PLoS ONE: Overekspression af prothymosin Alpha forudser Poor Disease Outcome i hoved og hals Cancer

Abstrakt

Baggrund

I vores seneste undersøgelse, væv proteomisk analyse af orale præmaligne læsioner (OPLs) og normal mundslimhinden førte til identifikation af et panel af biomarkører, herunder prothymosin alpha (PTMA), at skelne OPLs fra histologisk normalt orale væv. Denne undersøgelse havde til formål at bestemme den kliniske betydning af PTMA overekspression i mundtlig planocellulært hyperplasi, dysplasi og hoved og hals pladecellekræft (HNSCC).

Metode

Immunhistokemi af PTMA protein blev udført i HNSCCs (n = 100), planocellulært hyperplasi (n = 116), dysplasi (n = 50) og histologisk normale orale væv (n = 100). Statistisk analyse blev udført for at bestemme sammenslutning af PTMA overekspression med klinisk-patologiske parametre og sygdom prognose over 7 år for HNSCC patienter.

Resultater

Vores immunhistokemisk analyse viste signifikant overekspression af nukleare PTMA i planocellulært hyperplasi (63,8%), dysplasi (50%) og HNSCC (61%) sammenlignet med oral normal mucosa (p

trend 0,001). Chi-square analyse viste signifikant association af nuklear PTMA med avancerede tumor stadier (III + IV). Kaplan Meier overlevelse analyse viste reduceret sygdomsfri overlevelse (DFS) i HNSCC patienter (p 0,001; median overlevelse 11 måneder). Især Cox-multivariat analyse afslørede nuklear PTMA som en uafhængig forudsiger af dårlig prognose af HNSCC patienter (p 0,001, Hazards ratio, HR = 5,2, 95% CI = 2,3-11,8) sammenlignet med den histologiske grad, T-stadium, nodal status og tumor stadie.

konklusioner

Nuclear PTMA kan tjene som prognostisk markør i HNSCC at bestemme undergruppen af ​​patienter, der sandsynligvis vil vise tilbagefald af sygdommen.

citation: Tripathi SC, Matta A, Kaur J, Grigull J, Chauhan SS, Thakar A, et al. (2011) Overekspression af prothymosin Alpha forudser Poor Disease Outcome i hoved- og halscancer. PLoS ONE 6 (5): e19213. doi: 10,1371 /journal.pone.0019213

Redaktør: Irina V. Lebedeva, Enzo Life Sciences, Inc., USA

Modtaget: Oktober 11, 2010; Accepteret: 29 2011; Udgivet: 5 maj 2011

Copyright: © 2011 Tripathi et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. SCT er understøttet af en Senior Research Fellowship fra indiske råd for medicinsk forskning (ICMR), New Delhi, Indien. AM er modtager af MITACS Accelerate Fellow. RR taknemmeligt anerkender støtte fra Joseph og Mildred Sonshine Center for hoved og hals Sygdomme og Temmy Latner /Dynacare Family Foundation, Canada. RR og KWMS anerkender finansiering fra den canadiske Institutes of Health Research (CIHR), International Science and Technology partnerskaber Canada (ISTP Canada) og Institut for Bioteknologi (DBT), Indien. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Humant prothymosin alfa (PTMA) er en 12,5 kDa, syre-rige, ikke-histon kerneprotein, bestående af 110 aminosyrer [1]. PTMA vides at spille en vigtig rolle i cellecyklusregulering, proliferation, transkription, chromatin remodeling, oxidativ stress-respons og apoptose [2] – [8]. Overekspression af PTMA er blevet rapporteret i flere maligniteter såsom brystcancer [5], leverkarcinom [9], lungecancer [10], neuroblastom [11], blærecancer [12], gastrisk [13] og øvre urinveje overgangsperiode cellecarcinom [14]. Desuden PTMA fungerede også som prognostisk markør for kræft i bryst, mave, prostata og blære [5], [13], [15], [16]. For nylig identificerede vi PTMA blandt panel af biomarkører, der kan finde deres nytte i at skelne OPLs og HNSCCs fra ikke-maligne væv, ved hjælp isobare tags til relativ og absolut kvantificering (iTRAQ) mærkning og multidimensionel væskekromatografi /tandem massespektrometri (LC-MS /MS) [17].

