PLoS ONE: in vivo-aktivitet og farmakokinetik af Nemorosone på kræft i bugspytkirtlen Xenografts

Abstrakt

Kræft i bugspytkirtlen er en af ​​de førende kræftrelaterede dødsårsager i den vestlige verden med et akut behov for nye behandlingsstrategier. For nylig er hyperforin og nemorosone blevet beskrevet som lovende anti-cancer blyforbindelser. Mens hyperforin er blevet grundigt undersøgt

in vitro

in vivo

,

in vivo

data for nemorosone mangler stadig. Således har vi undersøgte væksthæmmende potentiale nemorosone på bugspytkirtelkræft implanteret i NMRI nu /nu mus og bestemmes grundlæggende farmakokinetiske parametre. Xenotransplantattumorer blev behandlet med nemorosone og gemcitabin, den nuværende standard for pleje. Tumorsnit blev underkastet H Accepteret: August 2, 2013; Udgivet: September 5, 2013 |

Copyright: © 2013 Wolf et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af en 3-årig forskning stipendium fra Helmholtz International Graduate School for Cancer Research til FH. Finansiering fra det tyske ministerium for uddannelse og forskning som en del af NGFN PaCaNet konsortiet taknemmeligt anerkendt. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

på trods af mange fremskridt inden for kræftforskning og behandling, bugspytkirtelkræft er stadig en af ​​de mest udfordrende tumorer, med dens dødelighed næsten matcher incidensraten [1]. Dette er primært på grund af vanskeligheder med at diagnosticere kræft i bugspytkirtlen i et tidligt resektabel stadie og dens udtalte kemo-modstand. Således mere end 80% af patienterne til stede med et fremskredent tumor allerede metastaseret til regionale lymfeknuder og leveren [2]. Gemcitabin, den nuværende standard for pleje af kræft i bugspytkirtlen, kun moderat forbedrer median overlevelse på mellem 5 og 6 måneder [3], hvilket understreger behovet for at udforske nye terapeutiske forbindelser.

polycykliske polyprenylated acylphloroglucinols (PPAPs) er en klasse af forbindelser med forskellige biologiske aktiviteter lige fra antidepressiv, anti-cancer og anti-inflammatorisk anti-mikrobiel aktivitet [4]. Blandt dem, hyperforin (figur 1), et middel fra perikon (

Hypericum

perforatum

), har fået offentlig interesse som en populær antidepressiv af naturlig oprindelse med en ny mekanisme handling [5]. Det har også vist sig at have anti-cancer egenskaber

in vitro

in vivo

[6-8]. Men via binding til pregnan-X-receptoren (PXR), hyperforin opregulerer stærkt ekspressionen af ​​CYP3A4, et medlem af cytochrom P450 familien involveret i xenobiotika metabolisme [9]. Hvis således kombineres med kemo-terapeutiske lægemidler, der metaboliseres af CYP3A4, hyperforin ville i høj grad reducere effekten af ​​en potentiel anti-cancer kombinationsterapi fremgangsmåde, da det fremskynder metabolisme af lægemidlet (er) den er kombineret med.

Nært relaterede kemiske strukturer af hyperforin (til venstre) og nemorosone (til højre), to polycykliske polyprenylated acylphloroglucinols.

at være strukturelt relateret til hyperforin, har udtalte anti-cancer egenskaber også blevet påvist

in vitro

til nemorosone (figur 1) på cellelinjer af forskellig oprindelse, blandt dem neuroblastom og leukæmi [10,11]. Mere detaljerede analyser af dets virkningsmekanisme på bugspytkirtelkræftceller viste hurtig stigning af cyctosolic calcium niveauer og depolarisering af mitokondriemembranen efterfulgt af aktivering af apoptose via en stress respons pathway kendt som den udfoldede protein respons [12]. Interessant, blev differentierede normale celler fundet at være 10 gange mindre følsomme over for en behandling med nemorosone og dermed åbne en potentiel terapeutisk vindue også at udforske sin anti-cancer aktivitet

in vivo

.

