PLoS ONE: Raman Spektroskopiske Undersøgelse af radioresistente Oral Cancer underlinjer Etablerede af Fraktioneret Ioniserende Radiation

Abstrakt

Strålebehandling er en vigtig behandling modalitet for kræft i mundhulen. Men udvikling af radioresistance er en stor forhindring i effektiviteten af ​​strålebehandling i orale kræftpatienter. Identificering prædiktorer for radioresistance er en udfordrende opgave, og er blevet mødt med ringe succes. Formålet med den foreliggende undersøgelse var at undersøge den differentielle spektrale profiler af de etablerede radioresistente underlinjer og parentale oral cancer cellelinjer ved Raman spektroskopi. Vi har etableret radioresistente underlinjer nemlig 50Gy-UPCI: SCC029B og 70Gy-UPCI: SCC029B fra dets forældrenes UPCI: SCC029B cellelinie, ved hjælp af klinisk realitetsbehandling 2Gy fraktioneret ioniserende stråling (FIR). Den udviklede radioresistente karakter blev valideret af klonogenisk celleoverlevelse assay og kendte radioresistance-relateret proteinmarkører som Mcl-1, Bcl-2, Cox-2 og Survivin. Ændrede cellulære morfologi med signifikant stigning (p 0,001) i antallet af filopodia i radioresistente celler med hensyn til parentale celler blev observeret. Raman spektre af forældrenes UPCI: SCC029B, 50Gy-UPCI: SCC029B og 70Gy-UPCI: SCC029B celler blev erhvervet og spektrale egenskaber indikerer mulige forskelle i biomolekyler som proteiner, lipider og nukleinsyrer. Principal komponent analyse (PCA) forudsat tre klynger, der svarer til radioresistente 50Gy, 70Gy-UPCI: SCC029B underlinjer og forældrenes UPCI: SCC029B cellelinje med mindre overlap, der foreslår ændret molekylær profil erhvervet af radioresistente celler på grund af flere doser af bestråling. Resultaterne af denne undersøgelse understøtter potentialet i Raman spektroskopi i forudsigelse af radioresistance og muligvis bidrage til en bedre prognose for oral cancer

Henvisning:. Yasser M, Shaikh R, Chilakapati MK, Teni T (2014) Raman Spektroskopiske Study af radioresistente oral cancer underlinjer Etablerede af Fraktioneret ioniserende stråling. PLoS ONE 9 (5): e97777. doi: 10,1371 /journal.pone.0097777

Redaktør: Gabriele Multhoff, Technische Universitaet Muenchen, Tyskland

Modtaget: Februar 7, 2014 Accepteret: April 23, 2014; Udgivet: May 19, 2014

Copyright: © 2014 Yasser et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Raman spektrometer ansat i undersøgelsen blev indkøbt fra DBT projekt BT /PRI11282 /mED /32/83/2008 med titlen “Udvikling af in vivo laser Raman spektroskopi metoder til diagnosticering af oral præcancerøse og kræft betingelser,” Institut for Bioteknologi, Indiens regering. Mohd Yasser er finansieret af et stipendium fra universitetet Grants Kommissionen (UGC) – Indien. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Oral cancer er den sjette mest almindelige kræftform i verden [1]. I Indien, omfattende brug af tobak i forskellige former gør den til den førende form for kræft hos mænd og tredje mest almindelige kræftform hos kvinder [2], [3]. Også forekomsten af ​​oral mundslimhinden cancer type er høj i det indiske subkontinent [4]. Vilkårene for oral cancer behandling er baseret på forskellige faktorer, herunder sygdom etape, adgang til den mundtlige site, alder og fysisk tilstand patienten. Selvom kirurgi er valg af behandling i tidlige stadier; strålebehandling indtager en vigtig plads enten alene eller som en adjuvans med kemoterapi [5], [6]. Standard strålebehandling protokol indebærer daglig eksponering af 2Gy fraktion dosis for nogle uger, hvor patienterne får en kumulativ dosis på 50Gy til 70Gy under strålebehandling kurset [7], [8], [9]. Fraktioneret strålebehandling dræber hurtigt dividere tumorcellepopulation med nedsat effekt på omgivende normale væv. Således denne fremgangsmåde tilvejebringer tid for normale celler til at genbefolke og inddrive mens faldende tumorceller, der aberrerende aktiverede signaltransduktionsveje [10], [11]. Men nogle gange tumor går igen med en erhvervet radioresistente fænotype forklædt som en forhindring mod effekten af ​​strålebehandling. For at gøre strålebehandling mere effektiv; er det vigtigt at undersøge den radioresistente fænotype i cancerceller. Foreningen af ​​flere proteiner såsom p53 [12], Cox-2 [13], Ras [14], Pakt [15], MDM2 [16], Clusterin [17], Survivin [18], Bcl-2 [19], og MCL-1 [20] med radioresistance er blevet rapporteret tidligere. Men indtil videre er der ingen tilgængelige værktøj, der kan forudsige strålebehandling respons i orale kræftpatienter fører i retning af bedre behandling.