HNSCC er blandt de ti mest udbredte kræftformer i verden, med en højere andel forekommer i udviklingslandene. Tobak, betelnødder quid og alkoholforbrug samt human papilloma virus (HPV) er de vigtigste risikofaktorer forbundet med udvikling af hoved- og halscancer [18] – [24]. Oral planocellulært karcinom (OSCC), en af ​​de vigtigste undertyper af HNSCC, er ofte indledes med klinisk veldefinerede læsioner, såsom leukoplakia, som er kausalt forbundet med kronisk eksponering af mundslimhinden for kræftfremkaldende stoffer /vækstfremmere i tobak og /betelnødder quid. På en gennemsnitlig omkring 1-2% af disse orale læsioner omdanne til kræft årligt [25] – [27]. Desuden har mere end 50% af alle HNSCC patienter fremskreden sygdom på diagnosetidspunktet [28]. Selv om der har været fremskridt i behandlingsmodaliteter, der forbedrer livskvaliteten og har palliativ værdi, har overlevelsesrater for HNSCC patienter ikke forbedret markant (ca. 50%), ofte på grund af loco-regional tilbagefald eller anden primære tumorer observeret almindeligt i de overlevende [27] – [30]. På nuværende tidspunkt er de vigtigste prognostiske faktorer for HNSCC er histologisk tumor kvalitet, scene, dybde tumor invasion og inddragelse af de regionale lymfeknuder på tidspunktet for diagnosen. ingen af ​​disse faktorer kan dog forudsige prognosen af ​​HNSCC effektivt, hvilket understreger betydningen af ​​at identificere nye biomarkører til tidlig opdagelse, risikovurdering og præcis forudsigelse af tilbagefald for denne malignitet.

I denne undersøgelse, vi havde til formål at bestemme den kliniske betydning af PTMA overekspression i hoved og hals tumorigenese. Vi analyserede ekspressionen af ​​PTMA i en stor gruppe af kliniske prøver, herunder normal mundslimhinde, planocellulært hyperplasi, dysplasi og HNSCC ved immunohistokemi. Endvidere undersøgte vi korrelationer af nukleare PTMA udtryk med klinisk-patologiske parametre for planocellulært hyperplasi, dysplasi og HNSCC at bestemme dens anvendelighed som biomarkør.

Resultater

Korrelation af nukleare PTMA i planocellulært hyperplasi, dysplasi og HNSCC med klinisk-patologiske karakteristika

for at bestemme den kliniske betydning af PTMA protein i hoved-og-hals tumorigenese, var dens udtryk analyseret i normal mundslimhinden, planocellulært hyperplasi, dysplasi og HNSCC hjælp immunhistokemi. Figur 1A viser den samlede score distribution af nukleare PTMA i normal mundslimhinde, planocellulært hyperplasi, dysplasi og HNSCC. Af de 100 histologisk normale analyserede væv, 88 væv (88%) viste ingen påviselig PTMA immunfarvning i kerner af epitelceller i normalt væv (tabel 1, figur 1B (i)). PTMA ekspression blev observeret i 5 af 43 (11,6%) parrede normale væv og 7 i 57 (12,3%) kun uparrede normale væv. Chi trend analyse viste også signifikant stigning i nukleare udtryk for PTMA i væv fra forskellige stadier af hoved-og-hals tumorigenese (planocellulært hyperplasi, dysplasi og HNSCC, p

trend 0,001). Blandt planocellulært hyperplasi (n = 116), 74 tilfælde (63,8%) viste signifikant stigning i nuklear PTMA immunoreaktivitet (p 0,001, OR = 12,9, 95% CI = 6,3-26,3) sammenlignet med normale orale væv (tabel 2 og Figur 1B (iii)). Forøget nuklear ekspression af PTMA blev også observeret i 50% dysplasi (25 af 50 tilfælde, s 0,001, OR = 7,3, 95% CI = 3,2-16,6) sammenlignet med normale orale væv (tabel 3 og figur 1B (v)) . Tabel 1, 2 og 3 opsummerer korrelationer af nukleare PTMA med klinisk-patologiske parametre for normal mundslimhinden, planocellulært hyperplasi og dysplasi hhv. Interessant, viste nukleare PTMA signifikant sammenhæng med tobaksforbruget vaner patienter med planocellulært hyperplasi (p 0,001)

