PLoS ONE: Metformin: En potentielt terapeutisk middel til tilbagevendende tyktarmskræft

Abstrakt

Akkumulerende tyder på, at metformin, et biguanid klasse af anti-diabetiske lægemidler, besidder anti-cancer egenskaber. Men de fleste af de undersøgelser for at evaluere terapeutisk effektivitet af metformin har været på primær cancer. Der foreligger ingen oplysninger om, hvorvidt metformin kunne anvendes effektivt til tilbagevendende kræft, specielt kolorektal cancer (CRC), der påvirker op til 50% af patienterne behandlet med konventionelle kemoterapi. Selvom årsagerne til gentagelse ikke er fuldt forstået, menes det at skyldes re-fremkomst af kemoterapi-resistent cancer stamceller /stamceller-lignende celler (CSCS /CSLCs). Derfor udvikling af ikke-toksiske behandlingsstrategier målrettet CSCS ville være betydelige terapeutiske fordele.

I den aktuelle undersøgelse har vi undersøgt effektiviteten af ​​metformin, i kombination med 5-fluorouracil og oxaliplatin (FuOx), den grundpille i colon kræftmedicin, på overlevelsen af ​​kemo-resistente kolon kræftceller, er stærkt beriget med CSCS /CSLCs. Vores data viser, at metformin virker synergistisk med FuOx til (a) inducere celledød i kemo-resistente (CR) HT-29 og HCT-116 tyktarmscancerceller, (b) hæmmer colonospheres dannelse og (c) forbedre colonospheres disintegration.

In vitro

cellekultur undersøgelser har endvidere vist, at den kombinatoriske behandling hæmmer migration af CR kolon kræftceller. Disse ændringer var associeret med forøget miRNA 145 og reduktion af miRNA 21. Wnt /β-catenin-signalvejen blev også nedreguleret angiver sin centrale rolle i reguleringen af ​​væksten af ​​CR colon cancerceller. Data fra SCID-mus xenograft model af CR HCT-116 og CR HT-29-celler viser, at kombinationen af ​​metformin og FuOX er yderst effektiv til inhibering af væksten af ​​tyktarmstumorer som påvist ved -50% hæmning i vækst efter 5 ugers kombinationsbehandling sammenlignet med vehikelbehandlede kontroller. Vores nuværende data tyder på, at metformin sammen med konventionel kemoterapi kunne være en effektiv behandling regime for tilbagevendende kolorektal cancer (CRC)

Henvisning:. Nangia-Makker P, Yu Y, Vasudevan A, Farhana L, Rajendra SG, Levi E, et al. (2014) Metformin: En potentielt terapeutisk middel til tilbagevendende tyktarmskræft. PLoS ONE 9 (1): e84369. doi: 10,1371 /journal.pone.0084369

Redaktør: Shrikant Anant, University of Kansas School of Medicine, USA

Modtaget: 18 oktober, 2013; Accepteret: November 22, 2013; Udgivet: 20 Jan 2014

Copyright: © 2014 Nangia-Makker et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra NIH (AG014343) og Institut for Veteran Anliggender (I101BX001927). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Nyt forståelse af den heterogene sammensætning af kræftceller i en tumor har afsløret tilstedeværelsen af ​​CSCS /CSLCs [1], [2], som udviser selvfornyende egenskaber, evnen til at initiere tumor fra et lille antal af celler, som er stærkt kemo-resistente [3] – [7]. Carcinoma tilbagefald er til dels skyldes, at konventionel kemoterapi alene rettet mod de hurtigt delende celler, der danner hovedparten af ​​tumoren, men skåner CSCS /CSLCs [8]. Andelen af ​​CSCS er rapporteret at stige efter konventionel kemoterapi [9]. Således tilstedeværelse af kemoresistente CSCS /CSLCs i den primære tumor kan delvist være ansvarlig for en fejl i komplet udryddelse af tumor resulterer i tilbagefald på de primære og sekundære sites. Udvikling af nye terapeutiske strategier, som specifikt er målrettet CSCS /CSLCs er derfor berettiget.