Biomedicinsk anvendelse af optiske spektroskopiske teknikker som Fluorescens, Fourier transfer infrarød (FTIR), Spredt reflektans og Raman spektroskopi (RS) til klassificering af forskellige patologiske tilstande og kræft afsløring er allerede blevet rapporteret [21] – [24]. Blandt disse teknikker, har RS tilføjet fordele ligesom det er label gratis, følsom over for biokemiske variationer, der gælder for

in vitro

og

in vivo

betingelser, har minimal indblanding fra vand og giver molekylære fingeraftryk [ ,,,0],25] – [27]. Vores tidligere undersøgelser har vist effektiviteten af ​​RS ved klassificering sunde, præmaligne og maligne læsioner af oral submucosa [28] – [29]; klassificering af de normale og unormale eksfolierede celler [30], og i forudsigelsen af ​​tumor respons i retning samtidig kemo-strålebehandling i livmoderhalskræft [31]. Vi har vist potentialet i RS identificere tidlige transformation ændringer i oral mundslimhinden [32], dens gennemførlighed at opdage astma og bestemme behandlingsrespons gennem serum i astmapatienter [33], i at klassificere normal og kræft i mundhulen serum [34] og i identificere multiresistens fænotype i menneskelig leukæmi [35] og uterin sarkom cellelinjer [36].

(A) Klonogen celleoverlevelse kurve. UPCI: SCC029B parentale celler, 50Gy-UPCI: SCC029B mellemliggende radioresistente celler og 70Gy-UPCI: SCC029B endelige radioresistente celler. Data er repræsenteret som procent overlevelse af celler med gennemsnitlige (± SD) af tre uafhængige forsøg. En-vejs ANOVA statistisk analyse blev udført på overlevende fraktioner på de givne doser, p 0,01 0,001. (B) Ekspression af radioresistance markører i radioresistente orale underlinjer. Western blotting for Cox-2, Bcl-2, Mcl-1 og survivin proteiner; β-Actin anvendes som lastning kontrol. Densitometrianalyse af western blots fra tre separate forsøg er vist nedenfor, bjælker repræsenterer middelværdi ± s.d. * Repræsenterer proteinekspression i forhold til forældrenes cellelinie, mens # repræsenterer proteinekspression sammenlignet mellem 50Gy-UPCI: SCC029B og 70Gy-UPCI:. SCC029B underlinjer (p 0,05)

RS undersøgelser i forbindelse med stråling fremkaldt biokemiske forandringer i prostata, lunge og brystcancercellelinier bestrålet med strålingsdoser mellem 15 og 50Gy rapporteres [37], [38]. Disse undersøgelser blev udført ved enkelte doser af stråling, der har til formål at undersøge

in vitro

stråling reaktion på menneskelige kræftceller. På den anden side, vi foretaget denne undersøgelse, at drage fordel af kontinuerlig lav dosis fraktioneret bestråling rutinemæssigt anvendes som standard strålebehandling protokol i klinikker til oral kræftbehandling. Vores mål var at udvikle

in vitro

radioresistance karakter i cellen linje over en periode og derefter undersøge muligheden for at Raman spektroskopi til at kategorisere den erhvervede træk fra sine forældre ubehandlede celler. Vi har etableret radioresistente mundtlige kræft underlinjer af mundslimhinden oprindelse ved klinisk implementerbar 2Gy fraktioneret stråledosis. Efter etablering af underlinjer, blev deres radioresistente karakter evalueret ved klonogen celleoverlevelse assay og Raman spektrale profiler blev opnået ved RS. Så vidt vi ved, er vi først til at rapportere nytten af ​​RS i erhvervede radioresistente mundtlige kræft underlinjer oprettet fra forældrenes oral cancer cellelinje ved klinisk administreret fraktioneret ioniserende stråling.

