PLoS ONE: Esophageal Cancer Relaterede Gene-4 er en Årehinden Plexus-Afledt Skade Respons Gene: Beviser for en bifasisk respons i ældre og yngre Brain Injury

Abstrakt

I kraft af sin evne til at regulere sammensætningen af cerebrospinalvæske (CSF), er årehinden plexus (CP) velegnet til at indlede en hurtig reaktion på traumatisk hjerneskade (TBI) ved at producere vækst regulatoriske proteiner. F.eks Esophageal Cancer Related Gene-4 (Ecrg4) er et tumorsuppressor gen, der koder et hormon-lignende peptid kaldet augurin der er til stede i store koncentrationer i CP epitel (CPE). Fordi augurin menes at regulere senescens, neuroprogenitor cellevækst og differentiering i CNS, vi evaluerede kinetikken for Ecrg4 ekspression og augurin immunoreaktivitet i CPE efter CNS skade. Voksne rotter blev såret med en gennemtrængende cortical læsion og ændringer i augurin immunoreaktivitet blev undersøgt ved immunhistokemi. Ecrg4 genekspression var præget af

in situ

hybridisering. Cell overflade augurin blev identificeret histologisk ved konfokal mikroskopi og biokemisk af sub-cellulær fraktionering. Både Ecrg4 genekspression og augurin protein niveauer blev reduceret 24-72 timer efter skaden, men restaureret til ubeskadigede niveauer ved dag 7 efter skaden. Proteinfarvning i supraoptic kerne i hypothalamus, anvendt som kontrol hjerne region, ikke udviser et fald på auguin immunreaktivitet. Ecrg4 genekspression lokaliseret til CPE-celler, og augurin protein til CPE ventrikulære ansigt. Ekstracellulær celleoverflade tøjring af 14 kDa augurin blev bekræftet ved celleoverfladen fraktionering af primære humane CPE celler in vitro, mens en kDa fragment af augurin 6-8 blev detekteret i konditionerede medier, hvilket indikerer frigivelse fra celleoverfladen ved proteolytisk behandling. I rotte CSF blev imidlertid 14 kDa augurin opdaget. Vi hypotesen den oprindelige udgivelse og proteolytisk forarbejdning af augurin deltager i aktivering fase af skade, mens vedvarende Ecrg4 nedregulering er dysinhibitory under den proliferative fase. Derfor ville augurin spille en konstitutiv hæmmende funktion i normal CNS mens nedregulering af Ecrg4 genekspression i skade, ligesom i kræft, dysinhibits spredning

Henvisning:. Podvin S, Gonzalez AM, Miller MC, Dang X, Botfield H, Donahue JE et al. (2011) i spiserøret Kræft Relaterede Gene-4 er en Årehinden Plexus-Afledt Skade Respons Gene: Beviser for en bifasisk respons i ældre og yngre Hjerneskade. PLoS ONE 6 (9): e24609. doi: 10,1371 /journal.pone.0024609