Metformin, (1,1-dimethylbiguanide hydrochlorid) en FDA godkendt biguanid anti-diabetisk medicin, er afledt af fransk lilla (

Galega officinalis

), en plante brugt i folkemedicinen i flere århundreder. Ud over sin funktion som glukoneogenese suppressor, er metformin nylig vist sig at have stærke anti-cancer egenskaber. I typen er vist 2 diabetespatienter metformin til at undertrykke carcinogenese i bryst-, bugspytkirtel og lunge, og for at mindske kræft dødelighed (gennemgået i [10], [11]. I en række prækliniske studier, metformin reducerede proliferation, apoptose, forårsaget cellecyklusstop, og reduceret forekomst og vækst af eksperimentelle tumorer

in vivo

[12] – [18] Nogle rapporter viser også, at metformin forbedrede respons af humane bryst tumorxenografter til konventionel kemoterapi ved at udrydde CSCS i. tumoren [19], [20].

Mange forskere har rapporteret den centrale rolle Wnt /β-catenin signalvejen i reguleringen af ​​epitelial stamcelle selvfornyelse [21], [22], og dets fejlregulering har været impliceret i mange maligniteter, herunder colorectal cancer (CRC) [23], [24]. i CRC, som følge af inaktivering af APC-genet, den koordinerede phosphorylering og destruktion af β-catenin forstyrres. som et resultat, β-catenin akkumuleres i cytoplasmaet, komplekser med DNA-bindende proteiner af TCF /LEF familie og translokerer til kernen [25], [26]. Når der, det aktiverer transskription af sit mål gener som cyclin D1, c-myc, MMP-7, MT1-MMP, axin1 etc. [27]. Mange af disse målgenerne er impliceret i intestinal stamcelleproliferation og carcinogenese [28]. For nylig viste vi, at Wnt /β-catenin pathway spiller en kritisk rolle i vækst og opretholdelse af colonospheres, som er stærkt beriget med CSC /CSL-celler [29]. Forøgede niveauer af β-catenin i colonospheres var forbundet med induktion af transkriptionel aktivering af TCF /LEF, som blev nedsat, når β-catenin blev stille under anvendelse siRNA [29].

En ny klasse af korte ikke-kodende RNA’er , såkaldte miRNA har vist sig som en regulator af mRNA translation. En miRNA kan fungere som en tumorsuppressor eller et onkogen afhængigt af dets mål i forskellige væv og celletyper [30]. Omfattende analyser af miRNA-udtryk mønstre i menneskelige kræftformer har afsløret, at forskellige cancertyper har forskellige miRNA ekspressionsmønstre [31] .Vi har rapporteret, at miR21, som har vist sig at være opreguleret i CRC [32], inducerer stemness i kemo resistente (CR) tyktarmskræft celler [33]. miR21 har vist sig at regulere væksten, migration, invasion og apoptose relaterede egenskaber af cancerceller [34]. Nedregulering af miR21 ved CDF, en analog af curcumin [35], resulterede i normalisering af PTEN /Akt akse i CR HCT-116 og CR HT-29 celler og reduceret vækst [36]. Over-ekspression af miR21in HCT-116-celler resulterede i en forøget β-catenin-aktivitet [33].

Denne undersøgelse blev foretaget for at undersøge, om metformin kunne anvendes i forbindelse med konventionel kemoterapi til at inhibere væksten af ​​kemo resistente tyktarmskræft celler og reguleringen af ​​denne proces. Heri, vi viser, at metformin virker synergistisk med FuOx, en kombination af 5-FU og oxaliplatin, grundpillen i tyktarmskræft kemoterapi til at hæmme væksten af ​​tyktarmen CR celler

in vitro

in vivo

samt deres migration via nedregulere miR21and hæmme Wnt /β-catenin signalvejen.