Materialer og metoder

etablering og karakterisering af radioresistente cellelinier

a) Cell kultur og etablering af radioresistente underlinjer med gammastråling behandling

UPCI:. SCC029B, menneskelig oral mundslimhinden carcinom cellelinje blev venligst stillet til rådighed af Dr. . Susanne M. Gollin, University of Pittsburgh, USA [39]. Celler blev holdt i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM, Gibco) suppleret med 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (FBS, Sigma-Aldrich) og antibiotika (100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin). Celler blev holdt ved 37 ° C i 5% CO

2 befugtet atmosfære.

(A) Cell morfologi analyse. Forældrekontrol UPCI: SCC029B celler, radioresistente 50Gy-UPCI: SCC029B og 70Gy-UPCI: SCC029B celler. Scale barer: 100 um. (B) Konfokal billeder af filamentøs-Actin farvet med Alexa Fluor-488 phalloidin blev celler modfarvet med DAPI. Scale bars: 20 uM. Pilen angiver filopodia som fine celleoverflade extensions. Analyse baseret på 50 celler pr befolkning med middelværdi og standardafvigelse af tre uafhængige forsøg, plottet til under højre side (p 0,01, 0,001)

For at generere radioresistente underlinjer, UPCI:. SCC029B celler (1 × 10

6 celler) blev podet i 100 mm dyrkningsplader (BD-Biosciences) indeholdende fuldstændige medier. Celler blev dyrket i standard tilstand og blev bestrålet med 2Gy af ioniserende stråling ved hjælp af

6 ° Co-γ Linear Accelerator (Bhabhatron-2, ACTREC, Tata Memorial Center) ved 60% sammenløb. Umiddelbart efter bestråling dyrkningsmediet blev fornyet, og celler blev anbragt i inkubatoren indtil de nåede 90% konfluens. Celler blev derefter trypsiniseret, talt og passage til nye dyrkningsplader. Cellerne blev behandlet igen med 2Gy af ioniserende stråling ved ca. 60% konfluens. Denne procedure blev gentaget 25 gange til generering af mellemliggende 50Gy-UPCI: SCC029B radioresistente sublinie og fortsatte videre op 35 gange over en periode på 5 til 6 måneder indtil generation af den endelige 70Gy-UPCI:. SCC029B radioresistente sublinie

( A) Parental UPCI: SCC029B cellelinje (b) 50Gy-UPCI: SCC029B delområde (C) 70Gy-UPCI:.. SCC029B delområde

b) Klonogen celle overlevelse assay

Kort , kendt antal af både de parentale og radioresistente celler UPCI: SCC029B blev udsået i 100 mm dyrkningsplader og holdt i CO

2 inkubator natten over for at overholde pladerne. Næste dag blev cellerne bestrålet med selv doser fra 2Gy til 8Gy og inkuberet ved 37 ° C i kolonidannelse. Efter 14 dage blev kolonier fikseret med absolut ethanol og farvet med 0,1% krystalviolet. Kolonier bestående af 50 eller flere celler blev talt som klonogene overlevende. Den procent plating effektivitet, D0 værdi (stråledosis, hvor 37% af befolkningen overlever), og overlevende fraktion ved en given strålingsdosis blev beregnet på grundlag af overlevelse af ikke-bestrålede celler som tidligere beskrevet [40]. blev udført tre uafhængige forsøg, hver gang i dubletter med forældrenes og radioresistente underlinjer og celle overlevelse kurve blev plottet efter beregning overlevende fraktion ved hver dosis. Endvidere blev Envejs ANOVA statistisk analyse udført for at finde den betydelige forskel i overlevelse ved forskellige doser af stråling

(A) 50Gy-UPCI: SCC029B delområde – forældrenes UPCI:. SCC029B cellelinje (B) 70Gy- UPCI: SCC029B delområde – forældrenes UPCI: SCC029B cellelinje (C) 50Gy-UPCI: SCC029B delområde -70Gy-UPCI: SCC029B delområde

