PLoS ONE: A Allele på rs13419896 af EPAS1 er forbundet med Enhanced Expression og dårlig prognose for ikke-småcellet Cancer

Abstrakt

Hypoxi-inducerbare faktor-2α (HIF-2α, eller EPAS1) er vigtig for udviklingen af ​​kræft, og er en formodet biomarkør for dårlig prognose for ikke-småcellet lungekræft (NSCLC). Men molekylære mekanismer bag den EPAS1 overekspression er ikke endnu helt forstået. Vi udforskede en rolle i en enkelt (SNP), rs13419896 placeret inden intron 1 i

EPAS1

gen i reguleringen af ​​sit udtryk. Bioinformatik analyser foreslået, at en region, herunder rs13419896 SNP spiller en rolle i reguleringen af ​​

EPAS1

genekspression og SNP ændrer bindende aktivitet transkriptionsfaktorer.

In vitro

analyser viste, at et fragment indeholdende SNP locus funktion som en regulerende region, og at et fragment med

A

allel udviste højere transaktiveringsaktivitet end en med

G

, især i nærvær af overudtrykt c-Fos eller c-jun. Desuden NSCLC patienter med

A

allel viste dårligere prognose end dem med

G dele på SNP selv efter justering med forskellige variabler. Som konklusion kan den genetiske polymorfisme af

EPAS1

gen føre til variation af dens genekspressionsniveauer at drive progression af canceren og tjene som en prognostisk markør for NSCLC

Henvisning:. Putra AC , Eguchi H, Lee KL, Yamane Y, Gustine E, Isobe T, et al. (2015)

A

Allel på rs13419896 af

EPAS1

er associeret med forøget ekspression og dårlig prognose for ikke-småcellet lungekræft. PLoS ONE 10 (8): e0134496. doi: 10,1371 /journal.pone.0134496

Redaktør: Tiffany Seagroves, University of Tennessee Health Science Center, UNITED STATES

Modtaget: April 2, 2015; Accepteret: 9 juli 2015; Udgivet: 11 August, 2015

Copyright: © 2015 Putra et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist støttet af Grant-in-Støtte til videnskabelig forskning (C) (nr 23.592.766) fra Japan Society for fremme af Science (JSP’er ), Tilskud-i-Aid for Videnskabelig Forskning om “innovative områder (nr 221S0001)” fra japanske ministerium for uddannelse, kultur, sport, videnskab og teknologi, og det strategiske Research Foundation Grant-støttede projekt for private universiteter, MEXT. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Hypoxi-inducerbare faktorer (HIFs) er heterodimere transkriptionsfaktorer, der er medlemmer af Per-Arnt-Sim (PAS) familie. De aktiveres af en række signaler input herunder hypoxi, næringsstofudsultning, inflammation, onkogene signaler, mekanisk belastning, og i nogle tilfælde, interne genetiske polymorfier [1-4]. De HIF transkriptionsfaktorer består af alfa-subunits (HIF-1a, HIF-2a, HIF-3α), der er reguleret af ovennævnte signaler, mens beta underenheder kendt som aryl hydrocarbon receptor nukleare translokatoren (Arnt) er konstitutivt udtrykt og stimulere transskription af mere end hundrede target gener relateret til patofysiologiske respons [5, 6]. Blandt alfa-underenheder, har HIF-1α og HIF-2α blevet grundigt undersøgt. Selv medlemmer af alfa subunits deler ligheder i deres struktur, funktion og regulering

in vitro

, deres roller

in vivo

er uensartet under udviklingen og tumorigenese [3, 5, 7].

