PLoS ONE: RUNX3 Har et onkogent rolle i hoved- og halscancer

Abstrakt

Baggrund

Runt-relaterede transskription faktor 3 (RUNX3) er en tumor suppressor af kræft og synes at være en vigtig del af den transformerende vækstfaktor-beta (TGF-ß ) -induceret tumor suppression pathway. Overraskende fandt vi, at RUNX3 ekspressionsniveau i hoved og hals pladecellecarcinom (HNSCC) væv, som er en af ​​de mest almindelige typer af human cancer, var højere end i normale væv ved en tidligere offentliggjort microarray datasæt i vores indledende undersøgelse. Derfor her undersøgte vi den onkogene rolle RUNX3 i HNSCC.

vigtigste resultater

Hyppig RUNX3 udtryk og dets overensstemmelse med ondartet adfærd blev observeret i HNSCC. Ektopisk RUNX3 overekspression fremmet cellevækst og inhiberede serumudsultning-induceret apoptose og kemoterapeutisk lægemiddel induceret apoptose i HNSCC celler. Disse resultater blev bekræftet ved RUNX3 knockdown. Endvidere RUNX3 overekspression forbedret tumorsphere formationen. RUNX3 ekspressionsniveauet var godt korreleret med status for methylering i HNSCC celler. Desuden RUNX3 ekspression var lav på grund af methylering af dets promotor i normale orale epitelceller.

Konklusioner /Signifikans

Vores resultater tyder på, at i) RUNX3 har et onkogent rolle i HNSCC, ii) RUNX3 udtryk observeret i HNSCC kan til dels være forårsaget af demethylering under udvikling af kræft, og iii) RUNX3 udtryk kan være en nyttig markør til at forudsige ondartet adfærd og effekten af ​​kemoterapeutiske stoffer i HNSCC

Henvisning:. Tsunematsu T, Kudo Y, Iizuka S, Ogawa I, Fujita T, Kurihara H, et al. (2009) RUNX3 Har et onkogent rolle i hoved- og halscancer. PLoS ONE 4 (6): e5892. doi: 10,1371 /journal.pone.0005892

Redaktør: Torbjørn Ramqvist, Karolinska Institutet, Sverige

Modtaget: Februar 4, 2009; Accepteret: 15. maj 2009; Udgivet: 12 juni 2009

Copyright: © 2009 Tsunematsu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forskningen blev støttet af tilskud-in-støtte fra Ministeriet for uddannelse, videnskab og kultur of Japan (YK og TT) og Satake uddannelse og forskning tilskud (YK). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

RUNX3 /Aml2 /PEBP2C /CBFA3 er en transskription faktor og en af ​​Runt-relaterede (RUNX) familie. Tre medlemmer af Runx familien generne,

RUNX1

,

RUNX2

RUNX3

og relateret gen,

CBFB /Pebpb2

, er alle kendt som de udviklingsmæssige regulatorer og har vist sig at være vigtig i humane cancere [1]. RUNX3 blev oprindeligt klonet som Aml2 og er lokaliseret på kromosom 1p36.1 [2]. RUNX3 har flere funktioner og er ved først rapporteret at korrelere med tilblivelsen og progression af human gastrisk cancer som en tumor [2] lyddæmper. RUNX3-null mus udviser hyperplasi af maveslimhinden som følge af stimuleret proliferation og undertrykt apoptose af epitelceller [3]. Faktisk er RUNX3 inaktiveret i mere end 80% af human gastrisk cancer ved gendæmpning og protein mislocalization [4]. Udover gastrisk cancer, er det blevet beskrevet at en reduceret ekspression af RUNX3 blev observeret i forskellige cancerformer, herunder blære, lever, tyktarms- og lungekræft [5] – [8]. I disse tumorer blev reduceret ekspression af RUNX3 ofte forårsaget af CpG island hypermethylering [9]. Desuden punktmutationer af

RUNX3

blev observeret i visse typer af humane kræftformer, herunder mave- og blære kræft [3], [5]. Tilsammen RUNX3 virker som en tumorsuppressor i forskellige cancerformer.