Redaktør: Colin Combs, University of North Dakota, USA

Modtaget: Juni 3, 2011; Accepteret: 14. august 2011; Udgivet: 14 September, 2011

Copyright: © 2011 Podvin et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dr. Podvin understøttes af en mentored Young Investigator Award fra Hydrocephalus Association (www.hydroassoc.org). Dr. Baird, Dr. Eliceiri og Dr. Coimbra er understøttet af en USA National Institutes of Health (www.nih.gov) P20 sonderende center Grant for Ville Healing Forskning fra USA National Institute of General Medical Sciences (www.nigms .nih.gov; P20 GM078421) og er også understøttet af National Institutes of Health (NIH) EY018479 (Dr. Baird), (NIH) HL073396 (Dr. Eliceiri) og ved supplerende finansiering gennem den amerikanske nyttiggørelse og geninvestering Act (arra ). Ingen ekstern finansiering blev modtaget for disse undersøgelser for Dr. Miller, Dr. Dang, Dr. Donahue, Dr. Rossi eller Dr. Stopa. Conrad Johanson er støttet af NIH AG027910. Alle undersøgelser på University of Birmingham af Dr. Gonzalez, Dr. Botfield, Dr. Boissaud-Cooke og Dr. Leadbeater blev finansieret af en bevilling fra School of Clinical and Experimental Medicine, College of Medical og Dental Sciences, University af Birmingham, Storbritannien (www.medicine.bham.ac.uk). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, dataindsamling og -analyse, at beslutningen om at offentliggøre eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Traumatisk hjerneskade (TBI) er ofte forbundet med dårlige kliniske resultater, fordi en over overstrømmende inflammatorisk reaktion kan forårsage utilsigtet skade på både skadede og ikke-skadede centralnervesystemet (CNS) væv [1]. Derudover er der biofysiske ændringer i CNS der begrænser funktionelle inddrivelser. For eksempel er dannelsen af ​​en glial ar efter skade beskytter neuroner fra excitotoksiske faktorer [1], [2], men blokerer synaptiske genvækst og neuroprogenitor celleinfiltration fra subventrikulære zone (SVZ) [3]. Endvidere kan ødem forstyrre blod-hjerne (BBB) ​​og blod-cerebrospinalvæske (BCSFB) barrierer, komprimere hjerneparenkym [4] og kompromis endotel- choroid plexus epithelial (CPE), ventrikulær ependymale (Ve) og subaraknoidale (SA) celler, normalt filtrere giftstoffer fra interstitiel væske, opretholde den ioniske balance i CSF, og udskiller hormoner og vækstfaktorer til at opretholde CNS homeostase [5].

CPE især lider unikke metaboliske og strukturelle spændinger i de akutte faser af CNS skade, der begrænser funktioner, der ellers ville genskabe homøostase under reparation. For eksempel vasogent ødem efter skade øger volumenet af den ekstracellulære væske rum og forårsager ventriculomegaly. Den resulterende mekaniske belastning [6] og neutrofil invasion [7] øge utætheder af BCSFB tight junctions og hamskifte af apikal cilier fra CPE og Ve celler. Endvidere forstyrret tight junctions forringer protein ultrafiltrering og føre til øget bulk og osmotisk strømning af vand ind CSF [8], [9], [10].

Blandt peptiderne produceres i og reguleret af, CPE [11], [12], augurin er en nyligt beskrevet hormon-lignende protein, som produceres efter proteolytisk behandling af

kræft i spiserøret relaterede gen-4

(Ecrg4) holoprotein [13] og menes at spille en rolle i CNS homeostase [14], [15]. Tidligere rapporter [15] har vist, at Ecrg4 genekspressionsniveauer i CNS er højest i CPE og ependym under både udvikling (www.genepaint.org [16]) og i den voksne CNS (www.brain-map.org [17] ) og har foreslået en mulig rolle for sit produkt augurin i CNS homeostase. Denne hypotese understøttes af vores observationer, at Knockdown af Ecrg4 genekspression under zebrafisk udvikling induceret celle over-spredning i udviklingslandene CNS og genererede et ventriculomegaly fænotype. I modsætning hertil Ecrg4 overekspression i voksen rottehjerne nedsat celleproliferation i SVZ’en pulje af voksne neuroprogenitor celler efter en kortikal stab model af CNS skade [14].

Her viser vi, at der sker en hurtig tab af både augurin og Ecrg4 genekspression i CPE efter CNS skade. Disse data understøtter den hypotese, at augurin spiller en konstitutiv hæmmende funktion i det normale CNS og at dens hurtig frigivelse af og efterfølgende forsvinden fra CPE efter skade kan hjælpe udløse og opretholde CNS respons på skade ved at aktivere celleproliferation.

resultater Salg

Augurin er en cellemembran-protein

immunhistokemisk analyse af augurin i periventrikulære regioner af hjernen (figur 1A, rød) viste, at i mange tilfælde, var den største intensitet af augurin immunolabeling polariseret (pil) med betydelig farvning lokalisering til den ventrikulære side af CPE-celler (rød farvning sammenlignet med DAPI nuklear farvning i blåt). Endvidere mønstret for immunreaktivitet i cytoplasmaet af CPE var granulære, hvilket kan være tegn på augurin tilstedeværelse i sekretoriske vesikler (indsat). I modsætning augurin immunreaktivitet blev ikke påvist i CP endotel eller på abluminale ansigt CPE. Dette antydede, at når først uden for cellen, kan augurin være en plasmamembran-associeret protein i kontakt med og med mulighed for udskillelse i CSF. For at afgøre om augurin er frigivet i CSF in vivo, vi behandlede rotte CSF for immunoblotting og fundet en 14 kDa bånd (figur 1B), der svarede til den forudsagte molekylvægt af augurin, den behandlede 118 aminosyre hormon-lignende peptid kodet af ECRG4 ( 31-148) [18]. En anden højere MW-bånd af ukendt identitet blev også påvist som kan afspejle peptid er overvægten for sammenlægning (upubliceret observation)