(A) Masser af faktor 1, 2 og 3 (B. ) 3-D scatter plot for forældrenes UPCI: SCC029B cellelinie, radioresistente 50Gy-UPCI: SCC029B og 70Gy-UPCI:.. SCC029B underlinjer

c) Western blotting

Celler var lyseret i pattedyrcelle lysepuffer indeholdende 1% protease-inhibitor (Thermo Scientific, USA). Cellelysatet blev centrifugeret ved 13.000 rpm i 10 minutter ved 4 ° C og supernatanten indeholdende totale cellulære protein blev opsamlet. Proteinkoncentrationen blev kvantificeret ved kolorimetrisk assay [41]. Prøver indeholdende 40 ug totale proteiner blev adskilt ved 12% SDS-PAGE og overført til en PVDF-membran (PALL laboratorium, USA). Membranerne blev blokeret ved stuetemperatur i 1 time ved inkubering i TBS indeholdende 0,1% Tween (TBST, pH 7,4) og 5% (w /v) fedtfattig mælk. Efter blokering blev membranerne inkuberet med polyklonalt IgG humane anti-Mcl-1 (1:1000, sc-20679); Bcl-2 (1:500, sc-492), Survivin (1:1000, sc-10811), ged polyklonale IgG anti-Cox-2 (1:500, sc-1747) og husholdning kanin polyklonale IgG anti-p Actin (1:3000, sc-1616); (Santa Cruz Biotech., USA) natten over i blokerende buffer. Efter vask seks gange i TBST, blev membranerne inkuberet med et HRP-konjugeret anti-kanin IgG-antistof (1:2800) eller anti-gede-IgG-antistof (1:2500, Santa Cruz Biotechnology) i blokerende buffer i 1 time. Efter vask seks gange i TBST og to gange i TBS, binding primært antistof blev visualiseret ved forøget kemiluminescens-substrat-system (GE Healthcare, USA). Den vestlige blotting blev udført på tre uafhængige cellelysater af forældrenes, 50Gy og 70Gy celler. Den densitometri blev udført af Image J software (NIH, USA) mod β-Actin husholdning proteinekspression.

d) Morfologisk evaluering og F-actin farvning.

Morfologiske ændringer observeret under fraktioneret ioniserende stråling blev fotograferet ved hjælp af omvendt mikroskop (Axiovert-200M, Zeiss) kombineret med digitalkamera. Repræsentative billeder af forældrenes UPCI: SCC029B cellelinje, 50Gy-UPCI: SCC029B og 70Gy-UPCI: SCC029B underlinjer blev behandlet ved hjælp af Axiovision software (frigive 4,7, Carl Zeiss)

For trådformede Actin farvning, blev dyrket. på dækglas, fikseret med paraformaldehyd (4%) i 15 minutter og permeabiliseret i 0,7% Triton-X. En høj affinitet filamentøs Actin (F-actin) probe Alexa Fluor-488 phalloidin (Life Technologies, USA) blev fortyndet 1:20 (i 1X PBS) og inkuberet med celler på dækglas i 30 minutter ved stuetemperatur i mørke. Efter inkubation blev dækglassene vasket to gange med 1X PBS i 10 minutter. DAPI (1:20 fortyndet i 1X PBS) farvning blev udført i ca. 1 minut og dækglas blev derefter monteret i anti-quenching monterings middel (Vectashield, Vector Labs, USA) på et rent objektglas og undersøgt med LSM 510 Meta Carl Zeiss konfokal systemet (Carl Zeiss Micro Imaging GmbH, Tyskland). Hver af de forældre, 50Gy og 70Gy celler blev dyrket i dubletter på dækglas og tilfældige billeder til 50 celler blev erhvervet. På denne måde blev farvningen udføres tre gange selvstændigt og 50 celler blev analyseret hver gang fra alle de celle population typer for filopodia optælling.

Raman spektroskopi

a) Prøveforberedelse og spektral erhvervelse.

Parental UPCI: SCC029B, 50Gy-UPCI: SCC029B og 70Gy-UPCI: SCC029B celler blev dyrket i 100 mm dyrkningsplader. Eksponentielt voksende celler (3 x 10

6 celler) fra 6 uafhængige kulturer af hver af de parentale, 50Gy og 70Gy celler blev høstet og phosphatbuffer saltvand (PBS) vask blev givet til cellepellets før spektre optagelse. Ca. 7 spektre blev erhvervet fra hver cellepellet ved anvendelse fiberoptisk Raman mikrosonde som beskrevet tidligere [33]. Således i alt ~ 40 spektre pr gruppe blev erhvervet for hver af de forældre, 50Gy og 70Gy celler.