Hoved og hals pladecellecarcinom (HNSCC) er en af ​​de mest almindelige typer af human cancer, med en årlig incidens på mere end 500.000 tilfælde på verdensplan [ ,,,0],10]. Som de fleste epiteliale cancere, HNSCC udvikler gennem akkumulering af multiple genetiske og epigenetiske ændringer i en multi-trins proces [11]. Overraskende fandt vi, at RUNX3 udtryk niveau i HNSCC væv var højere end i normale væv ved en tidligere publiceret microarray datasæt af 41 HNSCC patienter og 13 normale kontroller i vores indledende undersøgelse [12] (figur 1A). Interessant det for nylig er blevet rapporteret, at RUNX3 overekspression blev observeret i basalcellecarcinom af hud [13]. Derfor troede vi, at RUNX3 kan have en onkogen rolle i HNSCC samt i basalcellekræft i huden. I den foreliggende undersøgelse undersøgte vi udtryk og roller RUNX3 for HNSCC udvikling

A:. Total RNA fra 41 primære HNSCC og 13 normale væv var mærket og hybridiseret til Affymetrix U133A Gene Chips som tidligere rapporteret. Graf viser gennemsnittet af signal intensitet RUNX3 i 41 HNSCC og 13 normale væv i microarray analyse. RUNX3 udtryk niveau i HNSCC er højere end for normale væv. B: Angivelse af RUNX3 mRNA i 14 HNSCC cellelinjer (HSC2, HSC3, HSC4, Ca9-22, Ho-1-N-1, Ho-1-U-1, ZA, HOC719-PE, HOC719-NE, ​​HOC621, HOC119, HOC313, TSU og OMI) ved RT-PCR. GAPDH blev anvendt som kontrol. C: Ekspression af RUNX3 mRNA i forskellige cancercellelinier, herunder coloncancer (RKO og HCT116), gastrisk cancer (MKN-1 og MKN-45), leukæmi (HL60), lymfom (U937) og brystcancer (MCF7 og SK-BR3 ). GAPDH blev anvendt som kontrol. D: Ekspression af RUNX3 mRNA i 18 HNSCC tilfælde ved RT-PCR. GAPDH blev anvendt som kontrol. E: Ekspression af RUNX3 protein i 6 HNSCC cellelinier (HSC2, HSC3, HSC4, Ca9-22, HO-1-N-1 og Ho-1-U-1) blev undersøgt ved Western blot-analyse. CUL1 udtryk blev anvendt som en loading kontrol.

Materialer og metoder

Reagenser

transformerende vækstfaktor SS1 (TGF-ß), basisk fibroblastvækstfaktor (bFGF ) og blodplade-afledt vækstfaktor-AA (PDGF-AA) blev opnået fra R 5′-CAGAAGCTGGAGGACCAGAC-3 ‘og revers primer; 5’-TCGGAGAATGGGTTCAGTTC-3 ‘. GAPDH blev anvendt som kontrol. Portioner af total cDNA blev amplificeret med gå Taq® Green Master Mix (Promega), og amplificeringer blev udført i en PC701 thermocycler (Astec, Fukuoka, Japan) i 30 cykler efter en indledende 30 sek denaturering ved 94 ° C, udglødet i 30 sek ved 60 ° C, og forlænget i 1 min ved 72 ° C i alle primere. Amplifikationsreaktionen produkterne opløst på 1,5% agarose /TAE-geler (Nacalai tesque, Inc., Kyoto, Japan), elektroforesebehandlet ved 100 mV, og visualiseret ved ethidium-bromid-farvning.

Western blot-analyse

Western blotting blev udført som vi beskrev tidligere [14]. Et anti-RUNX3 monoklonalt antistof (R3-5G4, venligst stillet til rådighed af Dr. Ito, Institut for Molekylær og Cell Biology, Singapore), anti-FLAG monoklonalt antistof (M2, Sigma) og anti-CUL1 polyklonalt antistof (Zymed) blev anvendt. Tredive ug protein blev underkastet 10% polyacrylamidgelelektroforese efterfulgt af elektroblotting på et nitrocellulosefilter. Til påvisning af immun-komplekset, ECL western blotting påvisning systemet (Amersham) blev anvendt.

