PLoS ONE nikotinsyre receptor abnormaliteter i Human Skin Cancer: Konsekvenser for en rolle i epidermal Differentiation

Abstrakt

Baggrund

Kronisk eksponering UV hud fører til epidermale differentiering defekter hos mennesker, der kan være stort set restaureret af farmakologiske doser af nikotinsyre. Nicotinsyre er blevet identificeret som en ligand for de menneskelige G-protein-koblede receptorer GPR109A og GPR109B der signalerer gennem G

i-medieret hæmning af adenylylcyklase. Vi har undersøgt udtryk, cellulære fordeling, og funktionaliteten af ​​GPR109A /B i human hud og hud afledt epidermale celler.

Resultater

Nicotinsyre øger epidermal differentiering i fotoskadet menneskehud som bedømt af terminal differentiering markører caspase 14 og filaggrin. Både GPR109A og GPR109B gener transskriberes i huden og i epidermiskeratinocytter, men udtryk i dermale fibroblaster er under detektionsgrænserne. Receptor udskrifter er meget over-udtrykt i planocellulære kræft. Receptorprotein i normal hud er fremtrædende fra den basale gennem granulære lag af epidermis, med cellulære lokalisering mere dispersiv i det basale lag, men overvejende lokaliseret på plasmamembranen i mere differentierede epidermale lag. I normale humane primære og udødeliggjort keratinocytter, nikotinsyrederivater receptorer viser plasmamembranen lokalisering og funktionel G

i-medieret signalering. I modsætning hertil i et pladecellekarcinom afledt cellelinie, receptorproteinet viser en mere diffus cellulær lokalisering og receptorerne er næsten ikke-funktionel.

Konklusioner Salg

Resultaterne af disse undersøgelser berettiger fremtidig genetisk og farmakologiske interventionsstudier at definere mulige specifikke rolle (r) af nicotinsyre receptorer i menneskelig hud homeostase

Henvisning:. Bermudez Y, Benavente CA, Meyer RG, Coyle WR, Jacobson MK, Jacobson EL (2011) Nicotinic Acid Receptor abnormaliteter i human Skin Cancer: Konsekvenser for en rolle i epidermal Differentiering. PLoS ONE 6 (5): e20487. doi: 10,1371 /journal.pone.0020487

Redaktør: Christophe Egles, Université de Technologie de Compiègne, Frankrig

Modtaget: Marts 9, 2011; Accepteret: April 27, 2011; Udgivet: 31 maj, 2011

Copyright: © 2011 Bermudez et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet delvist af National Institutes of Health giver CA43894, CA106677, CA78447, CA027502, ES06694, og HD048837. Den bidragyder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. MKJ og ELJ er skoleledere i NiadynePharma, Inc., hvis sponsoreret forskning ledes i overensstemmelse med University of Arizona konflikt-af-interesse politikker.

Introduktion

funktionerne hud som en metabolisk aktiv biologisk barriere beskytter mod eksterne miljømæssige fornærmelser. Opretholdelsen af ​​hudbarrieren er kritisk, da mange dermatologiske sygdomme er karakteriseret ved defekt barriereintegritet resulterer i en formindsket beskyttende kapacitet af huden. dannelse hudbarriere er kendetegnet ved en fremgangsmåde af homeostase hvor delende celler i det basale lag stadighed migrere mod hudoverfladen og undergår terminal differentiering og ultimativt planlagt celledød til dannelse af stratum corneum sammensat af terminalt differentierede keratinocytter og andre stoffer, der danner barrieren [ ,,,0],1]. Dog skal epidermal proliferation og differentiering omhyggeligt afbalanceret da utilstrækkelige proliferation resulterer i en udtynding af epidermal lag af huden og tab af beskyttelsesbarriere mens forøget proliferation uden koordinere øget differentiering fører til lidelser, såsom psoriasis og hudcancer [1].