(a) Box-Plot analyse:. Box plots viser fordeling af samlede score baseret på immunhistokemi af PTMA protein i paraffinindlejrede sektioner af orale normale væv, planocellulært hyperplasi, dysplasi og HNSCC. Den lodrette akse viser den samlede immunfarvning score, opnået som beskrevet i afsnittet Fremgangsmåder. Figuren viser samlet score distribution af nukleare PTMA udtryk i planocellulært hyperplasi (score interval 0-7), dysplasi (score interval 0-7) og HNSCC (score interval 0-7). (B) Immunohistokemisk analyse af PTMA i hoved og hals væv: paraffinindlejrede sektioner af histologisk oral normal slimhinde, planocellulært hyperplasi, dysplasi og HNSCC blev farvet ved anvendelse af anti-PTMA polyklonalt antistof som beskrevet i afsnittet Fremgangsmåder. (I) normale mundslimhinden viser ingen PTMA immunfarvning; (Ii) planocellulært hyperplasi viser ingen immunfarvning for PTMA; (Iii) planocellulært hyperplasi viser nuklear PTMA immunofarvning i epitelceller; (Iv) dysplasi viser noget nukleart PTMA immunfarvning; (V) dysplasi afbilder nukleare PTMA immunofarvning i epitelceller; (Vi) HNSCC snit, der viser noget nukleart PTMA farvning; (Vii) HNSCC sektion illustrerer nukleare PTMA farvning i tumorceller; (Viii) blærecancer vævssnit viser nuklear PTMA immunfarvning; (Ix) HNSCC sektion anvendt som en negativ kontrol, der viser ingen PTMA immunofarvning i tumorceller; (I-ix oprindelige forstørrelse × 200). Vejviser

Blandt HNSCC viste nukleare lokalisering af PTMA i tumorceller 61% tilfælde sammenlignet med normale orale væv (p tabel 4 og figur 1B (vii)). De klinisk-patologiske parametre HNSCC og deres korrelationer med nuklear PTMA ekspression er vist i tabel 4. Interessant udviste nuklear PTMA signifikant association med avanceret tumor stadium (p = 0,03). Navnlig ingen af ​​HNSCC væv udviste cytoplasmatisk PTMA immunfarvning. Den positive kontrol (blærecancer) viste intens nuklear PTMA ekspression (figur 1B (viii)), mens der blev observeret nogen immunfarvning i vævssnit, der anvendes som negative kontroller, hvor det primære antistof blev erstattet af isotype IgG (figur 1B (ix)).

evne nukleare PTMA at skelne planocellulært hyperplasi, dysplasi og HNSCC fra normal mundslimhinden blev bestemt ved at vurdere følsomhed, specificitet, positive og negative prædiktive værdier og areal-under-the-kurven (AUC) hjælp Receiver Operating Characteristic (ROC) kurve analyse. Værdierne for følsomhed, specificitet og AUC for planocellulært hyperplasi, dysplasi og HNSCC er angivet i tabel 5. Den positive prædiktive værdier (PPV) var 86,0, 67,6 og 83,6 for nuklear ekspression af PTMA henholdsvis i disse tre grupper (tabel 5).

PTMA overekspression som en uafhængig prognostisk markør for HNSCC

Den anslåede forudsigende magt PTMA udtryk med dårlig prognose blev vurderet ved Kaplan-Meier overlevelsesanalyse. HNSCC patienter huser nuklear PTMA udviste signifikant reduceret sygdomsfri overlevelse (p 0,001; median overlevelse 11 måneder) sammenlignet med de patienter, der viser noget nukleart PTMA immunfarvning (figur 2d). Cox-multivariat regressionsanalyse blev udført for at bestemme den prognostiske potentiale nukleare PTMA i HNSCC i forhold til andre clincopathological parametre, herunder alder, køn, histologisk kvalitet, T-stage, nodal status og tumor fase. Interessant, nuklear PTMA opstået som en uafhængig og mest betydningsfulde indikator for dårlig prognose i HNSCC patienter i multivariat analyse (p 0,001, HR = 5,2, 95% CI = 2,3-11,8).