Som nævnt ovenfor, Raman-system anvendes til Undersøgelsen består af en diode laser (Process Instruments) af 785 nm bølgelængde som excitation kilde og en høj effektivitet (HE-785, Horiba-Jobin-Yvon, Frankrig) spektrograf kombineret med en CCD (Synapse, Horiba-Jobin-Yvon, Frankrig) som afsløring element. Optisk filtrering af uønsket støj, herunder Rayleigh signaler opnås gennem ‘Superhead’ den ekstra komponent i systemet. Super hoved kombineret med en 40 × mikroskopisk objektiv (Nikon, NA 0,65) blev anvendt til at levere laserlys samt at indsamle Raman signaler. Den spektrograf har ingen bevægelige dele med fast 950 gr /mm rist og spektral opløsning som pr producentens specifikationer er ~ 4 cm

-1. Anslået laser pletstørrelse på cellepelleten prøve var 5-10 um. Spectra blev integreret i 6 sekunder og gennemsnit over 3 ophobninger. Typisk laser effekt ved prøven var 40 + 0,05 mW.

b) Spectral forbehandling og dataanalyse.

Raman spektre blev forbehandlet ved at korrigere opladet par enhed (CCD) reaktion ved en nationale Institut for standarder og Teknologi (NIST) certificeret standard referencemateriale 2241 (SRM 2241) efterfulgt af subtraktion af baggrunden signaler fra optiske elementer og CaF

2 vindue. For at fjerne interferens af den langsomme bevægelige baggrund, første derivater af spektre – blev (Savitzky Golay metode), der anvendes til analyse af data [42], [43]. Så spektre blev interpoleret i 900-1800 cm

-1 rækkevidde og vektor normaliseret. Analyse af den forbehandlede spektre blev udført ved hjælp af PCA (principal komponent analyse) algoritmer implementeret i Matlab (Mathwork Inc.) baseret in-house software [44]. PCA er uovervåget overblik data værktøj, der anvendes til at se på de forskelle og ligheder blandt spektre. Denne metode afslører outliers, grupper og tendenser i dataene. Det beskriver data varians ved at identificere et nyt sæt af ortogonale funktioner, disse er kendt som masser af faktor eller hovedkomponenter (pc’er) (p 0,05). Hovedkomponenter er lineære kombinationer af de oprindelige data variabler. Da nærværende undersøgelse er en sonderende undersøgelse derfor vi har udført PCA analysemetode og også brugt denne metode i vores tidligere

in vitro

undersøgelser på cellelinjer [35], [36].

Mean og forskel spektre blev beregnet for forskellige cellepopulationer og blev anvendt til spektral sammenligning. De gennemsnitlige spektre blev beregnet fra baggrunden trækkes spektre før derivatisering ved at midle Y-akse variationer og holde X-aksen konstant for hver klasse. Baseline korrektion blev udført ved at montere en 5

th orden polynomium funktion. Disse basislinjekorrigerede spektre blev anvendt til spektrale sammenligninger på tværs af alle grupper. Forskel spektre blev genereret ved at fratrække de gennemsnitlige spektre af radioresistente celler (50Gy-UPCI: SCC029B 70Gy-UPCI: SCC029B) med forældrenes celler (UPCI: SCC029B) samt ved at fratrække spektre af 50Gy-UPCI: SCC029B fra 70Gy-UPCI :. SCC029B celler

Statistisk analyse

data blev statistisk analyseret ved En-vejs ANOVA og t-test, ved hjælp af Graph Pad Prism 5 software (version 5.01). En p-værdi mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Den statistiske analyse anvendt til Raman spektre forarbejdning er beskrevet under de respektive afsnit.