en stor miljømæssig trussel resulterer i multiple ændringer i hudens struktur og funktion er at udsættelse for ultraviolet lys fra [2] solen. Kronisk sol lys eksponering kan i sidste ende føre til epidermal hyperproliferation med forringet differentiering resulterer i aktinisk keratose (AK) læsioner og pladecellecarcinom (SCC) i huden. Den vigtigste histologiske kendetegn ved SCC er substitution af normale modnet epidermale keratinocytter med ringe differentierede atypiske pladeceller [3]. Mudgil et al. har demonstreret i huden epidermale ækvivalenter, der transformerede, dårligt differentierede keratinocytter kan drives til at differentiere i tilstedeværelsen af ​​et tilstrækkeligt antal normale keratinocytter [4]. Disse observationer antyder, at behandlinger, som kan fremme epidermal differentiering i fotoskadet hud har potentiale til at genoprette balancen i proliferation og differentiering kræves for at opretholde hudens homeostase og således kunne modvirke udviklingen af ​​AK-læsioner og SCC.

En af de farmakologiske virkninger af nikotinsyre på fotoskadet hud er at fremme epidermal differentiering [5], at hæve den mulighed, at en nikotinsyre receptor kan være involveret. Receptoren betegnes GPR109A (HM74A hos mennesker og PUMA-G i mus), for nylig givet HGNC udpegning af NIACR1, blev opdaget i stærkt differentierede adipocytter, milt og immunceller [6], [7], [8]. GPR109A par til G-proteiner af G

i familien, en hæmmende G-protein, der ved ligandbinding signaler faldet af adenosin 3 ‘, 5’-cyklisk monophosphat (cAMP) produktion via inhibering af adenylylcyclase i en pertussistoksin -følsom måde [6], [7], [8]. GPR109A er medlem af en underfamilie af G-protein-koblede receptorer (GPCR), sammensat af GPR109A og GPR81 som begge findes i mennesker og gnavere. GPR109B (også betegnet HM74) er et andet medlem af denne receptorfamilie, der binder omend med lav affinitet til nicotinsyre og er kun til stede hos mennesker. Nicotinsyre aktiverer både GPR109A og GPR109B med EF

50 værdier på 0,1 uM og 100 uM [9]. Selv om det anses for usandsynligt, at nikotinsyre er den endogene ligand af disse receptorer, farmakologiske doser af nikotinsyre virker gennem GPR109A mægle både ønskede anti-lipolytiske virkninger samt uønskede kutane vasodilatation effekter forbundet med oral nikotinsyre terapi [6], [7 ], [8], [10], [11]. Da nicotinsyreinduceret prostanoid formation ansvarlig for hudens rødmen er blevet foreslået at finde sted i dermal dendritic Langerhans celler, har ekspressionen af ​​GPR109A i huden blevet undersøgt i denne forbindelse [10], [12], [13], [14] ; dog kun lidt om de funktioner af nicotinsyre receptorer i andre aspekter af huden biologi. Her undersøger vi udtrykket, cellulære fordeling, og funktionaliteten af ​​GPR109A og GPR109B i hud og hud afledte celler. Vores resultater viser, at pladecellekræfttyper har unormal GPR109A /B-ekspression, cellulære distribution og funktion, hvilket indikerer, at disse receptorer er involveret i hudens homeostase.

Materialer og metoder Salg

Cell Culture

Normale humane epidermale keratinocytter (NHEK, Lonza, Schweiz) blev rutinemæssigt dyrket i EpiLife (GIBCO /Invitrogen) indeholdende human keratinocytvækstfaktor tillæg for mindre end 10 populationsfordoblinger. Normale humane diploide fibroblaster, CF3, (befolkning fordoblinger mindre end 30, Oklahoma Medical Research Foundation, Oklahoma City, OK), den etablerede cellelinie af immortaliserede humane epidermale keratinocytter, HaCaT, og Ras-transformerede HaCaT, gaver fra Dr. Norbert Fusenig ( Tysk Cancer Research center, Heidelberg, Tyskland) [15], den humane epidermoide carcinom cellelinie, A-431 (American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA), og pladecellecarcinomet cellelinie, SCC-25 (ATCC ) blev rutinemæssigt dyrket i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS, Hyclone /Fisher Scientific). Alle celler blev holdt i en fugtig atmosfære indeholdende 5% CO