Panel A:. Immunhistokemisk evidens for tethering på celleoverfladen: Den immunoreaktive augurin genkendes af dette antistof i CP ekstrakter blev identificeret som produktet af Ecrg4 ved immunoblotting og demonstrere tilstedeværelsen af ​​et 14 kDa protein ECRG4 (31-148) behandles ved spaltning af 30 aminosyre-ledersekvensen, som vi bestemt tidligere [13]. Blandt periventrikulære celler i hjernen, blev observeret polariseret foci af punctated augurin farvning på den ekstracellulære ventrikulære flade af choroid plexus epitelcelle lag (rød, pil) i forhold til nuklear kontrastfarve (blå, DAPI). En granulær farvning mønster ses i cytoplasmaet hvis CPE cellelag, som indikerer reguleret vesikulær sekretion til celleoverfladen. Panel B: Påvisning af immunoreaktivt augurin i rotte CSF: Immunblotting af rotte-CSF viste et 14 kDa bånd (pil), som svarer til den forudsagte molekylvægt af augurin (ECRG4 (31-148)). Panel C: Biokemisk evidens for celleoverflade opbinding af augurin: Ekspression af Ecrg4 i de dyrkede CPE celler blev påvist hverken ved Western blot (venstre panel) eller ved RT-PCR af utransducerede celler (ikke vist). Således for at studere Ecrg4 in vitro var det nødvendigt at anvende en adenovirusvektor indeholdende det humane Ecrg4 ORF. Protein blev ekstraheret fra CPE celler 48 timer efter nogen transduktion eller transduktion med AD

GFP eller AD

ECRG4. Molekylvægten af ​​Ecrg4-afledte peptidfragmenter udtrykt i helcellelysater blev bestemt ved Western blotting i panelet til venstre. Celleoverfladeproteiner blev fraktioneret ved udfældning af Neutravidin-binding af biotinylerede proteiner på celleoverfladen (midterpanelet) efterfulgt af Western blot analyse. Peptidet formular secerneres fra celler blev påvist ved direkte Western blotting af konditioneret medium (højre panel).

For yderligere at behandle den subcellulære fordeling af augurin i CPE, vi biotinyleres celleoverfladen af ​​primære humane CPE celler i kultur og fraktioneret de biotinylerede proteiner via preciptiation med neutravidin perler. Vi immunblottet derefter fraktion celleoverfladen med et anti-augurin antistof [19]. Dyrkede CPE celler, ligesom mange andre celletyper i kultur, som vi har undersøgt, ikke udtrykker endogene Ecrg4 men kunne gøre det efter gen-levering med virale eller plasmidvektorer [14]. Efter infektion af CPE-celler med AD

ECRG4 blev et 14 kDa bånd detekteret i helcellelysater (figur 1C, venstre panel, bane 3). Ligeledes blev et 14 kDa protein påvist ved immunoblotting af celleoverfladeproteiner indikerer, at augurin lokaliseres til celleoverfladen (fig 1C, midterste panel, bane 3). Western blot analyse af det konditionerede medium af CPE-celler imidlertid, hvor vi tidligere viste indeholdt augurin (eller et immunoreaktivt fragment af augurin, som blev kvantificeret ved ELISA [14]), viste et immunoreaktivt peptid, der var ca. 6-8 kDa (figur 1C, højre panel, bane 3). Dette antyder, at i vores in vitro-model, peptidspaltning udgivelser (en) augurin fragment (er) fra CPE celleoverfladen. Disse data fastslår, at in vitro augurin fastholdes på celleoverfladen, og at celleoverflade proteolytisk processering frigiver en mindre peptid i medierne i forhold til, hvad der blev påvist i rotte CSF. Dette rejste muligheden for, at to forskelligt forarbejdede former for augurin kan kaste af CPE celler og kunne være tegn på to peptid productes hver med en distince aktivitet. Ingen immunoreaktivitet blev påvist i hele cellelysater, celleoverfladen fraktioner eller konditioneret medium af enten utransducerede eller AD

GFP transducerede celler (Figur 1C, bane 1 og 2).