I denne undersøgelse, viser vi, at i modsætning hyperforin, betyder nemorosone ikke inducerer CYP3A4 og undersøge dens biologiske aktivitet samt grundlæggende farmakokinetik

in vivo

i en bugspytkirtelkræft xenograftmodel. Det vises, at nemorosone absorberes hurtigt ind i blodbanen og i stand til at hæmme væksten af ​​xenotransplantattumorer.

Materialer og metoder

Etik Statement

Denne undersøgelse blev gennemført i nøje overensstemmelse med anbefalingerne i Vejledning for Pleje og anvendelse af forsøgsdyr af National Institutes of Health. Protokollen blev godkendt af Udvalget for den etiske af dyreforsøg i den regionale råd Karlsruhe, Tyskland (tilladelsens nummer: G-204/09). Alle operation blev udført under xylazin /ketamin anæstesi, og blev gjort alle bestræbelser på at minimere lidelse.

Implantation og behandling af xenotransplantattumorer

Seks til otte uger gamle kvindelige athymiske NMRI nu /nu nøgne mus (Charles River Laboratories, Sulzfeld, Tyskland) blev anbragt i grupper på 4 til 6 i individuelt ventilerede bure (IVCs, Techniplast, Tyskland) ved 22 ° C med en 12 timers lys /mørke cyklus og fik lov til at tilpasse sig de boligforhold for én uge før implantering af tumorer. MIA-PaCa-2-celler blev opretholdt som tidligere beskrevet [12], og 200 pi af en cellesuspension (~ 2 × 10

6) blev injiceret s.c. i den højre flanke af hver mus til at etablere subkutane xenograft tumorer. Tumor volumen blev regelmæssigt kontrolleres ved hjælp af en digital skydelære, og dyrene blev tilfældigt organiseret i behandlings- og kontrolgrupper engang betyde tumor volumen nåede ca. 100 mm

3.

Nemorosone, oprenset fra methanoliske blomst ekstrakter som rapporteret tidligere [ ,,,0],12], blev opløst i dimethylsulfoxid (DMSO) ved 50 mg /ml, og gemcitabinhydrochlorid (Eli Lilly, Tyskland) blev opløst i 0,9% NaCl-opløsning. Injektionsopløsninger blev sterilfiltreret og indgives intraperitonealt (i.p.) under anvendelse af 0,3 ml insulininjektionssprøjter (Becton Dickinson, Tyskland) efter sterilisation af injektionsstedet. Kropsvægt blev reguleret dagligt før intraperitoneal indsprøjtning. 1 pl /g kropsvægt blev injiceret for at opnå en slutkoncentration på 50 og 120 mg /kg for nemorosone og gemcitabin, hhv. Nemorosone blev injiceret en gang dagligt mens standard behandling tidsplan for hver tredje dag i fire cyklusser for gemcitabin blev anvendt [13].

immunhistokemisk farvning af xenotransplantattumorer

En dag efter den sidste behandling, mus blev aflivet ved cervikal dislokation og xenotransplantattumorer blev reseceret, snap-frosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -80 ° C. Tumorer blev monteret i en cryomicrotome (Leica, Tyskland) ved -25 ° C og 5 um skiver blev frembragt fra tumor marginer og centre, der skal overføres til objektglas

I hematoxylin og eosin (H detektion ved 303 nm)

Mus blev behandlet med daglige i.p.. injektioner af 50 mg /kg nemorosone, kun eller 120 mg /kg gemcitabin i de angivne tidspunkter (grønne prikker) køretøj. Tumorvolumen blev målt 2-3 gange om ugen ved anvendelse af en digital skydelære. Værdier repræsenterer middelværdien ± SD af 8 dyr pr gruppe

* p 0,05, ** p 0.01 (sammenlignet med kontrolgruppen køretøjet).