2 ved 37 ° C.

revers transkriptase polymerasekædereaktion (RT-PCR)

Totalt RNA fra fedtvæv, placenta , lunge og hud blev erhvervet fra Stratagene (Cedar Creek, TX) og 1 pg af hver RNA blev anvendt til at udføre cDNA synteser under anvendelse af TaqMan Reverse Transcription kit fra Applied Biosystems (Foster City, CA). PCR blev udført under anvendelse af følgende primere for GPR109A og GPR109B: GPR109A – fremad – 5’CACCACACAGACACACACCTCCTTGCTGG 3 ‘, GPR109B – fremad – 5’CACCATACAGACACACGCCACTTTGCTGG 3’, og den reverse primer for begge gener – 5’CAGTGACATTACTCGATGCAACAGCCCAAC 3 ‘syntetiseres ved integrerede DNA Technologies (IDT, Coralville, IA). Termisk cykling var som følger: aktivering af DNA-polymerase ved 94 ° C i 1 min, efterfulgt af 25 amplifikationscykler ved 94 ° C i 1 min og 62 ° C og 68 ° C i 1 min hver

Kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR)

Totalt RNA fra dyrkede celler blev fremstillet under anvendelse af RNeasy Mini Kit oprensningssystem (Qiagen, Valencia, CA) ifølge producentens instruktioner. Frosne opnåede human normal hud biopsier, AKs, og SCC blev opnået fra projektet med titlen “Chemoprevention for hudkræft Program Project Archived Prøver til Ekstra Analyser, revideret af University of Arizona IRB (Tucson, AZ), Projekt nummer 08-0201-04 . Undersøgelsen, som prøverne blev opnået, blev udført i overensstemmelse med erklæringen fra Helsinki principper. Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle fag. Total RNA fra hud vævsprøver blev fremstillet ved anvendelse af RNeasy fibrøst væv Mini Kit (Qiagen) ved at følge fabrikantens protokol. cDNA-syntese blev udført under anvendelse af TaqMan Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA) ifølge producentens instruktioner under anvendelse af vilkårlige hexamerer og 1 ug totalt RNA. For TaqMan-baserede QRT-PCR ekspression profilering, blev 25 ng af hver cDNA herunder totalt RNA fra pladecellecarcinom prøver (Asterand, Detroit, MI) tilsat til iTaq Supermix (BioRad, Hercules, CA) sammen med TaqMan MGB prober ifølge til fabrikantens protokol (Applied Biosystems, Foster City, CA). QRT-PCR blev udført som tidligere beskrevet [16]. Prober designet til specifikt at detektere human GPR109A (TaqMan Gene Expression Assay Hs02341584_s1) og GPR109B (TaqMan Gene Expression Assay Hs02341102_s1) transkripter blev anskaffet fra Applied Biosystems. Real-time fluorescensovervågning blev udført med ABI Prism 7000 (Applied Biosystems). I humane hudvæv, glyceraldehyd 3-phosphatdehydrogenase (GAPDH) og β-actin-genekspression ændret med graden af ​​malignitet sammenlignet med 18s rRNA, der forblev konstant. I dyrkede celler, GAPDH og β-actin-ekspression forblev konstant i forhold til 18s rRNA; derfor relative ekspressionsniveauer for de forskellige transkripter blev bestemt ved sammenligning med husholdning gener, 18s rRNA for væv og GAPDH for dyrkede celler. Alle ekspressions-målinger blev udført tre gange ved anvendelse af mindst tre uafhængigt genererede cDNA prøver. Resultater udtrykkes som middelværdi ± standardafvigelse af middelværdien (SEM). Relativ genekspression blev beregnet som tidligere [17] beskrevne. Ændringer i genekspression blev anset signifikante på 1,5 gange forandring og p ≤ 0,05.