Augurin fordeling i choroideus plexus ændringer efter CNS skade

Vi brugte en kortikal læsion model af CNS skade [20] for at vurdere, om skaden sker Ecrg4 genekspression og augurin immunoreaktivitet i den laterale ventrikel cps. Kontrol- og sårede rotter blev dræbt ved 1, 3 og 7 dage efter at have udført en 3 mm dyb læsion i den højre cerebrale cortex, lateral til ventriklerne. Som vist i figur 2 observerede vi ved konfokal mikroskopi at der var signifikant diffus farvning i det normale, intakt laterale ventrikel CP der dukkede op i mange CPE celler, der skal polariseres mod apikale, ventrikulær vendende overflade af epitelcellerne og med afbrudte områder af immuno etiket (figur 2A). Når evalueret 24 timer efter beskadigelse (figur 2B) den immunfarvning signalet var næsten fraværende, selv om der var nogle immunoreaktivitet findes i isolerede foci. Selv der dog optrådte den samlede intensitet af farvning faldt. Ved 3 dage efter skaden (figur 2C) blev immunfarvning stadig faldt sammenlignet med kontrol ubeskadigede dyr, men det syntes mere homogent fordelt i CP sammenlignet med farvning 1 dag efter læsionen. Ved 7 dage, intensiteten af ​​farvning var nu ikke skelnes fra kontrol- hjerner og der var en kombineret mønster af polariseret apikale og fokal punktformet farvning med en mere diffus mønster af augurin immunoreaktivitet. Taget sammen antyder disse data at augurin blev mobiliseret umiddelbart efter CNS skade og formentlig frigivet i CSF.

En kortikale stiksår faldt augurin proteinniveauer i den kontralaterale CP som bestemt ved immunhistokemisk farvning og konfokal mikroskopi. Den oftalmologiske kniv trængte rotte dorsale cortex til transektere hjernebjælken 3 mm dybe og laterale til højre laterale ventrikel. Immunreaktive augurin proteinniveauer i den kontralaterale CP mindskedes ved 24 timer (felt B) og 3 dage (panel C) efter skaden sammenlignet med intakte kontroldyr (diagram A). Ved 7 dage efter læsion augurin protein var vendt tilbage til omtrent samme niveau som intakte kontroller. Billeder repræsentative for n = 3 rotter.

Ecrg4 er en skade respons gen

Den langsigtede tab af immunoreaktivt augurin i CPE celler efter kortikal læsion kunne tilskrives enten (1) kontinuerlig og fremskyndede sekretion-og-frigivelse af augurin nedbrydende intracellulære butikker eller (2) tabt augurin gennem reduceret genekspression. Derfor brugte vi in ​​situ hybridisering til at evaluere genekspression i choroid plexus efter beskadigelse (figur 3). Et antisense-probe med rotte Ecrg4 mRNA viste et stærkt signal i ubeskadigede kontrol rottehjerner som lignede mønsteret observeret for immunhistokemisk farvning (figur 3A). Signalet optrådte begrænset til CPE-celler og som med proteinet, blev signalet tabt 24 timer efter beskadigelse (figur 3B) og forblev så igennem til 3 dage (figur 3C), hvorefter det dukkede igen op ved 7 dage (figur 3D) til niveauer svarende til dem i kontroldyr. Signalet påvises i kontroldyr og 7 dage efter skaden blev også anset specifik, fordi ingen hybridisering blev detekteret i CP sektioner fra sham eller syv dage efter læsion dyr, der blev behandlet med en syntetisk kontrolprobe (figur 3E og F). Sammen antyder disse data, at Ecrg4 er en tidlig skade respons-gen, og at tabet af augurin er bifasisk: første grund til bulk frigivelse fra celleoverfladen og intracellulære opbevaring vesikler og det andet, på grund af tabet af Ecrg4 genekspression hele proliferative fase af skade.