Fem minutter efter i.p. ansøgning, ca. 40 ug /ml (80 pM) nemorosone blev påvist i museplasma, peger mod en meget hurtig absorption i blodbanen (figur 5A). På samme tidspunkt blev 7 yderligere toppe ligner potentielle metabolitter fundet i HPLC-kromatogram (figur 5A, fig S2). Imidlertid blev plasmakoncentrationen af ​​potentielle metabolitter (M01-M09) beregnet til at være 20 til 200 gange lavere end den for nemorosone. Over den observerede tid på 120 minutter, nemorosone plasmakoncentrationen faldt logaritmisk fra 40 til 2,7 ug /ml med en halveringstid på ca. 30 min. Farmakokinetik nemorosone efter i.p. ansøgning viste sig at være bedst beskrives med en to-kompartment disposition model giver en bifasisk linie i log-skala plot i figur 5B. Ifølge denne model, er nemorosone absorberes hurtigt og fordeles i blodbanen inden for de første 10 min efter injektion. 20 min efter påføring, eliminering synes at være den dominerende proces karakteriseret ved den lige monteret linje. skal dog det bemærkes, at de processer forud for 5 min tidspunkt (absorption og distribution) blev antaget og kræver yderligere bekræftelse i en mere detaljeret undersøgelse. Således kunne topkoncentrationen inden for de første minutter være meget højere (~ 100 pg /ml)

Sektioner af 5 um nemorosone-behandlede og kontrol tumorer blev farvet med hæmatoxylin-eosin (H A og B) eller immunhistokemisk analyseret med antistoffer rettet mod aktiv caspase 3 (C og D) eller Ki-67 (E og F). Behandlede tumorer demonstrerede reduceret tumormasse som følge af apoptose /nekrose (sorte pile) og en nedre række prolifererende celler i sammenligning med kontrolgruppen (mørke-brune celler).

Plasmaprøver blev taget ved præ- definerede tidspunkter efter ip anvendelse af 50 mg /kg nemorosone. Nemorosone og dets metabolitter blev kvantificeret ved RP-HPLC ved hjælp af en kalibreringskurve (figur S3). (A) plasma koncentration af nemorosone (øverste grønne linje) og dens potentielle metabolitter (M01 til M09). (B) Farmakokinetik af nemorosone blev bedst beskrevet ved en to-kompartment model med en halveringstid på 30 min.

identitet nemorosone blev yderligere bekræftet af en ESI massespektrometri detektor viser molekyle toppe for protoneret nemorosone og dens natrium- og kaliumsalte (Figur S4). Endvidere fandtes massen af ​​molekylet toppe af nogle metabolitter, øges med 16 u, hvilket antyder, at oxidation af nemorosone kan være en af ​​de vigtigste metabolismeprodukterne trin. Men på grund af den lave opløsning af ESI-MS-detektor, strukturen af ​​nemorosone metabolitter kunne ikke karakteriseres i detaljer.

Discussion

Hyperforin og nemorosone er blandt de bedst undersøgte medlemmer af forskelligartet klasse af polycykliske polyprenylated acylphloroglucinols og begge betragtes blyforbindelser for udvikling af lægemidler mod kræft [4,6,12,19]. Men indtil nu anticancer aktivitet

in vivo

er kun påvist for hyperforin men ikke for nemorosone [6]. Således er denne pilotundersøgelse til formål at vurdere aktiviteten af ​​nemorosone mod kræft i bugspytkirtlen xenotransplantattumorer

in vivo

samt identificere grundlæggende farmakokinetiske parametre som absorption kinetik og metabolisering.