Den menneskelige HIF-2α gen kaldet endotel PAS domænenavn protein 1 (

EPAS1

), indeholder 16 exons og spænder 90 kb på 2p21-P16. Ekspression af human HIF-2α er blevet identificeret i lunge, carotis organer, endotelceller gliaceller, cardiomyocytter, renale fibroblaster og hepatocytter, hvor det spiller en vigtig rolle i reguleringen af ​​oxygen fysiologi [3, 8]. Dette er særlig vigtigt i lungen, da den udgør sitet for oxygen udveksling og giver luft-væske-grænsefladen til dette formål. HIF-2a proteiner udtrykkes i type II pneumocytter og pulmonale endotelceller som respons på hypoxi samt i epitel og mesenchymale strukturer, der giver anledning til det vaskulære endotel [9, 10]. Endvidere blev høje niveauer af HIF-2α ekspression forbundet med øget tumorstørrelse, invasion og angiogenese i murine modeller af lungecancer [11,12]. Forbedret ekspression af HIF-2α protein i ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) væv blev rapporteret at være en betydelig maker for dårlig prognose [13-15].

For nylig er det blevet rapporteret, at flere enkelt nukleotid polymorfier (SNPs) af

EPAS1

er forbundet med udviklingen af ​​slidgigt [16], præmatur retinopati [17], maksimal metaboliske præstation i elite udholdenhedsatleter [18], fysiologisk tilpasning i stor højde populationer [19- 22], og modtageligheden i retning renalcellecarcinom (RCC) og prostatacancer [23, 24]. Men virkningerne af disse SNPs på ekspressionsniveauer af

EPAS1

er næppe forstået.

Blandt disse SNPs, vi fokuseret på Hap-tag SNPs i

EPAS1

gen der kan bidrage til tilpasningen til højtliggende hypoxi i sherpaer [22], overvejer lunge som målorgan. Bioinformatiske analyser fik os til at undersøge, hvilken rolle rs13419896 SNP i regulering af

EPAS1

genekspression og en forening med prognosen for NSCLC.

Materialer og metoder

Bioinformatik analyser

Vi forhørt transkriptionsfaktor kromatin immunofældning (chip-seq) datasæt fra Encyclopedia of DNA Elements (KODE) konsortium hjælp University of California, Santa Cruz (UCSC) Genome Browser (https://genome.ucsc.edu /KODE /) for at finde ud kandidat transkriptionsfaktorer, der kan binde på eller i umiddelbar nærhed af rs13419896 SNP-stedet. Allelspecifik overvågning af transkriptionsfaktorer bundet til fragmentet indeholdende rs13419896 SNP blev udført under anvendelse Jaspar CORE Vertebrata, en åben adgang til databasen af ​​matrix-baseret nucleotid profiler, der beskriver den bindende præference transkriptionsfaktorer [25].

DNA-ekstraktion og genotypebestemmelse analyse

Genomisk DNA blev isoleret fra perifere blodprøver eller frosne ikke-kræft lungevæv som tidligere beskrevet [26, 27]. Det følgende primer sæt blev anvendt til at amplificere et fragment indbefattende SNP fokus i

EPAS1

intron1; Fremad: 5′-CCTAATGAGCCTCTGGGAAAGTGC-3 ‘og Reverse: 5′-CAATGGTGCCTCCTACCCTGTG-3’. PCR-reaktionsbetingelserne var 40 cykler denaturering ved 95 ° C i 30 sek, annealing ved 63 ° C i 30 sekunder og forlængelse ved 72 ° C i 30 sek. Sekventering af PCR-produkter blev udført under anvendelse af BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit og ABI PRISM 310 Genetic Analyzer automatiseret sekventering systemet (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).

cellelinier og cellekultur

Fireogtyve humane cancercellelinier bestående af kun hepatomaceller HepG2, orale pladecellecarcinom linjer HSC-2, HSC-3, HSC-4, KB og KOSC2, brystcancere MCF-7, MDA-MB-231, MDA -MB-435s, MDA-MB-453, MDA-MB-468, BT-20, BT-474, SK-BR-3, T-47D, og ​​ZR-75-1 og lungekræft cellelinier A549, PC- 6, PC-9, PC14, RERF-LC-Ad-1, RERF-LC-Ad-2, RERF-LC-KJ, og LC-S blev opnået fra ATCC (Manassas, VA) eller JCRB (Osaka, Japan) mellem 2001 og 2007, og opretholdt i RPMI1640 eller Dulbeccos modificerede Eagles minimale essentielle medium (DMEM) (Nacalai Tesque, Inc., Kyoto, Japan) indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS; BioWhittaker, Verviers, Belgien) som tidligere beskrevet [28 -30].