Materialer og metoder

cellelinjer og reagenser

menneskelige kolon kræftceller HT-29 og HCT-116 blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD). Cellerne blev holdt i Dulbeccos modificerede Eagles medium (4,5 g /l D-glucose) suppleret med 10% føtalt bovint serum (Invitrogen, Grand Island, NY) og 1% antibiotisk /antimykotisk i befugtet inkubator ved 37 ° C i en atmosfære af 95% luft og 5% carbon diaoxide. 5-Fluorouracil + Oxaliplatin (FuOx) resistente celler (CR-celler) blev dannet som beskrevet tidligere [37] – [39] i vores laboratorium. CR-celler blev holdt i normalt dyrkningsmedium indeholdende 2 × FuOx (50 uM 5 FU + 1,25 uM Ox). Endotelceller var en gave fra dr Dipak Banerjee, University of Puerto Rico og opretholdt i Earles Minimum Essential Medium suppleret med 10% føtalt bovint serum (Hyclone) som tidligere beskrevet [40]. Mediet blev skiftet to gange om ugen, og celler blev passeret anvendelse af 0,05% trypsin /EDTA (Invitrogen). Brugen af ​​cellelinjer blev godkendt af Human Investigation udvalget, Wayne State University, Detroit, MI. Metforminhydrochlorid blev købt fra Sigma Chemical Co. A 2 M opløsning blev fremstillet i sterilt destilleret vand og opbevaret ved -20 ° C. FU og Ox blev opnået fra Sigma Chemical Co.

Bestemmelse af cellevækst

Væksten af ​​coloncancerceller blev vurderet ved mitochondrial-afhængig reduktion af 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl ) -2, 5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) (Sigma) til formazan som tidligere [41] beskrevne. Kort fortalt, cellerne (5 x 10

3) blev podet i firdobbelte på 24 brønds dyrkningsskåle. Efter 24 timer frisk medium indeholdende forskellige koncentrationer af metformin og /eller FuOx blev tilsat. Efter 72 timer blev celleproliferationen bestemt ved MTT-assayet. Kort fortalt blev mediet fjernet, og cellerne blev inkuberet ved 37 ° C med MTT (0,5 mg /ml) i 4 timer. Mediet blev aspireret, og cellerne blev solubiliseret i 0,04 N HCI i isopropanol. Den optiske densitet (OD) blev målt ved 570 og 630 nm.

Analyse af samspillet mellem metformin og FuOx

Kombi indeks (CI) metode tilpasset til

in vitro

narkotika test blev anvendt til at bestemme arten af ​​samspillet mellem metformin og FuOx. Denne metode anvender flere lægemiddelvirkning ligning oprindeligt afledt af enzymkinetik metode, hvor outputtet er repræsenteret som CI og /eller isobologram analysis.CI analyse blev udført ved anvendelse CalcuSyn software (Biosoft, Ferguson, MO). Baseret på Cl-værdier, er omfanget af synergisme /anatogonism bestemt. Generelt CI-værdier under 1 tyder synergi, mens CI værdier over 1 indikerer antagonisme mellem narkotika. CI-værdier i intervallet 0,9-1,10 ville hovedsageligt indikere additive virkninger: dem mellem 0,9-0,85 tyder svag synergi, og værdier i intervallet 0,7-0,3 indikerer moderat synergi. Alle værdier mindre end 0,3 vil foreslå stærke synergistiske interaktioner mellem lægemidler.

Dannelse og differentiering af colonospheres

Cellernes evne til at danne sfærer i suspension blev evalueret som beskrevet af Liu et al [42 ] med mindre ændringer [29], [43]. Kort fortalt blev colonospheres genereret ved inkubering af et begrænset antal parentale og CR HCT-116 og HT-29-celler i en koncentration på 100 celler pr 200 pi i serum -fri stamcellemedium (SCM) indeholdende DMEM /F12 (01:01) suppleret med B27 (Life Technologies, Gaithersberg, MD) 20 ng /ml epidermal vækstfaktor (Sigma, St. Louis, MO), 10 ng /mL fibroblastvækstfaktor (Sigma) og antibiotika /antimykotika i plader med 24 brønde i nærværelse af metformin alene eller i kombination med FuOx. De colonospheres dannet efter 8 dage blev evalueret for deres størrelse og antal ved lysmikroskopi. I et sæt eksperimenter blev dannet i normalt medium colonospheres behandlet med metformin og /eller FuOx at analysere deres virkning på kugle differentiering og fastgørelse.