Vores resultater viser, at nemorosone potent hæmmer væksten af ​​kræft i bugspytkirtlen implanteret

in vivo

og synes at være endnu mere effektiv end den nuværende standard for pleje gemcitabin (figur 3). Mens den indgivne nemorosone dosis på 50 mg /kg per dag var veltolereret i behandlingsperioden, blev hyperventilation observeres direkte efter anvendelse af nemorosone tyder på en vis systemisk aktivitet af denne forbindelse direkte efter absorption ind i blodbanen. Lignende observationer blev gjort for humulon, en strukturelt beslægtet forbindelse isoleret fra humle, efter intravenøs injektion i katte [20]. Dette indikerer sammenlignelige farmakodynamiske egenskaber, som kan være på grund af virkningen af ​​disse forbindelser på calcium homeostase i musklerne. Denne hypotese støttes af den øjeblikkelige nemorosone-induceret forstyrrelse af cellulær calciumhomeostase observeret

in vitro

[12]

Virkninger af nemorosone behandling på xenotransplantattumorer blev bekræftet ved H &. E-farvning af væv sektioner samt immunhistokemisk ved farvning aktiv caspase 3 og spredning markør Ki-67. Nemorosone-behandlede MIA-Paca-2 tumorer udviste mere nekrotisk og /eller apoptotiske regioner, som blev forbundet med forhøjet caspase 3-aktivitet og et lavere antal prolifererende celler udtrykker Ki-67, i overensstemmelse med resultaterne opnået i MIA-PaCa-2-celler

In vitro

[12].

Måling af plasma kinetik efter ip injektion af 50 mg /kg nemorosone bekræftet biotilgængelighed og absorption af forbindelsen i blodbanen (figur 5). Fem minutter efter injektion blev nemorosone plasmakoncentration fundet at være 40 ug /ml (80 uM) med logaritmisk elimination dominerer 20 minutter efter injektion og nemorosone demonstrerer en plasmahalveringstid på ca. 30 min. Målte værdier for plasma kinetik blev bedst monteret under antagelse af en to-kompartment disposition model som også observeret i et farmakokinetiske studier af hyperforin plasmakoncentration ved oral administration [21,22]. Beregnet maksimal plasmakoncentration af nemorosone var ~ 100 uM. Således betragtning af den høje dosis under den første 5-10 min efter påføring, den observerede akut hyperventilation kan forklares ved nemorosone reversibelt interferere med raske celler mellem den maksimale plasmakoncentration og påbegyndelsen af ​​eliminationsfasen cirka 10 minutter senere.

i alt blev detekteret 9 mulige metabolitter i museplasma, de fleste af dem var allerede til stede ved 5 min efter ip injektion (figur 5 og S2). Dette peger i retning af en hurtig metabolisme af nemorosone, i overensstemmelse med den beregnede halveringstid på kun 30 min. Desværre kunne strukturen af ​​metabolitterne ikke opnås på grund af den lave opløsning af ESI-MS-detektor. Men i betragtning af denne omstændighed, at retentionstiderne observeret i RP-HPLC kromatogram er lavere for alle metabolitter i forhold til nemorosone, oxidation eller hydroxylerings processer kan antages. Denne antagelse støttes yderligere af det faktum, at sammenlignet med nemorosone massen af ​​udvalgte metabolitter steg med 16 u, molekylvægten af ​​oxygen (fig S4). For at få detaljeret strukturel information om de metabolitter, en LC /ESI-MS-system med højere opløsning eller en præparativ tilgang til NMR-analyse vil skulle etableres. er blevet anvendt begge metoder til Hyperforin metaboliseres i rotte lever mikrosomale systemer og resulterede i identifikationen af ​​fire hyperforin metabolitter, hver hydroxyleret ved den terminale methylengruppe af en af ​​de fire prenyl sidekæder [23]. Forfatterne spekuleret på, at to rotte cytokrom P450 isoformer ortolog til menneskelig CYP3A4 var hovedsageligt involveret i metaboliseringen af ​​hyperforin. Dette stemmer overens med det faktum, at hyperforin inducerer ekspressionen af ​​

CYP3A4 via

binding til pregnan-X-receptoren (PXR) [9,24].