EPAS1

status af cellerne blev bestemt ved sekvensanalyse som beskrevet ovenfor.

RNA-fremstilling og RT-PCR

Totalt RNA blev fremstillet ud fra frosne cellepellets ved anvendelse af Qiagen RNeasy mini kit (QIAGEN, Inc., Valencia, CA) ifølge producentens instruktioner. To mikrogram totalt RNA ekstraheret fra hver cellelinje blev revers-transkriberet under anvendelse af High-Capacity cDNA Archive Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA). En 1/200 fortynding af cDNA blev udsat for real-time RT-PCR ved hjælp TaqMan Gene Expression Analyser (Applied Biosystems) for

EPAS1

og Pre-Udviklet TaqMan assayreagenserne (Applied Biosystems) for

ACTB

som husholdning kontrol. Tre uafhængige målinger blev taget og gennemsnit med relative genekspression niveauer beregnet som nøgletal end

ACTB

udtryk for hver cellelinie.

immunoblotanalyse

For at analysere proteinekspression, hel celle ekstrakter blev fremstillet ud fra dyrkede celler med eller uden hypoksisk behandling som tidligere beskrevet [30]. Halvtreds ug protein blev blottet på nitrocellulosefiltre efter SDS-polyacrylamid gelelektroforese. Anti-EPAS1 (HIF-2α) (Cell Signaling Technology Japan, Tokyo) eller anti-β-actin (Sigma) blev anvendt som primære antistoffer fortyndet som 1: 500 eller 1: 5000. Anti-kanin IgG eller anti-muse-Ig-peberrodsperoxidase-konjugat (Amersham Life Science) blev anvendt som et sekundært antistof fortyndet som 1: 2000 eller 1: 5000. Immunkomplekser blev visualiseret ved hjælp af den forbedrede kemiluminiscens reagens ECL Plus (Amersham Life Science).

Plasmidkonstruktion og luciferase reporter eksperimenter

Annealede oligonukleotidfragmenter der indeholder

EPAS1

SNP locus rs13419896 ( 5′-GGTACCAGTGTCTGAAAGTGAAGCGCTAGGATTGGTTACTGACGGTACC-3 ‘eller 5′-GGTACCAGTGTCTGAAAGTGAAGCACTAGGATTGGTTACTGACGGTACC-3’) blev subklonet ind i

Kpnl

i-stedet i pGL4.26 (Promega, Madison, WI) med en minimal promotor driver ildflueluciferase reporter. C /EBP-β eller c-myc cDNA blev amplificeret fra totalt RNA af MCF-7 eller HSC2 celler ved RT-PCR og subklonet ind pRc /CMV (Invitrogen, Carlsbad, CA) eller pcDNA 3.1 /V5-His-TOPO (Invitrogen ). Konstruktioner blev bekræftet ved sekvensanalyse og betegnet som pGL4.26-EPAS1_G, pGL4.26-EPAS1_A, pCMV-C /EBP-β, eller pcDNA-c-myc, hhv. Rotte c-Jun drevet af den humane β-actin-promotor (c-Jun /β-actin) og humane c-fos ekspressionsvektorer blev generøst leveret af Dr. Masaharu Sakai (Hokkaido Universitet) [31]. Forbigående transfektioner blev udført, hvor hvert pGL4.26-EPAS1 reporterkonstruktion (0,2 ug /15 mm brønd) med Renilla luciferase co-transfektion kontrol (pRL-SV40, 100 pg /15 mm brønd) (Promega) blev blandet med 0,4 pi Trans-IT LT1 Transfektion Reagent (Takara, Japan) og sættes til mediet. I samarbejde transfektionsforsøg, 0,4 ug pRc /CMV, c-Jun /β-actin, c-FOS, pcDNA-c-myc eller pCMV-C /EBP-β blandedes med EPAS1 reportere som ovenfor. Celler blev inkuberet med blandingen i 24 timer forud for kvantificering af luciferase reporter aktivitet på enkelt-prøven Mini Lumat LB 9505 luminometer (Berthold Technologies GmbH 43 adenocarcinomer (AD), 29 planocellulært karcinom (SCC) og 4 adeno- pladecellecarcinomer (ADSCC). Fordeling af patienter de lungekræftpatienter etapevis (31 patienter var i fase I, 7 ved II, 25 ved III og 13 ved IV) er godt tilpasset til et bredt udsnit af den japanske lungekræft befolkning.