Resultater og Diskussion

a) Udvikling og validering af radioresistente underlinjer

De strålebehandling protokoller for kræft i mundhulen behandling består af en samlet 50Gy til 70Gy strålingsdosis vide lav dosis fraktioneret stråling af 2Gy. Derfor to radioresistente underlinjer dvs. 50Gy-UPCI: SCC029B og 70Gy-UPCI: blev SCC029B oprettet ved alt 25 og 35 fraktioner af 2Gy henholdsvis over en periode på 5-6 måneder. Den radioresistente karakter underlinjer blev påvist ved klonogenisk celleoverlevelse assay. Vi har observeret signifikant stigning i celleoverlevelse for begge de radioresistente underlinjer sammenlignet med dens parentale cellelinje ved klongenicitetsassayet [Fig-1 (A)]. D0 doser for forældrenes, 50Gy og 70Gy sublinie blev beregnet og fundet at være 4.5Gy, 5.1Gy og 5.6Gy hhv. En stigning i D0 værdi for radioresistente underlinjer fra sin parental cellelinje viser deres erhvervede radioresistance karakter. Vi bestemt også status af kendte radioresistente og anti-apoptotiske proteinmarkører som Bcl-2 (B-celle lymfom-2), Mcl-1 (myeloid celle leukæmi-1), Survivin Cox-2 (cyclooxygenase-2) ved western blotting. Som illustreret i Fig-1 (B) en stigning i niveauerne af disse proteiner blev observeret i radioresistente underlinjer (undtagen Mcl-1 i 50Gy-UPCI: SCC029B) sammenlignet med parentale cellelinje. MCL-1-niveauer i den mellemliggende 50Gy-UPCI: SCC029B sublinie var skønt sammenlignelige (densitometrianalyse, figur-1B, lavere) til at forældrenes cellelinie og blev fundet at blive yderligere markant opreguleres i radioresistente 70Gy: UPCI-SCC029B underlinie . Det er bemærkelsesværdigt, at Mcl-1 har kort halveringstid på grund af sin hurtige omsætning gennem ubiquitinering [45], og selv om Mcl-1 cellulære stabilitet mod forskellige stressfaktorer er blevet undersøgt, men lidt er kendt om dens reguleringsmekanisme på grund af strålebehandling. Vores resultat muligvis indebærer, at veje, herunder Bc-2, Survivin og Cox-2 kan bidrage til øget overlevelse for radioresistente celler på tidlige stadier af erhvervet radioresistance udvikling mens Mcl-1 kan have en rolle i senere tidspunkt. Som nævnt i klonogene celleoverlevelse assay 50Gy-UPCI: SCC029B celler erhvervet radioresistance karakter og højere niveauer af andre radioresistance relaterede proteiner i sammenligning med de parentale celler. Derfor udvikling af radioresistance er et komplekst fænomen, som ikke kan forbindes med en enkelt markør eller protein i cellen. Den betydelige stigning i ekspressionen af ​​disse markører bestyrker med tidligere rapporter, herunder dem fra vores laboratorium på deres tilknytning til radioresistance i orale planocellulært karcinom [13], [18] – [20], [46] – [47].

b) Morfologisk karakterisering af radioresistente underlinjer

Vi har observeret ændret morfologi af radioresistente underlinjer i forhold til sin parentale cellelinje. De 50Gy-UPCI: SCC029B celler udviste spindel formet morfologi mens 70Gy-UPCI: SCC029B celler viste sig at være mere aflange og uregelmæssig form [Fig-2 (A)]. Forstærkningen af ​​disse morfologiske træk i radioresistente underlinjer kunne antyde mod dens forvandlet egenskab i forbindelse med migration og invasion. Yderligere for at få et indblik i deres actin reorganisering; Vi har udført trådformede actin (F-Actin) farvning i forældrenes, 50Gy og 70Gy UPCI: SCC029B celler. F-actin-farvning viste signifikant stigning [Fig-2 (B)] i antallet af filopodia i 50Gy (p 0,01) og 70Gy-UPCI: SCC029B (p 0,001) celler i sammenligning med parentale UPCI: SCC029B celler. De morfologiske ændringer udstillet af radioresistente celler kan være en ekstra fænotype erhvervet på grund af den kontinuerlige fraktioneret strålebehandling.

c) Raman spektroskopi forældreansvar og radioresistente underlinjer

Den gennemsnitlige normaliserede spektre for forældrenes UPCI : SCC029B cellelinie, radioresistente 50Gy og 70Gy-UPCI: SCC029B underlinjer blev beregnet og afbildet i figur-3. Mean spektrum er blevet anvendt som et repræsentativt spektrum for de respektive cellelinier i den spektrale analyse. Som illustreret i fig-3 blev de spektrale træk domineret af båndene omkring 1008 (phenylalanin), 1270 (amid III), 1450 (δ CH