Antistof Generation og rensning

Til analyse af menneskelig GPR109A og GPR109B, en skik, kommerciel antistof blev genereret på kaniner anvendelse af et syntetisk peptid (RHHLQDHFLEIDKKNC) for at generere antisera anerkende den N-terminale ende af GPR109A og GPR109B (Sigma-Genosys, Woodlands, TX). Animal vedligeholdelse og antistof produktion blev udført af Sigma-Genosys henhold til protokollen revideret og godkendt af Sigma-Genosys Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC), OPRR Assurance A4182-01; USDA Registreringsnummer 93-R-283. Antisera var affinitetsoprenset under anvendelse Pierces Aminolink Kit ifølge producentens protokol (Rockford, IL). Antistofferne blev valideret ved at påvise, ekstrakter fra HeLa-celler, som ikke udtrykker receptoren, ikke viser positive immunblots men ekstrakter fra HeLa-celler (American Type Culture Collection, Manassas, VA) transficeret med nikotinsyre receptor viste positive bånd på den forventede migration position. Derudover, CF3 celler, der ikke udviste receptorekspression ved QRT-PCR heller ikke udviser positive immunblots. Også, analyserer alle immunblot medtaget en kontrolgruppe, der viste, at peptidet mod hvilket antistofferne blev dannet udkonkurreret signalet.

immunblotting

SDS-PAGE og Western blot-analyser blev udført som tidligere beskrevet [ ,,,0],18]. Adhærente cellepopulationer blev lyseret i iskold lyseringsbuffer (150 mM natriumchlorid, 50 mM natriumfluorid, 50 mM kaliumphosphat, 40 mM natriumpyrophosphat, 500 pi Triton X-100, 100 pi SDS, 200 pi 1 M Tris-HCI pH 7,4 i vand og 1 tablet om fuldstændig mini protease inhibitor cocktail, Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) i 30 minutter ved 4 ° C. Lysater blev derefter centrifugeret ved 12.000 rpm i 30 minutter ved 4 ° C. Proteinkoncentrationen af ​​lysaterne blev bestemt under anvendelse af BCA ™ Protein Assay Kit (Pierce, Rockford, IL) ifølge producentens instruktioner. Tyve mikrogram protein blev tilsat til 4 × loading buffer (250 mM Tris, pH 6,8, 8% SDS, 20% glycerol, 0,012% bromphenolblåt, 4% β-mercaptoethanol), opvarmet til 95 ° C i 5 min, elektroforesebehandlet i 12,5 % SDS-polyacrylamidgeler og overført til PVDF-membraner (Amersham, Piscataway, NJ). Alle membraner blev blokeret i 1 time med 5% fedtfri mælk i Tris saltvand (TBS) plus 0,1% Tween-20 (10 mM TBS-T, pH 7,4) og inkuberet natten over ved 4 ° C i primært antistof eller primær antistof plus 1000 molært overskud peptid (anvendt til at generere antistof) i forhold til antistof, inkuberet i 5% fedtfri mælk TBS-T 24 timer før brug. Membraner blev inkuberet og udviklet i Immobilon ™ Western Chemiluminescent HRP Substrate (Millipore, Billerica, MA) ifølge producentens instruktioner. Efter første blotting blev membranerne testet igen for β-actin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) for at sikre selv lastning. Blots blev scannet og analyseret med ImageJ udgave 1.39u software (NIH, Bethesda, MD). Værdier rapporteret for målproteiner blev normaliseret til blots respektive p-actin niveauer i mindst tre uafhængige forsøg.