(a) Kaplan Meier vurdering af kumulative andel af sygdomsfri overlevelse, median tid til sygdomsfri overlevelse (DFS: ingen gentagelse /metastaser) i HNSCC patienter, der viser nukleare immunfarvning af PTMA var 11 måneder i forhold til de patienter, der viser noget nukleart PTMA immunfarvning (p 0,001); (B) Positive prædiktive værdier: Positive prædiktive værdier [PPV (t)] for tid til cancer tilbagefald i 51 HNSCC patienter med PTMA (+) (optrukket linje) og for alle 77 HNSCC patienter med overlevelsesdata (stiplet linie); (C) negative prædiktive værdier: negative prædiktive værdier [NPV (t)] for tid til kræft tilbagefald til 26 patienter med PTMA (-) (fuldt optrukket linie), og for alle 77 patienter (stiplet linje)

.

på baggrund af vores data, den ekstra prognostiske værdi, at nuklear PTMA udtryk fastsatte forudsige (PPV) eller eksklusive (NPV) kræft tilbagefald i HNSCC patienter blev målt ved forholdet: PPV

tilbagefald /HNSCC (83 måneder | PTMA ) /PPV

tilbagefald /HNSCC (83 måneder) = 78,4 /61,0; NPV

tilbagefald /HNSCC (83 måneder | PTMA) /NPV

tilbagefald /HNSCC (83 måneder) = 73,1 /39,0 (Figur 2e 2f). Derfor er disse resultater viser tydeligt potentialet i nukleare PTMA som markør for at forudsige tilbagefald i HNSCC.

Verifikation af PTMA overekspression ved RT-PCR og Immunoblotting

overekspression af PTMA i planocellulært hyperplasi , dysplasi og HNSCC i sammenligning med normale mundslimhinden blev verificeret ved RT-PCR og immunoblotting i de samme vævsprøver som anvendt til immunohistokemisk analyse. Vores RT-PCR-analyse påviste øget niveauer af PTMA transkripter i planocellulært hyperplasi (H1, H2), dysplasi (D1, D2) og HNSCC (T1, T2, T3) i sammenligning med normale væv (N1, N2) (figur 3a) . Immunoblotanalyse med specifikt antistof til PTMA viste klart et enkelt intenst bånd på 12,5 kDa i helcellelysater opnået fra planocellulært hyperplasi (H1, H2), dysplasi (D1, D2) og HNSCCs (T1, T2), mens der kunne påvises intet bånd i normal mundslimhinden (N1, N2) (figur 3b). Tilsammen disse resultater bekræftede overekspression af PTMA i planocellulært hyperplasi, dysplasi og HNSCC sammenlignet med normale orale væv.

(a) RT-PCR-analyse af PTMA i normal slimhinde, planocellulært hyperplasi, dysplasi og HNSCC væv . Panel viser forhøjede niveauer af PTMA transkripter i planocellulært hyperplasi (H1, H2), dysplasi (D1, D2) og HNSCC (T1, T2, T3) sammenlignet med den normale mundslimhinden (N1, N2), der viste basale niveauer af PTMA transkripter . β-actin blev anvendt som kontrol til at normalisere mængden af ​​RNA anvendt til hver RT-PCR-reaktion er vist i det nederste panel. (B) Immunoblotanalyse: Immunoblotanalyse af PTMA i normal mundslimhinden (N1, N2), planocellulært hyperplasi (H1, H2), dysplasi (D1, D2) og HNSCC (T1, T2). Lige så stor mængde proteinlysater blev elektroforesebehandlet på 12% SDS-PAGE og overført til PVDF-membran. Membranen blev inkuberet med respektive primære antistoffer og sekundære antistoffer som beskrevet i afsnittet Fremgangsmåder og detekteres ved forøget kemiluminescens-metoden signal. Panel viser forøget ekspression af PTMA i planocellulært hyperplasi (H1, H2), dysplasi (D1, D2) og HNSCC (T1, T2) i forhold til normal mundslimhinde (N1, N2). GAPDH blev anvendt som lastning kontrol (nederste panel).

