PLoS ONE: transkriptionsfaktorer E2A, FOXO1 og FOXP1 Regulere Rekombination Aktivering genekspression i kræftceller

Abstrakte

Det har længe været accepteret, at immunglobuliner (IGS) blev produceret af kun B lymfoide celler. De nyeste Ig’er har vist sig at blive udtrykt i forskellige humane cancerceller og fremme tumorvækst. Rekombination aktiverende gen 1 (RAG1) og rag2, som er vigtige enzymer til at indlede variabel mangfoldighed-sammenføjning segment rekombination er også fundet, at blive udtrykt i cancerceller. Imidlertid har mekanismen for RAG-aktivering i disse cancerceller ikke blevet belyst. Her undersøgte vi reguleringsmekanisme RAG ekspression i fire humane cancercellelinier ved at analysere transkriptionsfaktorer der inducerer RAG-aktivering i B-celler. Ved RT-PCR, Western blot og immunfluorescens, fandt vi, at transkriptionsfaktorer E2A, FOXO1 og FOXP1 blev udtrykt og lokaliseret mod kernerne i disse cancerceller. Over-ekspressionen af ​​E2A, FOXO1 eller Foxp1 forøget RAG udtryk, mens RNA-interferens af E2A, FOXO1 eller FOXP1 faldt RAG udtryk i kræftcellerne. Kromatin immunopræcipitationsforsøg viste acetylering af RAG forstærker (Erag) og E2A, FOXO1 eller FOXP1 var bundet til Erag in vivo. Disse resultater viser, at transkriptionen i disse cancerceller faktorer E2A, FOXO1 og FOXP1 regulere RAG ekspression, som initierer Ig-omlejring meget i vejen svarende til B-lymfocytter

Henvisning:. Chen Z, Xiao Y, Zhang J , Li J, Liu Y, Zhao Y et al. (2011) transkriptionsfaktorer E2A, FOXO1 og FOXP1 Regulere Rekombination Aktivering genekspression i kræftceller. PLoS ONE 6 (5): e20475. doi: 10,1371 /journal.pone.0020475

Redaktør: Sumitra Deb, Virginia Commonwealth University, USA

Modtaget: Marts 21, 2011; Accepteret: April 26, 2011; Udgivet: 31. maj 2011

Copyright: © 2011 Chen et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud (81.001.199 til ZC, 81.030.033, 30.971.150 til JG, 30950110335 til KC) fra National Natural Science Foundation of China, og give LYM10079 til ZC fra Innovative talenter Program for Guangdong Læreanstalter og universiteter. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Det har længe været anerkendt, at immunoglobuliner (Ig’er) kun kan udtrykkes i modne B-lymfocytter og plasmaceller. nylig flere grupper rapporterede dog, at Ig’er også kunne produceres af ikke-lymfoid-afstamningsceller [1], herunder humane cancerceller [2], [3], bløde væv tumorceller [4], neuroner og gliaceller i centralnervesystemet og perifere nervesystem [5], okulære epithelceller og ganglieceller [6], mus testikulære spermatogene celler og epididymisvægt epitelceller [7] og mus diegivende brystkirtel epitelceller [8]. Det meste af forskningen har hidtil fokuseret på Ig ekspression i cancerceller. Rekombinationen aktiverende gen (RAG) har også vist sig udtryk i cancerceller både mRNA og protein niveauer, og det antages at spille en væsentlig rolle i syntesen af ​​Ig’er fra disse cancerceller [2], [3], [ ,,,0],9]. Men den reguleringsmekanisme RAG udtryk i cancerceller er endnu ikke fastlagt,.