Kortikal stikke sår faldt genekspression niveauer i CP som bestemt af

in situ

hybridisering. Den oftalmiske kniv trængte rotte dorsale cortex til transektere corpus callosum 3 mm dyb og lateralt til højre laterale ventrikel og Ecrg4 genekspression vurderet ved binding af et Ecrg4 mRNA antisense probe i den kontralaterale CP i intakte rottehjerner (Panel A), 24 hrs (Panel B) 72 timer (felt C) og 7 dage (panel D) efter skaden. En syntetisk, negativ kontrol-mRNA-probe blev genereret fra pSPT18-Neo plasmid kontrol rygrad og blev anvendt til at vurdere baggrundssignal i kontrol (panel E) og 7 dag (Panel F) sektioner. Billeder repræsentative for n = 3 rotter.

Augurin distribution i supraoptic kerne (SON) reduceres ikke, efter CNS skade

For at undersøge om augurin niveauer ændrer sig i et mønster, der svarer til den CPE efter kortikal læsion, vi kiggede for immunoreaktivitet i et andet område af hjernen med høje niveauer af augurin og Ecrg4 udtryk, søn af hypothalamus [21]. Vi fandt ikke noget fald i ekspression ved 1 og 3 d.p.i. i beskadigede rotter (figur 4B og C) sammenlignet med kontrol figur 4A). Denne regionale sammenligning angiver nedsat mængde augurin ved 1 og 3 d.p.i. er ikke en global reaktion i hjernen, og yderligere sammenligninger af anatomiske områder vil afgøre, om dette særlige mønster er unik for CPE som respons på CNS-skade.

For at demonstrere specificiteten af ​​skade respons i CPE i modsætning til andre regioner af hjernen, der har høje niveauer af Ecrg4 genet og augurin proteinekspression [21], undersøgte vi SØN af hypothalamus i tilskadekomne rotter ved en (B Panel), 3 (Panel C) og 7 (panel D) dpi og sammenlignet farvning i intakt hjerne (Panel A). Selv om der kan have været en lille incrase ved 3 og 7 d.p.i. blev den bratte nedgang i udtryk, der fandt sted i CPE efter skade ikke observeret i SØN. Billeder repræsentative for n = 3 rotter.

Diskussion

De data, der præsenteres her, fastslå, at CP-afledte Ecrg4 er en skade respons gen. Først CNS skade udfældes et hurtigt tab af Ecrg4 genekspression inden for 24 timer skade, og det forblev vedvarende i 7 dage, på hvilket tidspunkt skaden er begyndt at løse [22]. Den umiddelbare reaktion var imidlertid formentlig en indledende bulk-frigivelse af augurin fra CPE celleoverfladen efterfulgt af mere vedvarende sekretion og frigivelse af de intracellulære lagre af augurin. Funktionen af ​​denne bulk-udgivelse i den tidligste fase af skaden er ikke kendt, men det blev efterfulgt af en udtømning af immunoreaktivitet under midten af ​​fase af skade, der blev forværret af en nedregulering af Ecrg4 genekspression, der er opretholdt i hele den proliferative fase af CNS skade igennem til resolution på dag 7.

Ecrg4 genet er en kandidat tumorsuppressorgen der har vundet stor opmærksomhed på grund af den inverse sammenslutning af genekspression med væksten og udviklingen af ​​epitelial kræft [23], [ ,,,0],24]. Nedregulering medieres af sin epigenetisk inaktivering via DNA methylering af Ecrg4 promotoren [25], [26], [27]. For nylig Ecrg4 genekspression er også blevet omvendt korreleret med kræft progression og invasivitet [27], anti-inflammatorisk genregulering gennem NF-KB [25], celleproliferation i SVZ’en [15] og direkte korreleret med øget senescens i CNS [ ,,,0],15] og endokrine regulering af perifer hydro-mineral balance [21], [28]. Dens åbne læseramme (ORF) koder for et 148 aminosyrer stort protein, der er stærkt konserveret blandt arter og har sekundær struktur motiver, der kendetegner neuropeptider [13]. database mining viser imidlertid, at Ecrg4 ikke er en del af en større familie af relaterede gener. Dette kunne tyde stram evolutionære kontrol blandt Ecrg4 ortologer og en unik biologisk funktion.