Diskussion

Kronisk betændelse i mundslimhinden kulminerer i udviklingen af ​​OPLs, hvoraf nogle fremskridt frank malignitet. I denne flertrins model af hoved og hals tumorigenese, orale læsioner såsom leukoplakia med histopatologisk tegn på dysplasi, også betragtes som præ-maligne eller potentielt maligne læsioner, er i høj risiko for progression til cancer – ofte, men ikke altid korrelerer med sværhedsgraden af epitelial dysplasi [31]. Imidlertid orale læsioner med planocellulært hyperplasi stort set er blevet udelukket fra molekylær analyse i de fleste undersøgelser. Heri demonstrerede vi, at der kan forekomme ændringer i proteinekspression i tidlige stadier af hoved og hals carcinogenese dvs. planocellulært hyperplasi, som kan forklare den forøgede proliferation. En anden stor klinisk udfordring er at vurdere prognosen for HNSCC effektivt, og derved understreger det presserende behov for biomarkører, der kan forudsige risikoen for recidiv i HNSCC. De vigtigste resultater af vores undersøgelse er: (i) signifikant stigning i nukleare PTMA udtryk i planocellulært hyperplasi og dysplasi i sammenligning med normale orale væv; (Ii) øget potentiale for nuklear PTMA at differentiere planocellulært hyperplasi, dysplasi og HNSCC fra normal mundslimhinden med høj følsomhed og specificitet; (Iii) potentiale nukleare PTMA forudsige tilbagefald i HNSCC. Så vidt vi ved, denne undersøgelse viser det første kliniske tegn på øget nukleare PTMA udtryk i præmaligne læsioner og HNSCC på stor skala. Endvidere aktuelle undersøgelse verificerede også vores tidligere rapport af forøget ekspression af PTMA protein i OPLs identificeret ved hjælp iTRAQ mærkning og væv proteomisk analyse, men i begrænset antal tilfælde [32].

signifikant forøget ekspression af nukleare PTMA i tidlige læsioner med planocellulært hyperplasi antyder dens potentiale til at identificere patienter på et tidligt stadium, før indtræden af ​​dysplasi. Dette er godt understøttet af kernekraftens rolle PTMA i regulering af cellecyklus og spredning [33]. Endvidere har øget nuklear PTMA udtryk også rapporteret som reaktion på inflammation. Især har thymosin alfa1 afledt af dets precursor PTMA blevet rapporteret at være en endogen regulator af immun homøostase der styrer inflammation, immunitet, og tolerance i en række kliniske sammenhænge [34]. Vigtigere er kronisk betændelse i vid udstrækning blevet knyttet til udviklingen af ​​HNSCC [35], og vores nuværende resultater af nukleare PTMA overekspression i planocellulært hyperplasi, dysplasi og Frank tumorer frister os til at spekulere rolle PTMA at knytte inflammation og kræft udvikling. Vi anerkender også den mulige forbindelse mellem nuklear PTMA udtryk og risiko for bekræftelse kræft udviklingsbehov i et langsigtet follow-up undersøgelse af patienter med planocellulært hyperplasi; sådanne longitudinelle studier er udfordrende, men disse patienter følges op for regelmæssig overvågning af sygdomsprogression.

Til støtte for vores resultater, Suzuki et al., rapporterede om øget nuklear PTMA udtryk med progression fra normal epitel, gennem prostata intraepitel neoplasi til karcinomer, tyder på involvering i differentiering og progression af prostatakræft [15]. Flere andre undersøgelser har også foreslået en lignende rolle for PTMA i celleproliferation som oncoprotein [5] – [7], [33], [36] – [38]. PTMA er ikke kun relateret til spredning, men er direkte involveret i processen, sandsynligvis som en tidlig komponent i spredning begivenheder udløst af de myc gener [8], [39]. Det påvirker også aktiviteten af ​​specifikke transkriptionsfaktorer, herunder østrogenreceptoren (ER), p53, p21 og signaltransducere og aktivatorer af transkription 3 [36], [40], [41]. Især er PTMA ekspression positivt reguleret af østrogen RNA-bindende protein, Hur, c-myc og E2F, mens p53 fungerer som en negativ transkriptionel regulator [40], [42] – [44]. Desuden interagerer PTMA med histoner og påvirker kromatin remodeling processer [36], [45] – [47]. Desuden har den rolle, PTMA i adhæsion, migrering og proliferation er rapporteret i human ovariecancer [48].

