulering af inhibitorer af apoptose såsom XIAP, Bcl-2, Bcl-XL, og Mcl-1 [21], [34], [35], [ ,,,0],36], [37]. GSK-3-inhibering nedregulerer ekspressionen niveauet af disse NF-KB målgener [14], [38] og kan også blokere død receptor pathway [15], hvilket antyder, at GSK-3-inhibering kan sensibilisere cancerceller for TRAIL behandling via flere mekanismer .

i tråd med den tidligere fund, at GSK-3 kan blokere død receptor signalering opstrøms af caspase-8 [15], CrmA overekspression reddet fra kombinationen TRAIL + AR18. Selv tyder på en ekstra rolle for GSK-3 i døden receptor signalering, vil være behov for yderligere forsøg for at bekræfte, at. Vi fandt også kløvning af caspase-3 og PARP i celler, der er sensibiliseret til TRAIL ved enten AR-18 eller genetisk knockdown af GSK-3 isoformer. Interessant virkningen af ​​GSK-3β i TRAIL-induceret apoptose var mere fremtrædende end GSK-3α, skønt intensiteten af ​​dobbelt isoform knockdown blev signifikant forøget sammenlignet med GSK-3β alene, og var sammenlignelig med den set med AR-18. Disse resultater svarede til vores tidligere rapport indikerer, at genetisk blokade af GSK-3β og dobbelt knockdown af GSK-3 isoformer er forholdsvis mere effektive end GSK-3α til undertrykkelse NF-KB-aktivitet [14]. Men det var ikke formelt testet i disse eksperimenter og ville kræve yderligere undersøgelser.

Flere af NF-KB målproteiner hæmme mitokondrie vej, og vi spurgte derfor, om AR-18 + TRAIL kombination forstyrrer mitokondriefunktionen . Vi fandt en forøget frigivelse af ROI sammenholdt med nedsat mitrokondriemembranen i celler behandlet med TRAIL + GSK-3-inhibitor, hvilket antyder inddragelsen af ​​mitokondrier. Selvom generation af ROI som en effektor mekanisme under lægemiddel-induceret apoptose i cancerceller er velkendt [39], vores resultater er af interesse som de foreslår en sammenhæng mellem TRAIL overfølsomhed ved GSK-3 hæmning og mitokondrie respiratoriske kæde. En sådan effekt er tidligere observeret i en undersøgelse foretaget af Jung

et al

., ved hjælp af curcumin til at bevidstgøre renal kræftceller til Trail [40]. Curcumin behandling forbedret generation ROI i TRAIL sensibiliserede celler. Desuden har vi også observeret en stigning i DR-5-ekspression i en ROI-afhængig måde [40]. Lignende resultater blev tidligere rapporteret i humane astrogliale celler, understreger ROI-afhængige opregulering af TRAIL dødsreceptorer [41]. Spaltning af caspase-3 observeret i vores undersøgelse kan yderligere produktion indflydelse ROI, som aktiveret caspase-3 kan inducere en tilbagekoblingssløjfe på den mitokondriske respiratoriske kæde [42]. Uanset om stigning i generation ROI i bugspytkirtelkræftceller er den afgørende årsag til TRAIL overfølsomhed efter GSK-3-hæmning, eller det er genereret som en tilskuer effekt af apoptose udførelse, stadig at blive undersøgt. Det er også værd at bemærke, at generation ROI igen kunne linke NF-KB til processen med TRAIL sensibilisering af GSK-3-inhibitorer i bugspytkirtelkræft.