Faldet i augurin protein (figur 2) og Ecrg4 genekspression (figur 3) forekommer på tidspunkter, hvor cellerne formere sig under normale CNS skade respons [29]. Tidsforløbet for nedsat augurin korrelerer med de akutte og sub-akutte svartider til CNS skade [1], som både gen og proteinekspression er faldet med 1 til 3 dage efter skaden, men vende tilbage til ubeskadigede niveauer ved dag 7. Dette er i overensstemmelse med vores tidligere demonstration [14], at Ecrg4 genekspression er høj i den normale CP og at Ecrg4 overekspression kompromiser neuroprogenitor cellevækst og differentiering. Resultaterne præsenteret her antyder, at augurin kan være som en “sentinel” hvile faktor, hvis konstituerende tilstedeværelse er hæmmende, men hvis fravær bliver et dysinhibitory signal, der gør det muligt for proliferative respons på skade.

Det faktum, at Ecrg4 genekspression er epigenetisk reguleret af DNA-methylering hæver den interessante mulighed at de konstitutive niveauer af augurin i CP kan styres epigenetisk samt. Hvis det er tilfældet, vil DNA methylering af Ecrg4 kontrollere mængden af ​​basal augurin der er konstitutivt til stede og til rådighed for frigivelse under den akutte fase af skade. Betydningen af ​​denne hypotese er ikke klart, men det kan betyde, at DNA-methylering også kunne måle afkastet af genekspression under opløsning fase af skade. Lignende epigenetiske modifikationer i DNA-methylering er nu godt beskrevet efter CNS iskæmi og skade [30]. Hvis tilbageførsel af sådanne ændringer påvirker inddrivelse af augurin ekspressionsniveauerne, så i betragtning af virkningerne af Ecrg4 gen banke ned og over udtryk [30], neuroprogenitor lydhørhed over for skade kunne blive væsentligt påvirket.

Det er særligt bemærkelsesværdigt, at , mens augurin ligner andre peptidhormoner, at den er konstitutivt produceret af CPE for udskillelse i CSF [22], er det også forskellig fra peptidhormoner i denne celle overflade tethering (figur 1C) minder om parakrine faktorer som epidermal og fibroblast vækstfaktorer, hak, takkede og ephriner [31], [32], [33], [34]. Vi [14] og andre [15] har tidligere beskrevet en frigivelse af augurin i konditioneret medium efter transduktion med Ecrg4 transgen, og vi har nu vist påvisning af en 14 kDa form rotte CSF, de første beviser for secerneret augurin in vivo. Vores fund af to forskellige former for augurin produceret af CPE, 6 kDa (in vitro) og 14 kDa (in vivo), hæve muligheden for forskellige ordninger for frigørelse. Det faktum at der blev opdaget to forskellige immunoreaktive former kunne være en konsekvens af cellebiologi ændres ved celledyrkning proces, og det er muligt, at 6 kDa som respons på skade udskilles til CSF, mens 14 kDa formen i figur 1 B er konstitutivt frigives. Det fundne isoform kunne være afhængig af celletype og betinget: vi har opdaget begge isoformer i konditioneret medium af transducerede dyrkede prostata epitelceller (XD, manuskript bedømmelsesudvalg) og kDa formen i en ex vivo model for inflammation 6 (AK, manuskript som forberedelse). Figur 1C understøtter den hypotese, at en tøjret 14 kDa form skur ved proteolyse i medierne. Den form, CSF dog (figur 1B) kunne frigives ved (1) fjernelse af membranen anker, (2) konstitutiv frigivelse fra ER /Golgi-vejen eller (3) af en anden celletype for oprindelse.