Immuncytokemi (ICC)

CF3, NHEK, HaCaT, Ras-transformerede HaCaT, A-431, og SCC-25-celler blev dyrket på dækglas. Til fiksering blev celler skyllet to gange med TBS, inkuberet i 4% formaldehyd i TBS i 30 min og skyllet to gange med TBS. At mærke GPR109A /B-receptorer, blev endogen biotin blokering udført under anvendelse NeutrAvidin ™ Biotin-protein (Pierce) i 30 minutter ved stuetemperatur. Umiddelbart efter blev cellerne inkuberet i 3% bovint serumalbumin opløst i TBS (BSA-TBS) blokeringspuffer i 1 time og inkuberet natten over ved 4 ° C med primært antistof fortyndet med blokerende buffer (1:10). For peptid kompetitive forsøg blev et 1000 gange overskud af peptid inkluderet. Den følgende dag blev cellerne vasket 3 gange i 5 min hver med TBS. Det blokerende trin blev gentaget, og celler blev inkuberet i 01:25 Biotin-SP-konjugeret AffiniPure gede anti-kanin IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) i 30 minutter ved 37 ° C. Objektglas blev vasket med TBS og inkuberet i 1:25 Streptavidin Quantum Dot 605 Konjugater (Millipore) i 45 minutter ved 37 ° C. Efter grundige vaske med TBS, blev dækglas monteres med montering medium, der indeholder 90% glycerol og 10% TBS. De immunofarvede objektglas blev anbragt ved 4 ° C og visualiseres den følgende dag under et fluorescensmikroskop.

Immunhistokemi (IHC)

Immunhistokemisk påvisning af GPR109A /B blev udført på paraffinindlejrede snit fra normal human hud biopsier. Arkiverede materiale fra en undersøgelse foretaget i overensstemmelse med erklæringen af ​​Helsinki principper gennemgået af Integ anmeldelse Etiske Review Board, Austin, TX. Alle emner læst og underskrevet en IRB-godkendt samtykke Form. Alle deltagere, der administrerer interventionerne, og dem, vurdere resultaterne blev blindet til gruppeopgave. Paraffinindlejrede snit blev afparaffiniseret i xylen og hydratiseres i en gradueret serie af alkohol, blev snit nedsænket i citronsyre i et vandbad ved 87 ° C i 20 min for at forbedre antigen-genvinding. Sektioner blev derefter skyllet i TBS og blokeret i 3% BSA-TBS i 20 min. Umiddelbart efter blokering blev sektioner inkuberet i primært antistof i 3% BSA-TBS (1:10) natten over ved 4 ° C. For peptid kompetitive forsøg blev et 1000 gange overskud af peptid inkluderet. Den følgende dag blev snit vasket i TBS, blokeret igen og inkuberet i 01:25 Biotin-SP-konjugeret AffiniPure gede anti-kanin IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) i 30 minutter ved 37 ° C. Snit blev skyllet med TBS og inkuberet i 1:25 Streptavidin Quantum Dot 605 Konjugater (Millipore) i 45 minutter ved 37 ° C. Efter grundige vaske med TBS, blev dækglas monteres med montering medium, der indeholder 90% glycerol og 10% TBS. For peptid konkurrenceeksperimenter blev snit vasket i TBS og inkuberet i 1:1000 FITC gede anti-kanin IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories) i 1 time ved stuetemperatur.

IHC analyse af caspase 14 og filaggrin involveret analoge fremgangsmåder under anvendelse af antistof SC5628 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) for caspase 14 og 3137 til 500 (Abcam, Cambridge, MA) for filaggrin. Kvantificering af antistof-farvning blev udført som tidligere beskrevet [5].

cAMP Assay

NHEK, HaCaT, Ras-transformerede HaCaT, A-431, SCC-25, og CF3-celler blev podet ved en densitet på 25.000 celler i 35 mm dyrkningsskåle. To dage senere blev dyrkningsmediet fjernet og erstattet med dyrkningsmedium indeholdende ± 100 ng /mL pertussistoksin (inkuberet natten over), ± 10 pM forskolin i nærvær eller fravær af nicotinsyre ved forskellige koncentrationer i 1 time før testning. Bortset dosisreaktionsundersøgelser, slutkoncentrationen af ​​nicotinsyre anvendte var 100 uM. Måling af intracellulære cAMP-niveauer blev udført ved anvendelse af cyklisk AMP Complete EIA Kit (Assay Designs, Ann Arbor, MI) ifølge producentens anvisninger. Forsøg blev gentaget tre gange med uafhængige cellekulturer. Data er præsenteret som gennemsnit ± SEM fra tre separate forsøg.