Vigtigst i vores undersøgelse nukleare PTMA ekspression opstod som en selvstændig dårlig prognosticator i multivariat analyse, i sammenligning med de kendte kliniske og patologiske faktorer for HNSCC herunder histologisk bedømmelse [godt differentieret (WD), moderat differentieret (MD) og dårligt differentierede (PD)], T-stadium, lymfekirtel positivitet og tumor fase. Endvidere analyse af den prædiktive potentiale PTMA afsløret sin nytte som en markør for at identificere aggressiv HNSCC, støtter foreningen observeret af Kaplan-Meier analyse og logistisk regressionsanalyse. Tilsammen disse resultater viste potentialet i nukleare PTMA som en potentiel markør til at forudsige dårlig prognose for HNSCC. Men er ikke klart forstået, biologiske rolle PTMA i HNSCC progression og tilbagefald, hvilket berettiger yderligere undersøgelser i fremtidige studier. Ændret ekspression profilering af PTMA er også rapporteret i adskillige andre maligniteter [5], [9] – [12], [14]. Overekspression af PTMA er blevet rapporteret i adskillige neoplasmer og ekspressionsniveauet er forbundet med prognosen, metastatisk potentiale og samlet overlevelse af patienterne. Dets overekspression i brystcancer er associeret med metastatiske potentiale tumor og med risikoen for dødsfald [5]. Det er blevet rapporteret som en potentiel biomarkør i tyktarmskræft [49], en tumor markør til påvisning af overgangsordning celle karcinom i urinblæren [16] og prognosticator i øvre urinveje overgangsordning celle karcinom [14].

I konklusion, blev nukleare PTMA observeret i størstedelen af ​​planocellulært hyperplasi dysplasi og HNSCC. Storstilede longitudinelle studier er berettiget til vurdering af potentialet for PTMA overekspression at identificere patienter med orale læsioner med høj risiko for udvikling af kræft. Endvidere vores undersøgelse viste betydningen af ​​nuklear PTMA som fattige prognosticator af HNSCC.

Materialer og metoder

Patienter og klinisk-patologisk dataindsamling, vævsprøver

Institutionelle Menneskelig Ethics Committee of All India Institute of Medical Sciences (AIIMS), New Delhi, Indien, godkendt denne undersøgelse, inden den påbegyndes. Et skriftligt informeret samtykke godkendt af etisk komité blev opnået fra alle deltagere i undersøgelsen. Vævsprøver blev opnået ved diagnostiske eller terapeutiske procedurer fra patienter viser træk af planocellulært hyperplasi (n = 116), eller dysplasi (n = 50) deltager i ambulatoriet af departementerne kirurgiske discipliner og Otorhinolaryngologi, AIIMS, og fra 100 HNSCC patienter gennemgår helbredende cancer kirurgi i perioden 2002-2007, efter at have indhentet patienternes samtykke. Hvor det er muligt, ikke-maligne parrede væv (n = 43) blev taget fra et sted fjernt fra kirurgisk resektion HNSCC. Ikke-maligne uparrede orale væv (n = 57) blev også indsamlet fra patienterne deltager i ambulant Institut for Dental Surgery for tandudtrækning. Tilsammen disse 100 ikke-maligne orale væv med histologiske tegn på normal epitel udgjorde den normale gruppe. Efter udskæring, væv blev straks lynfrosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -80 ° C i Research Tissue Bank Til yderligere anvendelse; en del af vævet blev også opsamlet i 10% formalin og indlejret i paraffin til histopatologisk og immunhistokemisk analyse. Den histologisk bekræftet oral normal epitel, orale læsioner med planocellulært hyperplasi eller med dysplasi, og HNSCC som afsløret ved H og E-farvning blev anvendt til immunhistokemi, som beskrevet tidligere [17]. Patienternes demografiske, kliniske og patologiske oplysninger er registreret i en pre-designet Performa som tidligere beskrevet [17], [50]. Oplysningerne dokumenteres omfattede kliniske TNM mellemstationer (tumor, node, metastase baseret på EU International Center le Cancer TNM klassifikation af maligne tumorer 2002), stedet af læsionen, histopatologiske bedømmelse (WD, MD, PD), alder, køn og tobak vaner forbrug.