tabet af augurin immunreaktivitet i CPE væv efter skade antyder, at der er tre puljer af augurin: (1) peptid frigives til biologiske væsker, såsom CSF, (2) protein tilbageholdt på celleoverfladen og (3) peptider opbevaret i intracellulære vesikler. Den umiddelbare reaktion på skaden formentlig behandler ved celleoverfladen og fulgte hurtigt ved augurin frigivelse fra intracellulære opbevaring vesikler. Genekspressionsniveauer efter beskadigelse (figur 3) spejl proteinniveauer (figur 2) tyder på, at augurin frigives kort efter skaden ikke genopfyldes. Den iagttagelse, at en mindre, forarbejdet form af augurin findes i konditionerede medier (figur 1B, panel 3) antyder, at proteolyse og forarbejdning forekommer på tidspunktet for celleoverfladen udgydelse. Den biologiske funktion, om nogen, af disse fragmenter ikke er kendte, men de kan være forskellig fra intakt augurin tøjret ved celleoverfladen (figur 5). Salg

Normale choroid plexus epiteler udtrykker Ecrg4 og indeholder signifikant 14 kDa augurin protein, som er i en inhiberende konformation. Den ubehandlede peptid indeholdt i 3 rum (1) intracellulære vesikler (dvs. punktformig intracellulær farvning i figur 1) (2) nær den ventrikulære celleoverfladen (dvs. polariseret apikal farvning af celler i figur 1 og (3) bindes ved celleoverfladen ( dvs. figur 1B). ved skade, er den pludselige frigivelse og forarbejdning ved celleoverfladen efterfulgt af frigivelse fra intracellulære lagre som en “panik signal” for at indikere systemisk skade. den oprindelige pro-inflammatorisk reaktion slår derefter Ecrg4 genekspression i mindst 1 til 3 dage efter skaden. Derfor i den indledende fase af skade, dets normale, konstitutivt hæmmende funktioner er fraværende, og så reparere cellerne formere sig. Som genekspression afkast, er hvile restaureret og homøostase genetableret.

resultaterne præsenteret her er forenelige med dobbelt funktion model af augurin aktivitet (figur 5). Augurin fungerer normalt som et kontroldyr inhibitorisk faktor, der er konstitutivt til stede på epitelcelle overflade, men på tidlige tidspunkter efter skade, augurin fragmenter fra celleoverfladen kan være et tilladelsessignal til aktivering skade. Den lokale fald i augurin fusion ville dysinhibit proliferation og migration af neuroprogenitor celler i SVZ. Faktisk augurin overekspression i CP og ependym nedsætter BrdU optagelse og nestin immunreaktivitet her, hvilket indikerer, at CPE-afledte augurin regulerer spredning og levetid neuroprogenitors [3], [35], [36]. Dens dysinhibition kunne hjælpe aflede stamfader migration til skaden websted fra rostralt vandrende strøm [3], [35], [36]. Hvis det er tilfældet, kunne det epigenetisk regulering af Ecrg4 genekspression i CP hjælpe guage den fine balance mellem neuroprogenitor celle mobilisering i SVZ’en til reparation og undertrykkelse af voksen hæmning. . Yderligere kinetiske analyser af augurin distribution og Ecrg4 udtryk i de akutte og kroniske faser af genopretning fra kortikale læsioner vil tage fat denne mulighed.

Materialer og metoder

Dyr

Alle undersøgelser ved hjælp rotter blev udført med forudgående godkendelse af, og i overensstemmelse med, enten Institutional Animal Care og brug Udvalg på Brown University (Providence, RI, godkendelsesnumre 0062-07 og 0073-10), eller indenrigsministeriet på Birmingham University (Edgbaston, UK , godkendelsesnummer 3012720-19b2). Alle overlevelse operationer blev udført under aseptiske forhold. Væv blev høstet fra voksne Sprague Dawley rotter holdt i standard lys /mørke forhold med

ad libitum

adgang til mad og vand. For hjernevæv høst blev rotterne dræbt af CO

2 inhalation og straks perfunderet med 4% paraformaldehyd (PFA) i phosphatbufret saltvand (PBS). Hjerner blev fjernet og yderligere fikseret natten over i PBS indeholdende 20% saccharose og 4% PFA ved 4 ° C. De, hjerner blev inkuberet i PBS indeholdende 30% saccharose natten over og frosset i OCT-forbindelse på tøris og opbevaret ved -80 ° C indtil yderligere forarbejdning.

Antistoffer Salg

Immunofluorescens.