Extreme begrænsende fortynding analyse

Extreme begrænsende fortynding analyse (ELDA) blev udført som beskrevet af Hu og Smyth [44]. Kort fortalt enkelt cellesuspension opnået fra adhærente celler forbehandlet med metformin og /eller FuOx i 72 timer blev udpladet ved en koncentration på 100, 10 og 1 celle pr 100 μLSCM (24 brønd for hver fortynding) i 96-brønds plader og inkuberet i 8 dage . Ved udgangen af ​​8 dage, blev antallet af brønde, der viser dannelse af colonospheres talt. Hyppigheden af ​​kugle dannende celler blev bestemt ved hjælp af ELDA webtool på https://bioinf.wehi.edu.au/software/elda.

cellemigrationsassay

Denne analyse blev udført ved hjælp af en Boyden kammer (Neuroprobe Inc., Cabin John, MD) som tidligere beskrevet [41], [45]. I det nedre kammer 100 ug /ml Matrigel (BD Biosciences, Bedford, MA) alene eller blandet med metformin og /eller FUOX blev tilsat. HT-29 eller CR HT-29-celler (5 x 10

4) celler blev lagt i det øvre kammer. De to kamre blev separeret med et polycarbonat filter med 8 μ porestørrelse og inkuberet i et 37 ° C vævskultur inkubator i 16 timer, hvorefter filteret blev fjernet, cellerne på toppen af ​​filteret tørres og de migrerede celler blev fast, farvet ved hjælp af protokol Hema 3 plet sæt (Fisher Scientific Company, Pittsburgh, PA). De migrerede celler blev fotograferet ved hjælp af Olympus 45 mikroskop understøtter en Spot Idea kameraet og migrerede celler pr feltet blev talt. Hvert assay blev udført tre gange og 6 brønde blev anvendt til hver behandling.

I det næste sæt af eksperimenter blev migration af colon cancerceller over for endotelceller måles. I denne undersøgelse, enodothelial celler eller HT-29 /CR HT-29-celler (2,4 x 10

4) blev præ-mærket med levedygtige plet DiO eller Dil henholdsvis (Invitrogen), vasket to gange med komplet medium og udsået i hvert kammer af celledyrkningsinsert (ibidi GmbH). Efter 24 timer blev celledyrkningsinsert fjernet og blev observeret migrationen af ​​de co-kulturer mod hinanden til sårheling. I nogle kulturer, metformin og /eller FuOx blev tilføjet på tidspunktet for fjernelse af indsatsen. Cellerne blev fotograferet ved 0, 24 og 48 timer efter fjernelse af indlægget.

Western blot-analyse

Western blot-analyse blev udført ifølge standardprotokollen [46]. Kort fortalt blev cellerne solubiliseret i lysepuffer (50 mM Tris HCI, pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton X100, 0,5% NP40, 25 ug /ml af hver af aprotinin, leupeptin og pepstatin, 1 × phosphatase inhibitor cocktail (Sigma). efter klaring ved 10.000 g i 30 minutter blev supernatanten anvendt til proteinanalyse. Proteinkoncentration bestemmes af Bio-Rad protein assay kit ((Bio-Rad, Hercules, CA) og alikvoter indeholdende 25 ug protein blev adskilt ved SDS-polyacrylamidgelelektroforese. efter elektroforese blev proteiner overført til en polyvinylidendifluoridmembran (Millipore) ved elektroblotting og underkastedes Western blot-analyse med den anbefalede fortynding af primært antistof. efter vask blev blottene omsat med sekundært antistof-blanding indeholdende 1:2500 fortyndinger af det passende peberrodsperoxidase-konjugeret sekundært antistof (Amersham Biosciences). Proteinbånd blev visualiseret under anvendelse af et kommercielt tilgængeligt forstærket kemiluminiscens (Amersham Biosciences). Blots blev også immuno-omsat med en 1:5000 fortynding af anti-actin monoklonalt muse-antistof (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA) for at normalisere for variation i protein loading.

Isolering af RNA og kvantitative polymerase Chain Reaction analyse

Totalt RNA blev ekstraheret fra parentale og CR celler behandlet med metformin og /eller FuOx i 48 timer under anvendelse af TRIZOL-reagens (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner. Totalt RNA blev behandlet med DNase1 at fjerne kontaminerende genomisk DNA, efterfølgende oprenset under anvendelse miRNAeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA). RNA-koncentrationen blev målt ved en optisk densitet på 260 nm.

at kvantificere MIR-21 og MIR-145, første cDNA-syntese blev udført under anvendelse af Taqman MicroRNA Revers transkription kit (Applied Biosystems, Foster City, CA) . De miRNA RT-PCR-primere til miR21, miR145 og endogene kontrol RNU6B blev købt fra Applied Biosystems. Real time QRT-PCR-analyse blev udført ved anvendelse Applied Biosystems 7500 real time PCR System. PCR-blanding indeholdende Taqman 2 × Universal PCR Master Mix blev forarbejdet som følger: 95 ° C i 10 minutter efterfulgt af 40 cykler ved 95 ° C i 15 sek og 60 ° C i 60 sek. Signal blev indsamlet i endepunktet af hver cyklus. Den genekspression ΔC

T-værdier for hver prøve blev beregnet ved at normalisere med intern kontrol RNU6B, og relative kvantificering værdier blev plottet.