Statistisk analyse

De primære resultater i denne undersøgelse var lungekræft dødelighed og risiko for død. Overlevelsestiden blev beregnet som tiden fra primær kirurgi til dødsfald på grund af lungekræft, censurerer på datoen for sidste kontakt eller ikke-cancer død. Chi-offentlig Fishers eksakte test blev anvendt til at undersøge fordelinger af variabler. Forskelle i overlevelse blev undersøgt ved hjælp af log-rank test. Cox proportional hazard model blev anvendt til at estimere den relative risiko for intervaller død og 95% sikkerhedsgrænser (CI). Statistiske analyser blev udført under anvendelse af en statistisk programpakke JMP-version 10.0.2 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA), andet er angivet. Udvidet Fishers eksakte test blev udført ved hjælp af “R”: (. R Core Team, 2013. R Foundation for Statistisk Computing, Wien, Østrig URL https://www.R-project.org/) et sprog og miljø til statistisk databehandling med en pakke “mønt”. Hardy-Weinberg ligevægt blev undersøgt for at sammenligne de observerede og forventede genotypefrekvenser bruger Chi-square test. Statistisk signifikans af reporter eksperimenter og genekspression analyser blev analyseret ved hjælp af statistiske software JMP-version 10.0.2 og StatView-version 5.0 software (SAS Institute Inc.).

Resultater

Database overvågning af SNPs på

EPAS1

i forhold til sin genekspression

Blandt de 3 Hap-tag SNPs (rs13419896, rs4953354, og rs4953388), der blev impliceret at bidrage til tilpasningen til højtliggende hypoxi i sherpaer [22 ], fandt vi bindingssteder og bindende aktiviteter for C /EBP-β, AP-1 eller MYC-familien af ​​transkriptionsfaktorer i en række cancer celletyper i området ved

EPAS1

rs13419896 locus inden intron 1 af genet ved overvågning af chip-seq datasæt fra KODE (S1 fig). Interessant nok, når de analyseres sekvenserne ved hjælp Jaspar Core Vertebrata, fandt vi, at relative scores, indeks for sandsynligheden for transskriptionsfaktorbindende, C /EBP-β og AP-1 blev berørt af rs13419896 SNP blandt de 3 transkriptionsfaktorer som nævnt ovenfor ; C /EBP-β og AP-1 viste meget højere score på 0,842 og 0,855 i sekvensen med

A

allel ved rs13419896 henholdsvis end dem med

G

allel (0,734 og 0,744) . Disse data fik os til at undersøge, hvilken rolle rs13419896 i regulering af

EPAS1

genekspression.

Den rs13419896 SNP ændret reportergenet aktiviteter

For at teste muligt funktionelt forskelle forårsaget af rs13419896 locus, vi næste forberedt luciferase reporter-konstruktioner, der huser

EPAS1

fragment der omfatter rs13419896 locus foran den minimale promotor (fig 1A) og udføres transient transfektion analyser i A549, PC-9 og HSC -2 cancer cellelinjer. Konstruktionerne med fragmenter indeholdende rs13419896 locus viste forøget reporter aktiviteter i forhold til den oprindelige reporter pGL4.26 i alle cellelinjer testes, uanset genotype af SNP, hvilket antyder, at denne korte sekvens i intron 1 af

EPAS1

funktion som transkriptionsenhancer element (

P

0,05, figur 1B-1D). Interessant, reporter konstruktion indeholdende fragmentet med

A

allel af rs13419896 (pGL4.26-EPAS1-A) viste signifikant højere aktivitet end en med

G

allel (pGL4.26- EPAS1-G) i alle de testede cellelinier (

P

0,01,

P

0,05 som vist i fig 1B-1D), hvilket antyder, at enhancer aktiviteten af ​​dette regulatoriske element påvirkes af genotypen af ​​rs13419896 SNP.