Et polyklonalt IgY antistof blev rejst i kyllinger mod rekombinant humant ECRG4 (71-148) og antigen affinitet renses ved kommerciel kontrakt med Genway Biotech, Inc., (San Diego, CA). Oprenset præimmun IgY fra det samme dyr blev anvendt som en negativ kontrol i immunfarvning af rotte hjernevæv og gede-anti-kylling-AlexaFluor® 594 (Life Technologies, Carlsbad, CA) blev anvendt til detektion. Western blotting: Affinitetsoprenset kanin-anti human ECRG4 primært antistof (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) og gede-anti-kanin-peberrodsperoxidase (HRP) konjugeret sekundært antistof (JacksonImmuno Labs, West Grove, PA) blev anvendt til at detektere protein i Western blotting-analyse.

Virale vektorer

en adenovirusvektor indeholdende et transgen for det humane Ecrg4 ORF (AD

ECRG4) blev fremstillet som tidligere beskrevet. Et adenovirus, der indeholder transgenet for grønt fluorescerende protein (AD

GFP, Vector Biolabs, Philadelphia, PA) blev anvendt som kontrol.

Cell Culture

Et primært human CP epitelcellelinie blev købt fra ScienCell Research Laboratories (Carlsbad, CA) og dyrket i epitelcelle Medium ifølge producentens anvisninger. For adenovirus infektion blev konfluente celler talt og transduceret med en infektionsmultiplicitet (MOI) på 20.

Penetrerende CNS Læsion Model

Rotter blev bedøvet med 5% isofluran i oxygen (1,7 L /min) og givet 0,3 mg /kg buprenorphin subkutant for analgesi før CNS skade. Anæstesi blev vurderet ved paw pinch refleks. Kraniet blev først eksponeret med en sagital indsnit langs midterlinien af ​​hovedet og efter oprettelse af en borehul gennem dura med et tandlægebor blev en læsion gjort 3 mm ret bregma, 7,5 mm rostralt af øret-bar planet og 3 mm dyb anvendelse af en oftalmisk kniv (Unitome kniv, BD Waltham, MA). Den skade påført gennemskæres corpus callosum og kniven sår ind i striatum. Vi har anvendt denne skade model udførligt i andre undersøgelser [37], [38], [39], [40]. Intakte rotte hjerner fra un-opererede dyr blev anvendt som kontroller.

Indsamling af rotte CSF

CSF prøver fra voksne Spragu-Dawley rotter blev indsamlet som tidligere beskrevet [41]. Kort fortalt blev rotter bedøvet dybt i en stereotaktisk ramme med hovedet hævet over kroppen. Et snit blev foretaget fra toppen af ​​hovedet til bunden af ​​halsen. Musklen blev trukket tilbage fra omkring bunden af ​​kraniet. Ved hjælp af en Hamilton-sprøjte, blev CSF trukket tilbage fra cisterna magna og straks frosset på tøris. Rotter blev derefter dræbt af terminal anæstesi.

celleoverfladeprotein Fraktionering og Immunoblotting

Primære humane CPE celler blev inficeret med AD

ECRG4 eller AD

GFP en MOI på 20 til overekspression enten Ecrg4 eller GFP. Celleoverfladeproteiner var biotinyleret og trækkes ned ved hjælp celleoverfladeproteinet Isolation Kit ifølge producentens anvisninger (Pierce, Rockford, IL). Udfældede proteiner blev elueret fra NEUTRAVIDIN perlerne ved inkubering i 2% lithiumdodecylsulfat prøvepuffer under reducerende betingelser i en time ved 25 ° C. Immunoreaktivt protein blev detekteret ved Western blotting. Kort fortalt proteiner var størrelsesfraktioneret på en 4-12% Bis-Tris-gel til SDS-PAGE. Proteiner blev overført til 0,2 um polyvinylidenfluoridmembran, som blev blokeret med 5% bovint serumalbumin (BSA) opløsning i en time ved 25 ° C. Kanin-anti-humant augurin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) blev fortyndet i 1% BSA i en koncentration på 0,5 ug /ml og inkuberet med membranen natten over ved 4 ° C. Efter vaskninger med PBS indeholdende 0,05% Tween-20 blev membranerne inkuberet med 0,1 ug /ml gede-anti-kanin-HRP sekundært antistof fortyndet i 1% BSA i én time ved 25 ° C, skyllet og derefter inkuberet med Super Signal West Pico