De variable regioner af Ig-gener er sammensat af en variabel (V), en mangfoldighed (D), og en sammenføjning (J) gensegment, arrangementet af som resulterer fra V (D) J rekombination [10]. RAG endonuclease er nødvendig for initiering af spaltning fase af V (D) J rekombination [11]. RAG består af to tilstødende gener, RAG1 og rag2, der synergistisk inducerer V (D) J rekombination [12]. Tidligere undersøgelser har vist, at mus som mangler enten RAG1 eller rag2 undladt at indlede V (D) J-omlejring [13], [14]. RAG1 og rag2 proteiner sammen viste sig at være tilstrækkeligt til at kløve rekombination substrater i celle frie systemer [15], [16]. I sker murine B-celle udvikling RAG til udtryk i to bølger og reguleres af et netværk af transkriptionsfaktorer, herunder E2A, Ikaros, Pax5β, Foxo1, Foxp1, og NF-KB [17]. Den første bølge resulterer i omlejringen af ​​immunglobulin tung kæde i pro-B-celler. Og den anden bølge af RAG ekspression fører til samlingen af ​​immunoglobulin let kæde i præ-B-celler.

Foruden de RAG1 og rag2 promotorer, RAG genet har også andre regulatoriske elementer, såsom den proximale enhancer (Ep), den distale forstærker (Ed) og RAG forstærker (Erag) [17], [18], [19], [20], [21], [22]. Det menes, at de førnævnte transkriptionsfaktorer regulere RAG-ekspression ved binding til deres tilsvarende regulatorsekvenser i B-celler. Erag er den stærkeste forstærker regulering RAG udtryk. Målrettet deletion af Erag i musekimlinien resulterede i en 5-fold til 10-fold fald i RAG-ekspression og en delvis blok på pro-B til at pre-B overgang [22]. E2A, Ikaros, Foxo1, Foxp1 og NF-KB blev alle vist sig at aktivere RAG udtryk ved at binde til Erag i murine B-celler [22], [23], [24], [25], [26]. Pax5β blev rapporteret at aktivere rag2 promotor i umodne B-celler [27]. Hvorvidt disse transkriptionsfaktorer er også til udtryk i kræftceller, og om de har regulatoriske funktioner i angivelsen af ​​RAG i sådanne celler er værdig til efterforskning.

I denne undersøgelse har vi først analyseret protein og mRNA udtryk for dem, transskription faktorer, der har vist sig at være afgørende for RAG aktivering i B-celler, herunder E2A (E47 og E12), FOXO1, FOXP1, Ikaros, NF-KB, og PAX5β, i fire cancer cellelinjer. Vi studerede derefter lokaliseringen af ​​en række af disse transkriptionsfaktorer (E2A, FOXP1, NF-KB og FOXO1) ved immunfluorescens (IF). Vi fandt, at E2A, FOXO1 og FOXP1 blev udtrykt i cancerceller og lokaliseret til kernerne i disse celler. Over-ekspression af disse tre transkriptionsfaktorer signifikant forøget RAG ekspression. Funktionel inaktivering af generne af nogen af ​​disse tre transkriptionsfaktorer efter RNA-interferens faldt RAG ekspression. In vivo kromatin immunofældning (chip) assay viste, at histon H3 af Erag blev acetyleret og at E2A blev FOXO1, FOXP1 bundet til Erag i disse cancerceller. Disse resultater viser, at transkriptionsfaktorer E2A, FOXO1 og FOXP1 aktivere ekspressionen af ​​RAG, hvilket er kritisk for V (D) J rekombination, i cancer.

Materialer og metoder Salg

Etiske redegørelse

Vi brugte ikke nogen mennesker eller dyr væv i vores undersøgelse. Så vi ikke føler, at etik godkendelse var nødvendig.

Cell kultur

Den menneskelige lungecancer cellelinje A549, prostatakræft cellelinje PC3, brystkræft cellelinier MCF-7, MDA- MB-231 og Burkitt lymfom cellelinie Raji opnåedes fra American Type Culture Collection (ATCC). A549, PC3, MCF-7 og MDA-MB-231-celler blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) med 10% FBS (Hyclone /Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA). Raji-celler blev dyrket i RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA) med 10% FBS ved 37 ° C i en fugtig atmosfære med 5% CO2.