(A) Skematisk repræsentation af luciferase reporter-konstruktioner med forskellige

EPAS1

SNP alleler som vist. Korte fragmenter indeholdende

EPAS1

SNP locus (rs13419896) blev subklonet i pGL4.26 minimale promotor luciferasereporterplasmid. (B-D) Søjlediagrammer viser luciferase reporter aktivitet efter transiente transfektionsforsøg i A549 (B), PC9 (C), og HSC-2 (d) celler. Luciferaseaktivitet reporter-aktivitet blev beregnet som et forhold til Renilla luciferaseaktivitet genereret af pRL-SV40 co-transfektion kontrol. Hver værdi repræsenterer middelværdien + standardafvigelse (SD) i mindst tre uafhængige forsøg.

P

-værdier blev beregnet ved hjælp af Students

t

-test med *:

P

0,05, **:

P

0,01 og ***:

P

0,0001.

Siden rs13419896 SNP var impliceret at ændre bindingsaffiniteter af AP-1 og C /EBP-β af førnævnte bioinformatik analyse, vi næste udførte co-transfektionsforsøg i A549 celler til at evaluere virkninger af overekspression AP-1, c-myc, eller c /EBP-Ø transkriptionsfaktorer på reporter aktiviteter. Overraskende tvungen ekspression af c-Jun eller c-fos, komponenter af transkriptionsfaktoren AP-1, signifikant øget reporter aktiviteten af ​​kun pGL4.26-EPAS1-A med undtagelse af den pGL4.26-EPAS1-G (Fig 2A og 2B). På den anden side, C /EBP-β forøgede transskriptionelle aktivitet af begge reporter-konstruktioner med tilsvarende amplitude, mens c-myc ikke viste signifikante ændringer i aktiviteten af ​​begge konstruktioner.

(A og B ) for at vurdere virkningerne af overekspression AP-1 (c-Jun og c-fos), MYC, eller C /EBP-p transkriptionsfaktorer på rs13419896 SNP luciferase reporter-aktivitet, blev udført co-transfektionsforsøg i A549 lungeadenokarcinom celler. Søjlediagrammer viser luciferase reporter aktivitet pGL4.26-EPAS1-G (A) eller pGL4.26-EPAS1-A (B). Luciferaseaktivitet reporter-aktivitet blev beregnet som et forhold til Renilla luciferaseaktivitet genereret af pRL-SV40 co-transfektion kontrol. Hver værdi repræsenterer middelværdien + standardafvigelse (SD) i mindst tre uafhængige forsøg.

P

-værdier blev beregnet ved hjælp af Dunnetts test med ***:

P

0,0001.

Sammenligning af ekspressionsniveauer af

EPAS1

mRNA og protein i cancer cellelinjer af rs13419896 SNP

For at explorer virkninger af rs13419896 SNP på endogene genekspressionsniveauer i

EPAS1

, vi genotypebestemt SNP og evaluerede niveauer af genekspression i forskellige cancercellelinier. Når cellerne blev delt i to grupper ved tilstedeværelsen eller fraværet af

A

allelen ved rs13419896 locus, cancerceller med

A

allel af rs13419896 demonstrerede signifikant højere

EPAS1

genekspression niveauer end for nogen andre uden

A

allel (

P

= 0,022, Welch s

t

test) (figur 3A). Vi analyserede yderligere niveauer af EPAS1 (HIF-2α) proteinekspression i adskillige lungekræft cellelinier ved immunblotting analyser. Som resultat blev EPAS1 proteiner påvist i PC9 og LC-KJ med