2) og 1660 (amid I) cm

-1 og kan tilskrives cellulære proteiner. Betragtninger, bånd ved 1310 (CH

3 /CH

2) vridning eller bøjning former for lipid), 1340 (ring struktur adenin) og 1378 cm

-1 (ring vejrtrækning former for nukleinsyre) tyder tilstedeværelse af cellulær nukleinsyre og lipider. De gennemsnitlige spektre for 50Gy-UPCI: SCC029B celler [Fig-3 (B)] viste flytte omkring 1310, 1450 og 1660 cm

1; mens en fremtrædende top blev observeret ved 1550 cm

-1 (tryptophan). Tilsvarende i gennemsnitlige spektre af radioresistente 70Gy-UPCI: SCC029B celler [Fig-3 (C)] intensitet relaterede variationer på 1270, 1310, 1340 og 1660 cm

-1 mens et skift ved 1450 cm

-1 WAS observeret. Således kan det konstateres, at generelle forskelle i form af ændringer i Raman-bånd og variationer intensitet blev observeret i den gennemsnitlige spektre af både 50Gy og 70Gy grupper

For at bringe ud spektrale forskelle blandt grupper.; differensspektrene blev beregnet ud fra gennemsnitlige spektre. Forskellen spektre giver en mere klar illustration for forskellene mellem grupperne. Som vist i figur-4, blev differensspektrene beregnet for 50Gy-UPCI: SCC029B og 70Gy-UPCI: SCC029B celler ved at trække dem fra parental UPCI: SCC029B celler [Fig-4 (A, B)] og mellem de to radioresistente celler [fig-4 (C)]. Forskellen spektrum (50Gy – forældrenes) udstillet positive toppe på 1008, 1340, 1378, 1450, 1550, 1664 cm

-1 og negative toppe ved 1240 og 1310 cm

-1; tyder ændringer i proteiner og nukleinsyrer, muligvis på grund af ændret celle signalering kaskader forårsaget af bestråling [48]. Den mærkbar ændring ved 1550 cm

-1 i 50Gy celler er tegn på frit tilgængelig tryptophan muligvis som et resultat af protein foldning /misfoldning af aktiverede chaperones skyldes stråling stress. Tilsvarende i differensspektret (70Gy – parental) positive toppe blev observeret ved 1340 og 1378 cm

-1 som er forbundet med DNA, hvorimod der ikke blev observeret negative top ved 1240, 1450 og 1650 cm

-1 associeret med protein ændring

som det fremgår af klonogene assay, både 50Gy-UPCI:. SCC029B og 70Gy-UPCI: SCC029B celler har erhvervet radioresistente karakter i forhold til forældrenes celler. Også, 70Gy celler er relativt mere radioresistente end 50Gy celler og udviser tydelig forskel spektre, hvilket kan skyldes forskellige egenskaber erhvervet af dem. Desuden (50Gy-70Gy) forskel spektrum viser positive toppe på 1008, 1450, 1550 og 1664 cm

-1 alle relateret til proteiner, mens der blev observeret DNA relateret negative top ved 1378 cm

-1. Tilstedeværelsen af ​​fremtrædende positive tryptophan top (1550cm

-1) i 50Gy radioresistente sublinie antydning i retning de berigede tryptophan dele, der kan have anti-oxidativ egenskab på grund af indolin gruppe, der tjener som hydrogengruppe donor [49]. Da kan ioniserende stråling inducerer reaktive oxygenarter (ROS) produktion, der kan forårsage endogen angreb på deoxyribosyl rygraden i DNA [50], [51]. For at modvirke effekten af ​​ROS, celler har adskillige antioxiderende faktorer, der kan scavenge ROS og beskytte mod stråling [52]. Den tydelige tryptophan peak rest i 50Gy radioresistente celler kan korrelere med sådanne faktorer der er rige på disse restkoncentrationer typer, som skærmer cellen mod oxidativ stress. Opregulering af disse faktorer er også blevet rapporteret i forbindelse med radioresistance [53] – [55]. Endvidere kan den optagne spektrum resultere i en gennemsnitlig og repræsentativt spektrum af den givne cellelinje, som afspejler en generel information af cellen status; fordi der i en cellepellet, tast-stråle møder en stak af celler og spredning kan forventes fra forskellige organeller såsom nucleus, mitokondrier og andre cellulære rum.