RNA-ekstraktion og RT-PCR

I alt RNA blev ekstraheret fra tumorcellerne under anvendelse af Trizol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA) og behandlet med RNase-frit DNase (Invitrogen) for at fjerne genomisk DNA. Revers transkription af RNA blev udført under anvendelse af Superscript ™ III First Strand Synthesis System (Invitrogen, Carlsbad, CA) ifølge producentens instruktioner. For den negative kontrol blev revers transkriptase ikke tilsættes til reaktionsblandingen. Konventionel eller nested PCR blev udført, og de anvendte primere i denne undersøgelse blev opregnet i tabel 1. For Ikaros, som har flere forskellige isoformer, blev nested PCR anvendes til at øge følsomheden og for bedre at karakterisere de specifikke Ikaros isoformer [28]. De to isoformer af E2A, E47 og E12 blev begge opformeret ved PCR.

SDS-PAGE og Western blot

Cellelysater blev fremstillet under anvendelse RIPA buffer. Ca. 40 ug totalt celleprotein blev separeret på 5% til 10% SDS-PAGE-gel. Efter elektroforese blev de adskilte proteiner overføres til en polyvinylidendifluoridmembran. De primære antistoffer anvendt inkluderet RAG1 (K-20), rag2 (D-20), GAPDH (0411), E2A (Yae), FOXP1 (D35D10), NF-KB p65 (F-6), og FOXO1 (H-128 ). FOXP1 antistof blev opnået fra Cell Signaling Technology og andre antistoffer blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology. Efter inkubering med de sekundære antistoffer (gede-anti-muse-IgG-HRP eller gede anti-kanin IgG-HRP, Santa Cruz) blev immunblots fremkaldt under anvendelse af Super ECL Plus påvisningsreagens (Applygen Technologies, Beijing) og eksponeret for røntgenfilm ifølge fabrikantens protokol.

Immunofluorescens

Celler blev dyrket på objektglas i plader med 6 brønde og fikseret i 4% paraformaldehyd i 15 minutter ved stuetemperatur. Derefter blev objektglassene inkuberet med 0,5% Triton X-100 i 10 minutter, og blokeret i 1 time i PBS indeholdende 4% bovint serumalbumin (BSA). De primære antistoffer inkluderet E2A (Yae), FOXP1 (D35D10), NF-KB p65 (F-6) og FOXO1 (H-128). De detaljerede oplysninger for disse antistoffer blev vist i tabel 2. isotypekontroller blev udført under anvendelse normal mus eller kanin IgG ved den samme koncentration som de primære antistoffer. Efter inkubering ved 4 ° C natten over og vask blev objektglassene inkuberet med det sekundære antistof gede-anti-muse-IgG-FITC (grøn signal) eller gede anti-kanin IgG-TRITC (rødt signal) ved stuetemperatur i 1 time. Efter en sidste vask blev objektglassene monteres med montering medier med DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA) og undersøges under et fluorescensmikroskop (Carl Zeiss).

plasmider konstruktion og transfektion

de humane E47 og E12 fragmenter blev klonet ind i en pIRES2-EGFP plasmid ved restriktionsenzym Bgl II og EcoR fra plasmider MigR1-hE47 og MigR1-hE12 henholdsvis, som var venlige gaver fra Dr. Barbara Kee fra University of Chicago. Den pcDNAI /NEO-5’HA-Foxp1A plasmid, som kodede murine Foxp1A protein blev generøst tilvejebragt af Dr. Philip Tucker fra University of Texas i Austin [29]. Den FOXP1 protein blev meget bevaret mellem humane og murine arter (mere end 90% identiteter), så vi brugte dette plasmid til vores undersøgelse. Den pcDNA3-GFP-FOXO1, AAA plasmid blev opnået fra Addgene og det var forberedt i Dr. William Sellers ‘laboratorium som tidligere [30] beskrevet. Dette plasmid indeholdt en phosphosite mutation af FOXO1, der som følge heraf ikke længere phosphoryleret med Akt og stadig kunne lokalisere til kernen og aktivere transkription i transficerede celler [31]. Med transient transfektion assays af A549 og MCF-7 cancerceller blev udført under anvendelse Fugene HD transfektionsreagens (Roche) ifølge producentens instruktioner.