A

allels selv under normoksiske forhold og var naturligvis steget i nogle af hypoxiske cancerceller, A549, PC9, LC-KJ, og LC-S (fig 3B)

(A)

EPAS1

genekspressionsniveauer vurderet af real-time RT-PCR blev sammenlignet mellem kræftcellernes grupper efter rs13419896 status.; en med

A

allel på SNP stedet (med

A

allel) og andre uden (w /o

A

allel). Ekspressionsniveauerne af

EPAS1

i hver cellelinje blev beregnet som et forhold til den for

ACTB

og hver værdi repræsenterer middelværdien for mindst tre uafhængige forsøg (åben cirkel). Hver søjle angiver gennemsnit af ekspressionsniveauet i hver gruppe.

P

-værdier blev beregnet ved hjælp af Welch s

t

test med *:

P

= 0,022. (B) De EPAS1 protein Ekspressionsniveauerne blev sammenlignet mellem genotyper som ovenfor. Adskillige lungekræft cellelinier blev inkuberet under normoxiske (21% pO

2) eller hypoxiske (1% pO

2) i 24 timer. Helcelleekstrakter fremstillet ud fra hver cellelinje blev udsat i immunoblotting-analyse under anvendelse af anti-EPAS1 (HIF-2α) eller anti-β-actin som en kontrol.

A allel af rs13419896 SNP af

EPAS1

var forbundet med dårlig samlet overlevelse af ikke-småcellet lungekræft patienter

Siden rs13419896 SNP blev foreslået at forbinde med forbedret udtryk for

EPAS1

gen, vi derefter udforskes muligt sammenslutninger af SNP med klinisk-patologiske faktorer af japanske NSCLC patienter. Genotyper af den rs13419896 SNP blev bestemt i 76 NSCLC patienter, og fundet at være i god overensstemmelse med Hardy-Weinberg ligevægt (

P

= 0,45, Chi-square test, tabel 2). Ingen signifikant forskel blev fundet blandt genotypefrekvenser mellem japanske NSCLC prøver i denne undersøgelse, og den sunde japanske befolkning HapMap projektet (

P

= 0,94, udvidet Fishers eksakte test, tabel 2). Vi derefter undersøgt forholdet mellem

EPAS1

SNPs og forskellige klinisk-patologiske egenskaber (tabel 3). Hyppigheden af ​​mindre allel af rs13419896 tendens til at være højere hos kvinder end hos mænd: En frekvens af patienter, der har mindst én

A

allel af rs13419896 (

A

/

A

eller

A

/

G

genotype) var 70,0% (14 af 20) hos kvinder og 44,6% (25 af 56) hos mænd, selv om dette ikke var statistisk signifikant (

P

= 0,07, Fishers eksakte test). Desuden distribution af differentiering tendens til at afvige med SNP med en marginal betydning (

P

= 0,06, forlænget Fishers eksakte test). Andre end køn og differentiering, har vi ikke finde nogen statistiske sammenslutninger af SNP med klinisk-patologiske karakteristika, herunder alder, histologi, tumorstørrelse, og scene.

Vi derefter vurderet association af rs13419896 SNP med samlet overlevelse for NSCLC. Den mediane overlevelsestid af patienter med mindst én

A

allel af rs13419896 (

A

/

A

eller

A

/

G

) var signifikant kortere end med

G-service /

G

homozygot (28,0 måneder vs 52,5 måneder,

P

= 0,047, log-rank test, fig 4). Sammenlignet kumulative overlevelsesrater ved 12, 24 og 48 måneder, patienter med

G /G

homozygot viste langt højere end dem med

A /G

eller

A /A

genotype på 12 og 48 måneder (

P

= 0,009 og 0,004 henholdsvis) (S1 tabel). En multivariat analyse af de 74 NSCLC-patienter (2 patienter blev udelukket på grund af manglen på tumorstørrelse data) ved hjælp af en Cox proportional hazard model viste, at besiddelse af

A

allel (

A /G

eller

A /A

genotype) af rs13419896, sammen med den kliniske fase, var en uafhængig variabel for risikovurdering af den samlede overlevelse for NSCLC patienter [hazard ratio (HR) = 2,31, 95% CI = 1,14-4,81 ,

P

= 0,021], efter justering for alder, køn, scene, histologi, tumorstørrelse, og differentiering.