Resultater

Nicotinsyre fremmer epidermal differentiering i fotoskadet menneskelig hud

Kronisk UV eksponering fører til nedsat epidermal differentiering og øget epidermal proliferation, som kan resultere i aktinisk keratose læsioner og pladecellekræfttyper af huden [19]. Vi har tidligere konkluderet, at myristylalkohol nicotinat (MN), et prodrug, der leverer nicotinsyre til huden, fremmer epidermal differentiation med tilhørende øget hudbarrierefunktion i kronisk fotoskadet hud som bedømt ved ændringer i epidermal og stratum corneum tykkelse, nedsat satser af transepidermalt vandtab og stigninger i minimal erythematøs [5]. For at undersøge effekten af ​​MN på differentiering mere direkte blev to epidermal differentiering markører, caspase 14 og filaggrin [20] vurderes i fag med hud lysbeskadigelse i et placebokontrolleret klinisk forsøg [5]. Fig. 1A viser et eksempel på biopsiprøver farvet ved baseline og efter 12 ugers topisk påføring af en formulering indeholdende 5% MN og fig. 1B viser kvantificering af caspase 14 og filaggrin i patienter behandlet med placebo eller MN formuleringer. Tilstedeværelsen af ​​MN resulterer i en stigning i forhold til placebo på ca. 30% for caspase 14 og 20% ​​for filaggrin. Placebo-formulering erstattes myristylmyristat for MN, udelukker eventuelle virkninger af myristylalkohol, der er genereret som nikotinsyre er befriet fra prodrug.

Tissue arrays af hudbiopsi prøver fra et klinisk studie af virkningerne af myristyl nicotinat (MN) i humane forsøgspersoner med fotoskadet hud [5] blev farvet for de terminale differentieringsmarkører caspase 14 og filaggrin. Panel A: Et eksempel på en biopsiprøve ved baseline og 12 ugers MN behandling farvet med H Methods). Dette antistof er rettet mod en sekvens nær N-terminus er fælles for begge receptorer og skelner ikke mellem stærkt homologe GPR109A og GPR109B proteiner. Western blot-analyser viser, at nicotinsyre receptor protein blev påvist i alle undersøgte ved den forventede størrelse for de to nikotinsyrederivater receptorer (~42 kDa) (fig. 3B) cellelinier. Den bruges til at generere antistof-peptid konkurrerede effektivt antistoffet signal, hvilket viser antistof selektivitet (fig. 3C). Mængden af ​​protein i forhold til p-actin er højere i de immortaliserede, transformerede og maligne cellelinjer undersøgte forhold til NHEK.

Nikotinsyre receptorer i human hud er til stede i epidermis og hårsækken

for at bestemme den cellulære lokalisering af GPR109A /B i huden, blev immunfarvning analyser udført. Vi observerede, GPR109A /B udtrykkes fra det basale lag gennem torntappene og granulære lag af epidermis og i hårsækkene af normal human hud (fig. 4A). Højere forstørrelse (fig. 4B) viser, at GPR109A /B-ekspression synes at være mere jævnt fordelt i hele cellen i de basale cellelag i epidermis og viser en mere perifer fordeling i torntappene og granulære lag, hvor keratinocytter er i senere stadier af terminal differentiering. En alternativ fluorescerende tag, fluoresceinisothiocyanat (FITC), til påvisning af anti-peptid-antistof binding anvendes i fig. 4C at påvise, at der anvendes til at generere antistoffet blokeres effektivt bindende i disse væv peptid (fig. 4D).