RNA-interferens

Små interfererende RNA (siRNA) rettet mod FOXO1 [32], FOXP1, E2A og ikke-specifik kontrol siRNA (GenePharma, Shanghai, Kina) blev transficeret ind A549 og MCF-7 cancerceller anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner. SiRNA sekvenser blev opregnet i tabel 1.

ChIP

chromatin tværbinding og immunopræcipitation blev udført som tidligere [23] beskrevne. Den anti-acetyl-histon H3 (06-599, Upstate Biotechnology), E2A (Yae), E47 (N-649), FOXP1 (D35D10) eller FOXO1 (H-128) blev anvendt. Både E2A (Yae) og E47 (N-649) antistof blev anvendt i chip til E2A. Normalt kanin IgG (sc-2027 Santa Cruz) eller normalt muse-IgG (sc-2025 Santa Cruz) blev anvendt som en negativ kontrol. Immunopræcipiteret DNA-sekvenser blev analyseret med PCR og primerne blev opregnet i tabel 1.

Resultater Salg

E2A blev FOXO1, FOXP1 og NF-KB udtrykt i cancercellelinier

RT-PCR-resultater viste, at FOXO1, FOXP1, NF-KB-underenhed p65 og begge af de to isoformer af E2A (E47 og E12), blev udtrykt i kræftceller A549, PC3, MCF-7 og MDA-MB-231 (figur 1). Men hverken Ikaros eller PAX5β blev registreret, i disse kræft cellelinjer, mens de kunne begge blive forstærket fra Raji celler. På proteinniveauet, E2A, FOXO1, FOXP1 og NF-KB-underenhed p65 blev alle påvist i cancercellerne med Western blot assay (figur 2). Baseret på molekylvægten, blev den fulde længde FOXP1 findes at være det vigtigste isoform af FOXP1 udtrykt i cancercellerne. Vi bekræftede også udtryk for RAG1 og rag2 i disse cancer cellelinjer (figur 2).

18S blev anvendt som en intern kontrol. Raji blev anvendt som en positiv kontrol. DNase behandlet RNA uden at tilføje revers transkriptase blev anvendt som en negativ kontrol.

Raji celler blev anvendt som en positiv kontrol. GAPDH blev anvendt som en intern kontrol.

E2A, FOXO1 og FOXP1 blev lokaliseret til kernerne i kræftceller

For at undersøge lokalisering af E2A, FOXO1, FOXP1 og NF-KB i cancerceller, blev IF udført under anvendelse af de tilsvarende antistoffer på de fire cancercellelinier. Resultaterne viste, at E2A og FOXP1 overvejende blev lokaliseret til kernen, hvorimod NF-KB udelukkende blev lokaliseret til cytoplasmaet af cancercellerne (figur 3). FOXO1 blev fundet at translokere mellem kernen og cytoplasmaet, med placeringen afhængig af dyrkningsbetingelser og vækstbetingelser. Når cellerne blev konfluerende, blev FOXO1 primært placeret i kernen, mens det var hovedsageligt til stede i cytoplasmaet, når cellerne blev sparse. Da transkriptionsfaktorer skal lokaliseret i kernen for at regulere genekspression, vi bare fokuseret på E2A, FOXO1 og FOXP1 i den anden del af vores undersøgelse.

A, normal muse-IgG blev anvendt i stedet for den primære antistof. B, det primære antistof var muse-anti-E2A. C, det primære antistof var muse-anti-NF-KB p65. A til C blev det sekundære antistof gede-anti-muse IgG-FITC. D, normalt kanin IgG blev anvendt i stedet for det primære antistof. E, det primære antistof var kanin-anti-FOXO1. F, det primære antistof var kanin-anti-FOXP1. D til F, blev det sekundære antistof gede-anti-kanin-IgG-TRITC. Lignende resultater blev opnået for A549, PC3 og MDA-MB-231-cellelinjer (data ikke vist).