Flowcytometrisk analyse

Enkelt celle suspensioner af metformin og /eller FuOx behandlede eller ubehandlede CR HT-29-celler blev udsat for direkte immunfluorescensfarvning efterfulgt af flowcytometrisk analyse ifølge standardprotokol [38]. Kort fortalt blev cellerne høstet og vasket med PBS. En halv million celler blev suspenderet i 90 pi PBS indeholdende 0,5% BSA. Efter 10 minutters inkubering ved stuetemperatur blev 10 pi fluorofor (PE-Cy7 eller PerCP-Cy5) konjugeret ant-humant CD44 eller CD166-antistof tilsat og inkuberet i 30 minutter i mørke ved stuetemperatur. Prøverne blev derefter vasket og analyseret ved anvendelse af en FACS DiVa (BD, San Jose, CA). Cellerne er farvet med IgG2b (isotype-negativ kontrol) tjente som gating kontrol. Andelen af ​​CD44

+ /CD166

+ /lave celler blev fastsat på grundlag af fluorescensintensitet-spektre.

tumorvækst i SCID-mus

For at bestemme, om kombinationen af metformin og FuOx ville være en effektiv terapeutisk strategi til colontumorer, blev SCID-mus xenograft model af colon tumor udnyttet. For at generere kolon tumorer, fire uger gamle kvindelige SCID mus, indkøbt fra Taconic Laboratory, blev injiceret subkutant enten med 1 × 10

6 CR HCT-116 eller CR HT-29 celler suspenderet i 100 pi Matrigel. De blev derefter opdelt i 2 undergrupper af 4 mus og behandling med metformin blev startet 7 dage efter podning af cellerne i en undergruppe. Metformin (RIOMET 500 mg /5 ml; Ranbaxy Laboratories, Princeton, NJ) blev opløst i 100 ml drikkevand at opnå den dosis på 200 mg /kg legemsvægt. Vandet blev ændret dagligt og målt for vandindtag. Metformin behandling blev fortsat i 5 uger, indtil musene blev aflivet. Metformin gruppe blev også injiceret IP med en blanding af 25 mg /kg 5-fluorouracil og 2 mg /kg oxaliplatin gang om ugen i 3 uger. Tumorer blev målt en gang om ugen og tumorvolumener blev beregnet ved anvendelse af formlen: tumorvolumen = længde x bredde x bredde /2. Musene blev regelmæssigt overvåget for tegn på ubehag. Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med Wayne State University Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) godkendt protokol # A02-02-13. Dyrevelfærd Assurance # A3310-01.

Enkelt celle isolation fra xenograft

Små portioner (5-10 mg) af tumoren, der genereres i SCID mus ved CR HCT-116 og CR HT -29 celler som beskrevet nedenfor blev vasket grundigt i 1 × PBS indeholdende 10% antibiotikum /antimycotikum (AB /AM) og efterfølgende inkuberet natten over i Dulbeccos minimale essentielle medier (DMEM /F12) indeholdende 5% antibiotikum /antimycotikum ved 4 ° C. Vævet blev skåret i fine stykker med steril skalpel og derefter fordøjet med 1,5 mg /ml collagenase I (Sigma-Aldrich) og 20 ug /ml hyaluronidase I (Sigma-Aldrich) under forsigtig omrøring i 2-3 timer ved 37 ° C. Det fordøjede væv blev filtreret gennem 40 μ filter og centrifugeret ved 1200 rpm i 5 min. Supernatanten (indeholdende døde celler samt de fedtceller) blev bortkastet, og cellerne (pellet) blev vasket tre gange med DMEM /F12-medium indeholdende 5% AB /AM. Cellerne blev suspenderet i tidligere defineret stamceller medier.