opfølgning Study

syvoghalvfjerds HNSCC patienter, som gennemgik behandling 2002-2007 blev undersøgt og vurderet i hovedet-og-halscancer opfølgning klinik på ordinær tid intervaller. Overlevelse status HNSCC patienterne blev verificeret og opdateret fra registreringer af Tumor Registry, Institut Rotary Cancer Hospital, AIIMS, fra december 2009. HNSCC patienter blev overvåget i en periode på 83 måneder. Som pr hospitalets protokol beskrevet tidligere [50], [51], HNSCC patienter med T

1 og T

2 tumorer blev behandlet med kirurgi alene, mens hovedparten af ​​patienter med T

3 og T

4 sygdomme blev behandlet ved radikal kirurgi efterfulgt af postoperativ radikal strålebehandling. Patienterne blev revisited klinisk regelmæssigt og blev registreret tid til tilbagefald. Hvis en patient døde, blev overlevelsestiden censureret på dødstidspunktet; den medicinske historie, klinisk undersøgelse, og radiologisk evaluering blev anvendt til at bestemme, om dødsfaldet havde resulteret fra tilbagevendende kræft (recidiverende patienter) eller fra andre årsager. Sygdomsfri overlevende blev defineret som patienter fri for klinisk og radiologisk evidens for lokal, regional eller fjern recidiv på tidspunktet for den sidste opfølgning. Loco-regional tilbagefald /død blev observeret i 51 af 77 (66%) af patienterne overvåges under opfølgning. Tyve seks patienter, som ikke udviste tilbagefald var i live indtil slutningen af ​​opfølgningsperioden. Kun sygdomsfri overlevelse (DFS) blev evalueret i den foreliggende undersøgelse, som antallet af dødsfald som følge af sygdomsprogression tillod ikke en pålidelig statistisk analyse. Sygdomsfri overlevelse blev udtrykt som det antal måneder fra datoen for kirurgi til loco-regional tilbagefald /død.

Immunhistokemi

Paraffinindstøbte sektioner (5 um) fra mennesker normalt mundslimhinden (n = 100), planocellulært hyperplasi (n = 116), dysplasi (n = 50) og HNSCC (n = 100) blev opsamlet på gelatineovertrukne objektglas. Kort fortalt blev snittene afparaffineret i xylen, hydreret i gradient alkohol, og forbehandlet i en mikrobølgeovn i 10 minutter ved 800 W og 5 minutter ved 480 W i Tris – EDTA-puffer (0,01 M, pH = 9,0) for antigen hentning. Snittene blev inkuberet med hydrogenperoxid (0,3% v /v) i methanol i 30 min for at standse endogen peroxidaseaktivitet, efterfulgt af blokering med 1% bovint serumalbumin (BSA) til hinder ikke-specifik binding. Derefter blev objektglassene inkuberet med gede polyklonalt anti-PTMA (N-18) antistof (4 ug /ml, sc-18205, Santa Cruz Biotechnology, CA) i 16 timer ved 4 ° C. Det primære antistof blev påvist under anvendelse af streptavidin-biotin kompleks med Dako LSAB plus kit (Dako Cytomation, Glostrup, Danmark) og diaminobenzidin som chromogen [32]. Alle procedurer blev udført ved stuetemperatur, medmindre andet er angivet. Objektglas blev vasket med Tris-bufret saltvand (TBS, 0,1 M, pH = 7,4), 3-5 gange efter hvert trin. Endelig blev snittene modfarvet med Mayers hematoxylin og monteret med D.P.X mountant. I den negative kontrol vævssnit, blev det primære antistof erstattet af isotype specifik ikke-immun muse-IgG. Vævssnit fra blærecancer blev anvendt som en positiv kontrol for PTMA ekspression [12]. Sektionerne blev evalueret ved lysmikroskopisk undersøgelse under anvendelse Olympus BX51 mikroskop.