Immunohistokemisk farvning

Immunhistokemisk påvisning af RUNX3 i HNSCC tilfælde blev udført på 4,5 um snit monteret på silicium overtrukne objektglas under anvendelse af en streptavidin-biotin peroxidase teknik som tidligere beskrevet [14]. Immunhistokemisk påvisning af RUNX3 i humane forskellige kræfttilfælde herunder 3 spiserør kræft, 3 gastrisk kræft, 3 kolon kræft, 3 rektum kræftformer, 3 bugspytkirtel kræft, 3 leverkræft, 3 lungekræft, 3 nyre kræft, 3 blære kræft, og 4 livmoderen kræft blev udført under anvendelse af væv microarray (MBL Co. Ltd., Nagoya, Japan). For immunhistokemisk undersøgelse blev en anti-RUNX3 monoklonalt antistof (R3-6E9, venligst stillet til rådighed af Dr. Ito, Institut for Molekylær og Cell Biology, Singapore), der anvendes. Til immunhistokemisk undersøgelse af musevæv blev et anti-RUNX3 monoklonalt antistof (R3-1E10, MBL Co. Ltd.) anvendes. Ekspressionen af ​​RUNX3 blev klassificeret som positive (over 5% af tumor eller epitelceller viste immunopositivitet) og negative (mindre end 5% af tumor eller epitelceller viste svag eller fokal immunopositivitet eller ingen farvning). Tre patologer (Y.K., I.O., og T.T.) gjorde alle vurderingerne. Mulig sammenhæng mellem variabler af de analyserede tumorprøver blev testet for association af Fishers eksakte test. En

P Drømmeholdet værdi 0,05 var påkrævet for signifikans

5-aza-2′-deoxycytidin behandling

HSC4 celler og normale epitelceller blev behandlet med medium indeholdende 300 nM. 5-aza-2′-deoxycytidin (5-aza-dC, Sigma) i 72 timer. Efter behandling blev cellerne opsamlet og undersøgt ekspressionen af ​​RUNX3 mRNA ved RT-PCR.

bisulfit modifikation og methyleringsspecifik polymerasekædereaktion (PCR)

Genomisk DNA fra celler eller væv blev ekstraheret ved hjælp af DNeasy Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland). Halvtreds mikroliter af supernatanten blev anvendt direkte som kilde til DNA for natriumbisulfit behandling. DNA-prøver blev behandlet med bisulfit til at konvertere alle umethylerede cytosiner til uraciler samtidig giver methylerede cytosiner upåvirket. DNA blev denatureret ved NaOH (slutkoncentration, 0,2 M) i 10 minutter ved 37 ° C. Tredive pi 10 mM hydroquinon (Sigma) og 520 pi 3 M natriumbisulfit (Sigma) ved pH 5,0 både frisk fremstillet, blev tilsat og blandet, og prøver blev inkuberet ved 50 ° C i 16 timer. Modificeret DNA blev oprenset under anvendelse Wizard DNA oprensning harpiks (Promega) og elueret i 50 pi vand. Modifikation blev afsluttet ved NaOH (slutkoncentration, 0,3 M) behandling i 5 minutter ved stuetemperatur, efterfulgt af ethanoludfældning. Modificerede DNA’er blev amplificeret i en 20 pi reaktionsvolumen indeholdende 2 pi 10 x PCR-puffer med 15 mM MgCl2, 4 pi 5xQ-opløsning, 10 pM hver primer, 0,2 mM dNTP’er og 0,75 U Taq-polymerase (Hotstar Taq DNA polymerase; Qiagen, Hilden, Tyskland). Efter at blandingen blev opvarmet ved 95 ° C i 15 minutter blev PCR udført i et termisk cykliseringsapparat (GeneAmp 2400, PE Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) i 35 cykler med denaturering ved 94 ° C i 30 sekunder, annealing ved 58 ° C i 60 sek og ekstension ved 72 ° C i 60 sek, efterfulgt af en endelig 10 min forlængelse ved 72 ° C. PCR-produkterne blev separeret på en 8% ikke-denaturerende polyacrylamidgel. RUNX3 CpG øen og analyserede regioner (nr 1-10) er vist i figur 2B. De primersæt anvendt i denne undersøgelse var opført i tabel S1 (GenBank accession nummer AL023096) [15]