Statistisk analyse

Alle

in vitro

forsøg blev gentaget tre gange i tre eksemplarer. Statistisk analyse blev udført under anvendelse af Microsoft Excel. P-værdier blev beregnet under anvendelse af 2 prøve t-test, forudsat ulige varianser. Værdier 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Metformin og FuOx kombinationsbehandling hæmmer væksten af ​​kemo-resistente HT-29 og HCT-116 celler synergistisk

For at undersøge. hvorvidt metformin virker synergistisk med FuOx at inhibere væksten af ​​kemoresistente celler, blev cellerne behandlet med stigende doser af metformin og FuOx, hver alene eller i kombination. Efter 72 timer blev cellevæksten bestemt ved MTT-assayet. Dosisresponskurver Fig 1A B viser, at mens 10 mM metformin eller 8 × (200 uM FU og 5 uM Oxaliplatin) FuOx alene forårsagede -40 og 60% hæmning, sammen de forårsagede en hæmning af -70% og 80% i CR HT-29 og CR HCT- 116 celler henholdsvis. Resultaterne viser, at kombinationen af ​​metformin og FuOx virker synergistisk til inhibering af væksten af ​​både CR HCT-116 og CR HT-29-celler. Alle efterfølgende forsøg blev udført under anvendelse af en af ​​kemoresistente coloncancer-cellelinjer.

(A) og CR HT-29 (B) celler produceret ved fast forhold fremgangsmåde. Fraktion af celler, der berøres af en kombination af de to lægemidler (fast forhold) var højere end alene enten agent. Fa betegner fraktionen af ​​celler påvirket i respons på behandlingen. Fa-værdier blev benyttet til udførelse synergi analyse ved CalcuSyn software som beskrevet i Materialer og Metoder. C. Relativ overlevelse CR HT-29-celler i nærværelse af stigende doser af metformin med og uden 2 × FuOx. Kombinationsbehandling er mere effektiv ved alle koncentrationer. Veh: køretøj alene. Hver behandling blev udført i firdobbelte, bjælker repræsenterer middelværdier ± standardafvigelse. * P-værdi. 0,05

De fraktioner af celler påvirket i respons på hver behandling, blev anvendt til at udføre synergi analyse med CalcuSyn software. CI som formuleret af software, afslørede værdier indikerer moderat synergistisk vekselvirkning mellem de to agenter i CR HCT-116 celler på metformindoser 5 mM og højere og en stærk synergi på 10 og 20 mM metformin i CR HT-29 celler (tabel 1). Nr synergisme blev set i de parentale celler (data ikke vist). Da kemoresistente celler holdes i 2 × FuOx (50 uM FU, 1,25 pM oxaliplatin), næste studerede vi virkningen af ​​doser af metformin fra 0,6 til 20 mm i kombination med 2 x FuOx på væksten af ​​CR HT 29 celler. Resultaterne viser, at ved alle de anvendte koncentrationer, kombinationsbehandlingen var mere effektive til at hæmme cellevækst end metformin alene (fig. 1C). De kemoresistente celler var mere resistente over for FuOx og mere følsomme over for kombinationsbehandling sammenlignet med de parentale celler (data ikke vist).

Metformin og FuOx kombinationsterapi hæmmer colonosphere formation (antal stamceller /stamceller lignende celler)

Det blev rapporteret, FuOx overlevende celler er beriget i CSCS /CSLCs der vokser som store, runde fastgjorte flydende sfæroide kolonier (colonospheres), når de dyrkes i serumfrit stamcelle medium ved en relativt lav densitet [38] [29]. Fig. 2A og B (venstre panel) viser, at i nærvær af 2 × FuOx, stigende koncentrationer af metformin faldt antallet og størrelsen af ​​colonospheres. Metformin også induceret binding og desintegrerede de colonospheres (fig. 2A og B (højre panel)) Når colonospheres blev trypsinbehandlet og podet i nærvær af metformin + FuOx, stigende antal kugler mistet deres stamceller-lignende egenskaber som de opfattes at vedhæfte til bunden af ​​skålen

A B:. Dannelse af primære colonospheres i nærvær af metformin og FuOx (venstre panel). Induktion af differentiering og fastgørelse af colonospheres i nærvær af metformin /FuOx (højre panel). A: grafisk fremstilling af numre B: mikrofotografier af repræsentative sfærer. C:. Flow cytometri af CD44 og CD166 positive celler efter metformin /FuOx behandling

Vi evaluerede også kræft stamceller egenskaber af de behandlede celler ved at udføre en ekstrem begrænsende fortynding assay (ELDA). CR HT-29-celler blev behandlet med metformin + FuOx i 72 timer og podet i normalt stamcelle medium. Mens metformin alene reducerede frekvensen at danne colonospheres med 1,5-2 folder, kombinationsbehandlingen reducerede det ved 7-8 folder, at af den ubehandlede kontrol (tabel 2).