Over-ekspressionen af ​​E2A, FOXO1 eller Foxp1 up-reguleret RAG udtryk

for at undersøge effekten af ​​transkriptionsfaktorer E2A, FOXO1 og FOXP1 på RAG-ekspression, A549 og MCF-7-celler blev transficeret med ekspressionsvektoren for E47, E12, Foxp1A eller FOXO1. Den tomme vektor blev anvendt som en negativ kontrol. Otteogfyrre timer efter transfektion blev totalt protein ekstraheret til analyse af E2A, FOXP1, FOXO1 og RAG-ekspression ved Western blot-assay. Resultaterne viste, at transfektion med ekspressionsvektoren for E47, E12, Foxp1A eller FOXO1 øgede både RAG1 og rag2 udtryk (figur 4). Disse data indikerer, at overekspression af E2A, FOXO1 eller Foxp1 opreguleret ekspression af RAG1 og rag2 i MCF-7-celler. Lignende resultater blev opnået under anvendelse af A549 cellelinien (data ikke vist).

MCF-7-celler blev transficeret med tom vektor eller transkriptionsfaktor ekspressionsvektor pIRES2-EGFP-hE47, pIRES2-EGFP-hE12, pcDNA3- GFP-FOXO1, AAA eller pcDNAI /NEO-5’HA-Foxp1A. 48 timer senere totalt protein fra MCF-7-celler blev opsamlet og analyseret ved Western-blot. GAPDH blev vist som en loading kontrol. Forsøg blev gentaget tre gange med lignende resultater. Lignende resultater blev opnået for A549-cellelinje (data ikke vist).

RNA-interferens af E2A, FOXO1 eller FOXP1 ned-reguleret RAG udtryk

For yderligere at studere regulerende funktion E2A, FOXO1 og FOXP1 på ekspressionen af ​​RAG, siRNA sekvenser for E2A, FOXO1 eller FOXP1 blev transficeret ind A549 og MCF-7-celler. Den uspecifikke siRNA blev anvendt som negativ kontrol. 48 timer efter transfektion blev totalt protein ekstraheret til analyse E2A, FOXP1, FOXO1 og RAG-ekspression ved Western blot-assay. Transfektion med siRNA sekvens for E2A, FOXP1 eller FOXO1 blev anset for at mindske udtrykkene for både RAG1 og rag2 (figur 5), hvilket antyder, at silencing E2A, FOXO1 eller FOXP1 gener nedregulerer RAG1 og rag2 udtryk i MCF-7-celler. Lignende resultater blev opnået ved anvendelse af A549 cellelinien (data ikke vist).

MCF-7-celler blev transficeret med ikke-specifik kontrol siRNA eller siRNA sekvens for E2A, FOXO1 eller FOXP1. 48 timer senere totalt protein fra MCF-7-celler blev opsamlet og analyseret ved Western-blot. GAPDH blev vist som en loading kontrol. Forsøg blev gentaget tre gange med lignende resultater. Lignende resultater blev opnået for A549-cellelinje (data ikke vist).

E2A, FOXO1 og FOXP1 bundet til Erag in vivo

I murine B-celler transskription faktorer E2A, Foxo1 og Foxp1 regulere RAG udtryk gennem binding til Erag, enhanceren regulerer RAG genekspression. For at undersøge, om disse transkriptionsfaktorer opfører sig på lignende i cancerceller, blev ChIP udført på A549 og MCF-7-celler. Den Erag region 1 indeholder tre bindingssteder for E2A og et bindingssted for FOXO1 eller FOXP1, mens Erag region 3 indeholder ingen bindingssted for E2A og et bindingssted for FOXO1 eller FOXP1 [25]. CHIP Resultaterne viste, at histon H3 af både Erag region 1 og 3 blev acetyleret, hvilket indikerer, at Erag var i en åben eller aktiveret tilstand. Desuden transskription faktorer E2A, FOXO1 og FOXP1 blev påvist at være bundet til Erag region 1, men ikke til region 3 (figur 6). For begge cellelinier blev opnået lignende resultater.

A, tværbundet chromatin isoleret fra MCF-7-celler blev immunopræcipiteret med enten isotypekontrol IgG eller anti-acetyl-histon H3-antistof. De tilhørende kromosomale DNA-fragmenter blev amplificeret med primere for Erag region 1 og 3. B, antistoffet til immunofældning var anti-E2A, FOXO1 eller FOXP1. Forsøg blev gentaget tre gange med lignende resultater. Lignende resultater blev opnået for A549-cellelinje (data ikke vist).