Immunhistokemi (IHC) analyser blev udført på paraffinindlejrede humane hudsektioner anvender antistof mod GPR109A /B. Paneler A og B udnyttede Streptavidin Quantum Dot 605 Konjugater til påvisning. Paneler C og D brugte FITC gede anti-kanin IgG til detektion. Panel A: Repræsentativ immunfarvning viste prøve ved 200 ganges forstørrelse. Panel B: repræsentant IHC viste prøve ved 400 ganges forstørrelse. Paneler C og D: repræsentant IHC prøver vist ved 400 ganges forstørrelse i fravær (panel C) eller nærvær (panel D), i konkurrence med peptid anvendes til at generere antistoffet. Forkortelser: SC, stratum corneum; SG, stratum granulosum; SS, stratum spinousum; SB, stratum basale. Størrelse markør repræsenterer 2 mikrometer.

Nicotinsyre receptor cellulære lokalisering varierer blandt dyrkede epidermale celler

NHEK celler blev farvet ved hjælp af anti-peptid-antistof (fig. 5A) og peptid konkurrence blokeret farvningen (fig. 5B). Farvning vises på periferien af ​​aggregater af celler formning “brosten strukturer”, mens isolerede celler synes at have en mere diffus mønster af mærkning (fig. 5A). I HaCaT celler, er GPR109A /B-ekspression primært lokaliseret til periferien (Fig. 5C). I modsætning hertil i Ras-transformerede HaCaT (fig. 5D), A-431 (fig. 5E), og SCC-25 (fig. 5F) membranlokalisering plasmaet er ledsaget af mærkning hele cytoplasmaet. Receptorekspression i hudfibroblaster, CF3, er upåviselig (data ikke vist)

Paneler A og B:. Immuncytokemi (ICC) analyser anvendelse af et antistof mod GPR109A /B blev udført på NHEK vist med rødt og fusioneret med nukleare DAPI-farvning i blåt. Panel A viser farvning ved hjælp af GPR109A /B-antistof og Panel B viser farvning i nærvær af 1000 gange overskud af peptider anvendt til at hæve antistoffet. Panel C: HaCaT, Panel D: Ras-transformerede HaCaT, Panel E: A-431, Panel F: SCC-25. For alle paneler, forstørrelse var 400 × og størrelse markering repræsenterer 10 mikrometer.

Normale keratinocytter demonstrere et funktionelt G-protein-koblede nikotinsyre receptor signalering gennem G

i hvis funktion er formindsket i hudkræft celler

de fleste karakteriseringer af funktionaliteten af ​​nikotinsyre receptorer er blevet undersøgt i celler, som ikke i sig selv udtrykker receptorerne, men i hvilke receptor gener transficeret og over-udtrykkes. I vores undersøgelser har vi undersøgt iboende receptor funktionalitet ved at måle evnen hos nicotinsyre til at inhibere forskolin-stimuleret cAMP-dannelse i fraværet af heterolog ekspression. Under disse betingelser var det relative bidrag af nikotinsyre følsomme cAMP-dannelse er mindre end i transficerede celler. Forskolinbehandling fremkaldte cAMP-dannelse i alle cellerne undersøgt med en ophobning af 170-200 pmol cAMP pr mg protein i en 1 times inkubation og tilstedeværelsen af ​​100 uM nicotinsyre inhiberede forskolin-induceret cAMP-produktion differentielt i de forskellige celletyper ( fig. 6A). Den relative grad af inhibering i de forskellige cellelinjer ved nikotinsyre er vist i fig. 6B. Inhibering af cAMP-dannelse ved nikotinsyre gennem de iboende receptorer var ca. 44% i NHEK-celler, 43% i HaCaT og 39% i Ras-transformerede HaCaT celler. I modsætning hertil blev cAMP stimuleret af forskolin markant reduceret i de tumorafledte celler. Nicotinsyre hæmmede kun 23% i A-431 celler og 13% i SCC-25 celler. Fig.