Kaplan-Meier overlevelse plots stratificeret efter genotyper af rs13419896 vises. Forskel i samlet overlevelse på tværs genotypiske grupper af NSCLC patienter blev undersøgt ved hjælp af log-rank test med

P

-værdier som angivet.

Diskussion

For nylig, flere SNP’er af

EPAS1

har vist sig at korrelere med udviklingen af ​​forskellige sygdomme som slidgigt [16], præmatur retinopati [17], maksimal metaboliske effekt i elite udholdenhedsatleter [18], fysiologisk tilpasning i stor højde befolkning [19-22] og modtagelighed over for nyrecellecancer (RCC) og prostatacancer [23, 24]. Men en mekanistisk forbindelse mellem disse SNP’er og genekspressionsniveauer i

EPAS1

har været meget lidt kendt, bortset fra rs17039192 beliggende i 5′-utranslaterede region, der gav ændrede promotoraktiviteter i reportergenassay i chondrogen celler [16].

i denne undersøgelse bioinformatiske analyser fik os til at teste en rolle for en af ​​Hap-tag SNPs, rs13419896 beliggende inden intron1 af genet, i regulering af

EPAS1 Salg udtryk. Faktisk fandt vi, at et fragment i intron 1 af

EPAS1

indeholder transskriptionelle regulatoriske elementer og nukleotidforskel på rs13419896 locus kan funktionelt påvirke enhancer aktiviteter i cancercellelinier. Interessant yderligere co-transfektionsforsøg kraftigt indikerede, at AP-1 transskription faktor kan være involveret i den differentierede transkriptionelle aktiviteter mellem rs13419896 alleler. Den observerede specifikke transaktivering af udefra kommende AP-1 komponenter kun konstruktioner med

A

allel ved rs13419896 aftalt godt med højere relativ score for AP-1 med

A

allel på SNP som vist ved Jaspar Core Vertebrata analyse. Tidligere overekspression af c-Jun og c-Fos-proteiner blev observeret i 31-50 og 60% af henholdsvis NSCLC væv [34, 35]. Den overudtrykte c-Jun eller c-Fos kan transaktivere

EPAS1

genekspression

via

, i det mindste delvist, et enhancerelement inden intron 1 af genet i en allel-specifik måde ved den rs13419896 locus. Dette blev også støttet af observationen af ​​gen og protein ekspressionsniveauer af

EPAS1

ved rs13419896 SNP i forskellige kræftceller. Selvom vi ikke helt bekræfte genotyper (herunder allel tab, forstærkning, eller mutationer) af de testede cancer cellelinjer, fandt vi, at cellerne med

A

allel ved rs13419896 af

EPAS1

viste signifikant højere

EPAS1

gen og protein udtryk niveauer sammenlignet med dem, der mangler

A

allel uanset forskelle i genetisk baggrund. Tilsammen disse data, er det kraftigt antydet, at den

A

allel ved rs13419896 SNP af

EPAS1

spiller en vigtig rolle i forbindelse med ombygning af binding affinitet AP-1, hvilket resulterer i differentierede udtryk af EPAS1 i NSCLC væv.

den observerede association af

A

allel af rs13419896 SNP med øgede ekspressionsniveauer af EPAS1 inspireret os til yderligere at undersøge den mulige rolle af SNP i prognose af Japansk NSCLC-patienter, da overekspression af EPAS1 blev rapporteret at være associeret med en dårlig prognose. Vi viste for første gang, at rs13419896 locus var en uafhængig variabel for risikovurdering af den samlede overlevelse af NSCLC.