d) Multivariate Analysis

Som nævnt ovenfor , PCA blev brugt til at undersøge muligheden for klassificeringen blandt radioresistente 50Gy og 70Gy underlinjer fra forældrenes cellelinie. PCA anvendes ofte fremgangsmåde til datakomprimering og visualisering at observere mønster i dataene. Det er en matematisk analyse, hvorved trækkene i hele datasættet af tusindvis af punkter er løst ind i et par væsentlige egenvektorer, der kan udtrykke hele datasættet med deres scorer for hvert spektrum. Dette kan give tvingende fingerpeg om biokemiske variationer mellem forskellige grupper, i vores tilfælde forskellige klasser af makromolekyler. Endvidere kan profilerne af hovedkomponenterne også kendt som factor loadings give afgørende spor på biokemiske variationer mellem forskellige klasser. Lastning af faktorer 1, 2 og 3, der fører til afgrænsning mellem grupper er præsenteret i figur-5 (A). Opfylder spektral variabilitet som foreslået af forskel spektre; lastning plots viser også forskelle i DNA-indholdet, aminosyrer og protein profiler af forældrenes og radioresistente grupper. For visuel diskrimination, forventer vi hver af spektrene i den nydannede koordinere plads af udvalgte pc’er. Første tre signifikante diskriminerende pc’er blev udvalgt til tredimensionel visualisering af data. Tre klynger tilhører forældrenes UPCI: SCC029B celler og radioresistente 50Gy- UPCI: SCC029B, 70Gy-UPCI: SCC029B celler blev observeret [Fig-5 (B)]. Mens 50Gy-UPCI: SCC029B celler dannet en separat klynge men svag overlapning mellem klynger af 70Gy-UPCI: SCC029B og forældrenes celler blev observeret. Disse mønster klyngedannelse kan skyldes generelt anderledes biokemisk profil erhvervet af celletyper. Tager i betragtning, at PCA vil afsløre en generel ændring, herunder de forskellige cellulære profiler, betyder det, at radioresistente celler har erhvervet en ændret molekylær profil forskellig fra sine forældre celler med subtile variationer.

Konklusion

I det nuværende arbejde, har vi etableret radioresistente underlinjer fra forældrenes orale mundslimhinden cellelinje ved hjælp klinisk realitetsbehandling fraktioneret stråledosis. Den erhvervede resistente karakter blev bestemt ved standard klonogen celle overlevelse assay. Den 50Gy-UPCI: SCC029B og 70Gy-UPCI: SCC029B etableret radioresistente underlinjer viste sig at være mere radioresistente i forhold til sin forældrenes UPCI: SCC029B cellelinje. De underlinjer blev også karakteriseret ved at vurdere ekspression af radioresistance relateret proteinmarkører som Mcl-1, Bcl-2, Cox-2 og Survivin at støtte deres erhvervede radioresistente fænotype. Altered morfologiske træk blev observeret i disse langsigtede bestrålede celler, der var forskellige fra de parentale celler, herunder betydelig stigning i filopodia numre i 50Gy-UPCI: SCC029B celler og 70Gy-UPCI: SCC029B radioresistente celler. Endvidere blev Raman spektroskopi udført på disse radioresistente celler og parentale celler til at studere deres differential spektral profil. Denne undersøgelse er første af sin art med hensyn til nytten af ​​RS i karakterisering af erhvervede radioresistente underlinjer. Den observerede forskellen spektre mellem forældre- og begge radioresistente celler var majorly grund af ændringer i DNA, lipid og protein profil celler. Ændringer i DNA-indholdet i disse celler kan være på grund af talrige genetiske fornærmelser forekommer gennem flere fraktioner af stråling ved FIR og ændring i lipider kan være overvejende på grund af ændret morfologi af disse celler som vist ovenfor. Den multivariate analyse ved hjælp af PCA afslørede, at radioresistente 50Gy-UPCI: SCC029B og 70Gy-UPCI: kan SCC029B celler kategoriseres fra sine forældre UPCI: SCC029B celler. Tilsammen resultaterne af vores arbejde er ganske lovende og foreslå muligheden for RS som en potentiel ikke-invasiv værktøj til mundtlige kræftpatienter forudsige stråling respons gennem spektrale markører. Det kan forbedre patientens overlevelse satser i kraft af optisk diagnose at kategorisere dem i radiosensitive og resistente typer;