For at afgøre, om og i hvilket omfang de nuværende behandlingsstrategier ville påvirke andelen af ​​CSCS /CSLCs, flowcytometrisk analyse blev udført efter metformin og /eller FuOx behandling af CR HT-29-celler. Resultaterne viste en reduktion (-65%) i CD44

høj /CD166

lav fænotype cellepopulation, sammenlignet med FuOx behandlede kontroller. Derimod er andelen af ​​CD44

høje /CD166

lave celler steg fra 5,12 til 7,34% i tilstedeværelse af FuOx, som kunne til dels skyldes død FuOx sensitive celler. Kombinationsbehandling reducerede andelen af ​​CD44

høj /CD166

lave celler til 2,8% (fig 2C). Tilsammen disse resultater tyder på, at kombinationen af ​​metformin og FuOx ikke alene nedsætter CR kolon CSC /CSLC befolkning, men også mindsker deres stamceller egenskaber.

Metformin og FuOx kombinationsbehandling hæmmer cellemigration

Cell migration blev bestemt ved Boyden kammer (fig 3A) og sårheling (fig 3B) assays. Boyden kammer assay indikerer, at mens parentale HT-29 celler viser begrænset migration, CR HT-29-celler udviser stærk vandring mod Matrigel. Imidlertid metformin blev fundet at inhibere migration på en dosisafhængig måde, og kombinationsbehandlingen forårsagede yderligere reduktion: ved 10 mM metformin + FuOx, -6 fold inhibering i migration blev observeret i CR HT-29-celler (Fig 3A)

Metformin /FuOx behandling reducerede migration af CR HT-29 celler. Hvert punkt repræsenterer gennemsnittet af 6 målinger. Søjler repræsenterer middelværdi ± standardafvigelse (A). Sårheling under anvendelse af endotel (top /rød) og CRC (bund /grøn). Top venstre panel: sår ved 0 timer; nederste venstre panel: komplet sårheling på 48 timer i CR HT-29 celler; øverste højre panel: delvis sårheling i HT-29 celler efter 48 timer; nederste højre panel: ufuldstændig sårheling i CR HT-29-celler i nærvær af 5 mM metformin /FuOx ved 48 timer (B). Western blot analyse af metformin /FuOx behandlet CR H29-celler indikerer nedsat Pakt niveauer (C); relative ændringer i phospho-Akt (Pakt) blev beregnet som et forhold mellem Pakt /Akt efter normalisering til p-actin, der blev anvendt som indlæsning kontrol. * P. 0,05

sårheling assay blev udført for at studere migration af forældrenes og CR HT-29 celler i retning af endotelceller. Fig. 3B viste CR HT-29 og endotelceller migrerer mod hinanden. Ved 48 timer blev såret fuldstændigt helbredt ved kolon CR celler, mens forældrenes celler viste kun ~46% sårlukning (3B). Behandling med metformin + FuOx bremset sårhelingsprocessen. Mens der blev observeret 54% og fuldstændig sårlukning i ubehandlede CR HT-29-celler efter 24 og 48 timer henholdsvis metformin + FuOx behandling resulterede i en 46 og 77% sårlukning efter 24 og 48 timer henholdsvis. Disse resultater bekræfter yderligere, at metformin + FuOx kombination er effektiv i fastholdende de tumorigene /vandrende /invasive egenskaber af kemo-resistente kolon kræftceller.

Det er blevet rapporteret, at Akt er en væsentlig nedstrøms mål for PI3K for ombygningen af ​​actinfilamenter at øge cellemigrering [47]. Det fik os til at analysere Akt /Pakt udtryk i metformin og FuOx behandlede celler. Western blot-analyse afslørede nedsatte niveauer af Pakt i behandlede celler, sammenlignet med kontroller (Fig. 3). Vi foreslår, at PI3K /Akt signalvejen kan spille en rolle i reguleringen af ​​metformin /FuOx-induceret hæmning af celle migration.