Diskussion

For nylig flere forskergrupper rapporterede, at V (D) J rekombination og RAG udtryk forekom i kræftceller. Men mekanismen kontrollere disse fænomener i epitelceller er for tiden ukendt. I denne undersøgelse, analogt med den molekylære mekanisme for RAG-ekspression i B-celler, vi udforskede reguleringsmekanisme RAG udtryk i cancerceller ved at analysere transskription faktorer E2A, Ikaros, PAX5β, FOXO1, FOXP1 og NF-KB. Svarende til deres rolle i aktiveringen af ​​RAG udtryk i B-celler, fandt vi, at E2A, FOXO1 og FOXP1 reguleret RAG udtryk i cancerceller ved binding til Erag.

E2A tilhører klassen jeg helix-loop-helix (HLH) proteiner, også kendt som E-proteiner på grund af deres evne til at binde med relativ høj affinitet til den palindrome DNA-sekvens CANNTG, kaldet en E kasse websted [33], [34]. E2A-genet koder for to E proteiner, E12 og E47, som opstår gennem alternativ splejsning af exon koder for HLH-domænet [35]. E12 og E47 er de primære transskription aktivatorer, der fungerer dels ved at ansætte co-aktivator protein p300 /CBP, hvilket igen rekrutterer histonacetyltransferaser og RNA-polymerase II til promotoren eller forstærkere af målgener [36], [37]. E2A menes at være en vigtig regulator af B-celle-differentiering ved at aktivere ekspression af RAG og andre B-lymfoide gener [34]. Over-ekspression af E47 har tidligere vist sig at aktivere RAG1 ekspression og IgH kimlinje-transkription i fibroblaster [38]. Ektopisk ekspression af E2A, sammen med RAG1 og rag2 fremmes både IgH og IgL gen omlejringer i en ikke-lymfoide embryonisk nyrecellelinie [39], [40]. Vores konklusion om, at både RAG og E2A proteiner blev udtrykt i cancerceller bidrager til forståelsen af ​​mekanismen af ​​V (D) J rekombination i neoplastiske celler.

FOXO1 og FOXP1 tilhører familien af ​​Forkhead kasse proteiner, som indeholde en fælles DNA-bindende domæne (DBD) betegnet forkhead boks eller vingede helix-domænet [41]. FOXO1 kan translokere fra kernen til cytoplasmaet efter at være blevet phosphoryleret af Akt. Murine Foxp1 har fire alternativt splejsede isoformer, Foxp1A-Foxp1D [29]. Deregulering af FOXO1 og FOXP1 var blevet vist i mange cancertyper [41], [42]. For nylig to undersøgelser viste, at Foxo1 og Foxp1 reguleret RAG udtryk i murine B-celler [24], [25]. Her har vi vist, at FOXO1 og FOXP1 har også regulerende funktion i RAG udtryk i kræftceller.

I denne undersøgelse har vi fokuseret på en række udvalgte transkriptionsfaktorer og fandt, at E2A, FOXO1 og FOXP1 reguleret RAG udtryk i cancerceller. Uanset om der er yderligere transkriptionsfaktorer involveret i RAG udtryk stadig på at blive udforsket. Desuden kunne, om der er flere ligheder i genekspression mellem B-celler og cancerceller findes ved hjælp højkapacitetsmetoder. Tidligere blev det rapporteret, at Ig-ekspression fremmet tumorvækst og progression [2], [43], [44]. I betragtning af vores resultater på regulatoriske faktorer aktiverer RAG udtryk, måske Ig udtryk i cancerceller styres ved at målrette de opstrøms transkriptionsfaktorer til sidst forhindre tumor progression.

Tak

Vi takker Dr. Philip Tucker til at give pcDNAI /NEO-5’HA-Foxp1A plasmid, Dr. Barbara Kee for MigR1-hE47 og MigR1-hE12 plasmider og Dr. William Sellers for pcDNA3-GFP-FOXO1; AAA plasmid.