I human NSCLC blev overekspression af HIF-2α (EPAS1) konsekvent forbundet med histologi som SCC bliver dominerende , forøget tumorstørrelse og angiogenese, resulterer i dårligere prognose og nedsat overlevelsesrater [13, 14]. I vores undersøgelse fandt vi ikke nogen forening af rs13419896 SNP med histologi og tumorstørrelse. På den anden side, hazard ratio for besiddelse af

A

allel over

G

allel i Cox ‘hazard model var 2,31, der er sammenlignelig med forholdet mellem høj ekspression af HIF-2α opnået tidligere (2,01 og 1,71) [13, 14]. Seneste metaanalyse undersøge samlet overlevelse ved overekspression af HIF-2α protein også demonstreret HR på 2,02 (95% CI: 1,47-2,77) [36]. I betragtning af disse, kan rs13419896 SNP være en af ​​de vigtige faktorer, der bidrager til overekspression af HIF-2α i NSCLC væv og således være en nyttig prognostisk markør for NSCLC. Vi observerede en statistisk signifikant forskel på kumulativ overlevelse mellem patienter med

A

allel og uden på 12 måneder efter operation (S1 tabel). Hvis vores observation bekræftes af andre kohorter i fremtiden, kan genotypning af SNP blive klinisk vigtige for behandlingen patienternes pleje og rådgivning med det samme. Udover NSCLC, blev også rapporteret andre kræftformer såsom kolorektal og hoved og hals kræft at vise en dårlig prognose med overekspression af HIF-2α i meta-analyser [37, 38]. Da kan observeres overekspression af AP-1-bestanddele for disse kræftformer [39, 40], kan rs13419896 SNP bidrage til overekspression af HIF-2α og være en nyttig prognostisk markør i forskellige cancerformer.

Det kan konkluderes, fandt vi her for første gang, at nukleotid forskel på rs13419896 SNP kan påvirke

EPAS1

gen og protein udtryk, specifikt i respons på AP-1, og at

A

allel af

EPAS1

SNP er forbundet med dårligere prognose for patienter med lungecancer. At etablere

EPAS1

SNP som et nyttigt klinisk prognostisk markør og for yderligere at afklare deres molekylære mekanismer, større skala klinisk-patologiske undersøgelser af lungekræft og /eller andre former for kræft vil give yderligere indsigt i disse aspekter.

Støtte Information

S1 fig. UCSC Genome Browser repræsentation af INDKODNING Consortium chip-Seq data for transskriptionsfaktorbindende oven på menneskelige genom build hg19.

Top paneler viser genomisk struktur af

EPAS1

gen indsamlet fra UCSC, RefSeq og GenBank med tykke stænger indikerer exoniske kodende sekvenser, tynde stænger, der viser ikke-kodende exon regioner (5 ‘og 3′ UTR’er) og pile betegner introner med 5 ’til 3′ retningsbestemmelse. Den vandrette akse viser genom position i bp i intervallet fra CHR2: 46,514,938-46,626,784. Placeringen af ​​rs13419896 SNP er angivet i rødt og dens relative position ekstrapoleres på tværs af alle datasæt som en brudt blå linje. Chip-Seq data er vist i samme genom placering med den lodrette akse viser ChIP berigelse transskriptionsfaktorbindende for CEBPB (sort), MYC (rød), FOS (grøn), jun (blå), JunB (violet) og JUND ( orange) i de angivne cellelinjer. Scale bar indikerer genomisk afstand af 50 kb

doi:. 10,1371 /journal.pone.0134496.s001

(PDF)

S1 tabel. Sammenligninger af kumulative overlevelsesrater mellem patienter med genotyper

G-service /

G

og

A

/

G

eller

A

/

A

.

doi:10.1371/journal.pone.0134496.s002

(DOCX)

Acknowledgments

The Forfatterne takker Prof. N. Kohno, emeritus professor K. Inai (Hiroshima University), professor F. Yunus og Dr. E. Syahruddin (University of Indonesien) for deres venlige støtte og opmuntring. Vi takker også Ms. C. Oda for hendes teknisk bistand. En del af dette arbejde blev udført på Analysis Center of Life Science, Hiroshima Universitet.