Metformin og FuOx kombinationsbehandling falder miRNA21 og øger miR145 udtryk

I betragtning af den opfattelse, at mIR-21 er onkogen, mens mIR-145 er tumor undertrykkende, har vi analyseret deres niveauer i kemoresistente colon cancerceller. Vi fandt niveauerne af miR21 at være højere i CR coloncancerceller [33] og miR145 at være lavere, når der sammenlignes med de tilsvarende børnesikring (upublicerede data). Resultaterne af den kvantitative realtids-PCR-analyse viste, mens metformin enten alene eller sammen med FuOx forårsagede en markant reduktion af MIR-21expression, det inducerede MIR-145, sammenlignet med deres respektive kontroller (fig. 4). Det er tilstrækkeligt at nævne, at QRT-PCR-værdier for miR-21 og miR-145 blev normaliseret til niveauerne af RNU6B

C:. Metformin /FuOx behandling af CR HCT-116 celler hæmmer transkriptionel aktivitet af TCF /LEF. D: Western blot-analyse viser en reduceret ekspression af β-catenin og c-myc i metformin /FuOx behandlet CR HCT-116-celler. p-actin blev anvendt som indlæsning kontrol. * P. 0,05

Som Wnt /β-catenin signalering spiller en kritisk rolle i reguleringen af ​​tyktarmskræft stamceller spredning, vi næste undersøgte effekten af ​​metformin behandling på β-catenin aktivitet sit udtryk og niveauet af sit mål protein c-myc. Kombinationen behandling af metformin og FuOX forårsaget -50% fald i den transkriptionelle aktivitet af TCF /LEF i CR HCT-116-celler, sammenlignet med de ubehandlede kontroller (Fig 4C). Western blot-analyse viste et markant fald i niveauerne af total β-catenin samt c-myc ekspression i CR HCT-116-celler. Taget sammen tyder resultaterne en inhibering af Wnt /β-catenin signalering i kemoresistente coloncancer celler som reaktion på kombinationsterapien af ​​metformin og FuOx.

Metformin og FuOx kombinationsterapi forsinker tumorvækst i SCID-mus

for at undersøge den terapeutiske virkning af kombinationen af ​​metform og FuOx blev SCID-mus xenograft model af kolon tumor udnyttet. CR HCT-116 eller CR HT-29-celler blev injiceret subkutant i flanken region SCID-mus. Efter tydelige tumorer blev dannet, blev én gruppe fodret metformin i drikkevandet og blev også injiceret (i.p.) med FuOx, en gang om ugen i 3 uger. Tumorvækst blev målt ved at beregne tumorvolumen i 34 dage. Xenotransplantater dannet af CR HCT-116-celler viste en lineær vækst indtil 27 dage, hvorefter tumorvækst langsommere. Et lignende mønster vækst blev set i metformin /FuOx behandlede mus, omend væksten var signifikant lavere sammenlignet med kontroller. Ved dag 34 efter injektion, var der en statistisk signifikant (næsten 50%) reduktion i tumorstørrelse i metformin /FuOx behandlede mus (Fig 5A venstre panel). CR HT-29-celler injiceret mus viste en langsom tumorvækst indledningsvist. Imidlertid blev en voldsomme vækst set i kontroldyr efter 27 dage. På den anden side, metformin /FuOx behandlede mus viste et hurtigt fald i tumorvolumen efter 27 dage.

Søjler repræsenterer gennemsnit ± standardfejl. * P 0,05. Real time kvantitativ PCR på RNA ekstraheret fra celler isoleret fra CR HT-29 tumor (B). CD44 niveauer faldt og CK20 niveauer steg i metformin /FuOx behandlede xenotransplantater. Colonosphere dannelse i de celler isoleret fra CR-HT-29-xenografter (C).

De tumorer blev høstet, og enkeltcellesuspensioner blev dyrket i stamcelle medium. Real-time qPCR analyse blev udført, som viste et signifikant fald i CD44 og stigning i CK20-mRNA-niveauer i tumorceller danner metformin /FuOx-behandlede mus (figur 5B).