Evaluering af immunhistokemisk farvning

Hvert objektglas blev bedømt for PTMA immunfarvning under anvendelse af en semikvantitativ Pointsystemet for både farvningsintensitet og procentdelen af positive epitelceller som tidligere beskrevet [50]. Immunpositive farvning blev evalueret i tilfældigt udvalgte fem områder vævssnittet. For PTMA proteinekspression blev snit scoret som positiv, hvis epitelceller viste immunopositivitet i kernen når de observeres uafhængigt af fire af os (SCT, AM, JK, SDG), der blev blindet for det kliniske resultat (objektglassene blev kodet og holdrekorder havde ikke forudgående kendskab til det lokale tumor byrde, lymphonodular spredning, og sortering af vævsprøverne). Vævssnittene blev bedømt på grundlag af% af immunofarvede celler som: 0-10% = 0; 10-30% = 1; 30-50% = 2; 50-70% = 3 og 70-100% = 4. Sektioner blev også scoret semikvantitativt på basis af farvningsintensitet som negativ = 0; milde = 1; moderate = 2; intens = 3 [50]. Endelig blev en samlet score opnået ved at lægge score på procentvise positivitet og intensitet. Den scoring af alle fire observatører (SCT, AM, JK, SDG) var afvigende i omkring 5% tilfælde og en enighed om det endelige resultat blev nået ved revurdering af disse dias og diskussion.

Statistisk analyse

de immunhistokemiske data blev udsat for statistisk analyse ved hjælp af SPSS 13.0 software (Chicago). Følsomhed og specificitet blev beregnet og kvantificeres ved hjælp receiver operating characteristic (ROC) kurve analyse. Den prædiktive værdi (PV) beskriver andelen af ​​korrekt klassificerede sager. Baseret på sensitivitet og specificitet værdier for PTMA blev en cut-off ≥2 defineret som positive kriterium for nuklear PTMA immunopositivitet til statistisk analyse. Forholdet mellem PTMA proteinekspression og klinisk-patologiske parametre blev testet ved hjælp af Chi-Square og Fischers eksakte test. To-sidet p-værdier blev beregnet og p 0,05 blev anset for at være betydelig. Tilsvarende blev positiv prædiktiv værdi (PPV) og negative prædiktive værdi (NPV) beregnet for planocellulært hyperplasi, dysplasi og HNSCC med hensyn til normale væv.

Korrelationen af ​​PTMA farvning med patient overlevelse blev vurderet ved hjælp af livets borde konstrueret af overlevelsesdata med Kaplan-Meier-kurver [50]. Multivariat analyse blev udført ved hjælp af Cox regressionsmodel som omfattede PTMA overekspression og klinisk-patologiske parametre som alder, køn, histologisk klasse, T-scenen, nodal status og tumor stadie. Den systematiske og stringent vurdering af positive og negative prædiktive værdier (PPV og NPV henholdsvis) for prognostiske biomarkører blev udført som beskrevet tidligere [50]. For opfølgende undersøgelse af HNSCC, lad T betegne den manglende tid, det vil sige den første gang tilbagefald diagnosticeret efter kirurgisk fjernelse af tumoren. For disse data, er de positive og negative prædiktive værdier som funktioner af tiden defineret som følger: PPV

tumor (t) = Sandsynlighed (T≤t og Gentagelse | PTMA (nuklear) ≥2); NPV

tumor (t) = Sandsynlighed (T t ELLER No Gentagelse | PTMA (nuklear) 2); 0≤t≤83, Disse sandsynligheder estimeret ud fra de observerede akkumulerede forekomster i de respektive perioder [52].

Reverse Transcription-PCR

Repræsentative frosne vævsprøver af histologisk bekræftet orale normale væv (n = 5), planocellulært hyperplasi (n = 5), dysplasi (n = 5) og HNSCC (n = 5) blev anvendt til ekstraktion af totalt RNA under anvendelse af TRI-reagens (Sigma, MO) som tidligere beskrevet [53] . Første-streng cDNA blev syntetiseret ved anvendelse af 2 ug RNA med oligo dT som primeren med MMLV revers transkriptase. PCR blev udført ved anvendelse PTMA specifikke primere fremad (5′-ATGTCAGACGCAGCCGTAGACACCA-3 ‘) og revers (5′-CTAGTCATCCTCGTCGGTCTTCTGC-3’) [11]. Tyve mikroliter af hver PCR-produkt blev anvendt til elektroforese på en 1,2% agarosegel og fotograferet under anvendelse ChemiImager system.

Immunoblotanalyse af PTMA i orale væv

Whole-cellelysater blev fremstillet ud fra oral normal