CYP3A4

ekspression blev også fundet at være stærkt induceret af hyperforin og rifampicin, et stof, der vides at aktivere PXR, efter behandling af humane primære hepatocytter i denne undersøgelse (figur 2). Interessant, nemorosone var kun moderat effektivt inducerer

CYP3A4

udtryk: Inkubation af hepatocytter med en uM nemorosone resulterede kun i en 3-dobling af

CYP3A4

mRNA i forhold til en 15-dobling på inkubering med 1 pM hyperforin. Dette resultat er overraskende i betragtning den meget fleksible ligandbindende hulrum i PXR som har vist sig at perfekt binder hyperforin [24,25]. Således fik den tætte strukturelle forhold på Hyperforin, bør forventes at PXR til også at binde og fremkalde

CYP3A4

udtryk ved ækvimolære nemorosone koncentrationer. Dette synes ikke at være tilfældet, hvilket gør højere koncentrationer af nemorosone til kræftbehandling foretrække over de af hyperforin for hvilke der er rapporteret flere lægemiddelinteraktioner relateret til CYP3A4-induktion [9,18]. I betragtning af, at en forhøjet PXR ekspression blev også observeret i forskellige pancreasceller [26], behandling af pancreascancer med en kombinationsterapi tilgang er mere tilbøjelige til at få succes med nemorosone snarere end hyperforin.

Det kan konkluderes, vores undersøgelse viser en markant vækst-hæmmende effekt af nemorosone på bugspytkirtelkræft implanteret samtidig være veltolereret. Grundlæggende farmakokinetiske analyse antyder, at nemorosone absorberes hurtigt og metaboliseres via oxidation i en CYP3A4-uafhængig måde. Dette gør nemorosone en meget lovende lead-stof til kombinationsbehandlinger. Således bør foretages mere detaljerede undersøgelser af ortotopisk xenograftmodeller og farmakokinetiske analyser af højere opløsning.

Støtte Information

Figur S1.

Kropsvægt af behandlede og kontrol mus. Kropsvægt af behandlede mus og kontrolmus blev rutinemæssigt bestemt dagligt før intraperitoneal indsprøjtning. Værdier repræsenterer middel ± SD af 8 dyr pr gruppe

doi:. 10,1371 /journal.pone.0074555.s001

(TIF)

Figur S2.

HPLC-kromatogrammer for nemorosone og dets metabolitter påvist i plasma. Overlejring af udvalgte HPLC-kromatogrammer (detektion ved 303 nm) af mus (grøn) og humane (blå) plasmaprøver samt humant plasma tilsat 100 ng /ml nemorosone (rød) og museplasma 5 min efter i.p. anvendelse af nemorosone (sort) vises

doi:. 10,1371 /journal.pone.0074555.s002

(TIF)

Figur S3.

Standard række af humant plasma tilsat stigende nemorosone koncentrationer. En kalibrering linje for nemorosone tilsat i humane plasmaprøver blev beregnet og køre parallelt med prøverne ekstraheret fra mus plasma for at tillade kvantificering af nemorosone

doi:. 10,1371 /journal.pone.0074555.s003

(TIF)

Figur S4.

ESI-MS spektre af nemorosone og udvalgte metabolitter. ESI-MS-spektre blev registreret for hver top, og spektre for nemorosone såvel som for metabolitter M01, M06 og M08 vises. Molekylet ion toppe af protoneret nemorosone (m /z = 503,2) samt dens natrium (m /z = 525,2) og kalium (m /z = 541,1) saltene er markeret med sorte pile. Potentielt oxideret nemorosone natrium (m /z = 541,1) og kalium (m /z = 557,2) saltene er markeret med grå pile

doi:. 10,1371 /journal.pone.0074555.s004

(TIF)

Tak

forfatterne er taknemmelig for, at DKFZ Laboratory Animal Facility og Sven Rüffer for teknisk hjælp under celledyrkning og dyrs arbejde samt Dr. Shereen Keleg, europæisk Bugspytkirtel center, Heidelberg, for hendes hjælp med immunhistokemisk farvning.