A:. Ekspression af RUNX3 blev undersøgt i huden epitel (× 100 og × 250, øvre panel), normal mundtlig slimhinder (× 100 og × 250, midterste panel) og normal oral slimhinder med infiltration af kroniske inflammatoriske celler (× 100 og × 250, nederste panel). I huden epitel, nogle af epidermale celler viste RUNX3 ekspression i sine kerner. I normale orale slimhindevæv, kun nogle få epitelceller i basale lag udtrykt RUNX3 i deres kerner, og de fleste epitelceller udtrykte ikke RUNX3. I normal oral slimhinde med infiltration af kroniske inflammatoriske celler, lymfocytter infiltrerer ind mundslimhinden viste RUNX3 ekspression. B: Angivelse af RUNX3 blev undersøgt i HNSCC tilfælde (× 100). De fleste cancerceller udtrykte RUNX3 i deres kerner.

Generation of RUNX3-overekspression HNSCC celler

En RUNX3 ekspressionsplasmid, pcDNA3 kodning FLAG tagged RUNX3 cDNA, blev venligst stillet til rådighed af Dr. Ito (Institut for Molekylær og Cell Biology, Singapore). Den RUNX3 /pcDNA3 plasmid eller vektoren alene blev indført i HSC3 celler, og derefter G418 (500 ug /ml, Gibco) tilsat til dyrkningsmediet efter 48 timers transfektion. Efter 2 ugers G418-selektion, vi opnåede de stabile pool kloner. Celletransfektioner blev udført under anvendelse FuGENE 6 (Roche) ifølge producentens instruktion.

Silencing af små interfererende RNA

logaritmisk voksende Ca9-22 celler blev podet ved en densitet på 10

5cells /6 cm skål og transficeret med oligoer to gange (ved 24 og 48 timer efter udpladning) under anvendelse Oligofectamine (Invitrogen) som beskrevet [16]. Otteogfyrre timer efter den sidste transfektion blev lysater fremstillet og analyseret ved SDS-PAGE og immunoblotting. SiRNA er en 19-bp duplex oligoribonucleotid med en sense streng svarende til nucleotiderne 275-293 af humant RUNX3 mRNA-sekvens; 5′-ccuucaaggugguggcauu-3 ‘. En forvrænget sekvens, der ikke viser signifikant homologi med rotte-, muse- eller humant gensekvenser blev anvendt som kontrol.

Flowcytometrisk analyse

cellecyklusfordeling blev bestemt ved DNA-indhold analyse efter propidiumiodid farvning. Celler blev dyrket som beskrevet ovenfor, og fikseret i 70% ethanol og opbevaret ved 4 ° C før analyse. Flowcytometrisk bestemmelse af DNA-indhold blev analyseret ved en FACS Calibur (Becton-Dickinson, San Jose, CA) flowcytometer. For hver prøve blev 20.000 begivenheder gemt.

Annexin V og propidiumiodid Dual-Farvning Assay

Efter serum sult eller Dox behandling, cellerne blev derefter farvet med fluorescein (FITC) -konjugeret annexin V og propidiumiodid (PI) ved anvendelse af annexin V-FITC Apoptosis Detection kit (Becton-Dickinson) ifølge producentens instruktioner. Apoptotiske celler blev identificeret ved dobbelt farvning med rekombinant FITC-konjugeret med Annexin V og propidiumiodid (PI). indsamling og analyse af data blev udført i en FACSCalibur (Becton-Dickinson) flowcytometer bruge CellQuest software.

Resultater

Highly udtryk for RUNX3 i HNSCC

Først undersøgte vi udtryk for RUNX3 i 14 HNSCC cellelinier (HSC2, HSC3, HSC4, Ca9-22, Ho-1-U-1, Ho-1-N-1, ZA, HOC719-PE, HOC719-NE, ​​HOC621, HOC119, HOC313 , TSU, og OMI). RUNX3 mRNA blev observeret i 9 ud af 14 HNSCC cellelinier (figur 1b). I visse typer af humane cancere herunder gastriske og blære, er det blevet rapporteret, at punktmutationer af RUNX3 blev observeret [3], [5]. Der blev imidlertid ikke mutationer fundet i HNSCC cellelinjer med RUNX3 mRNA-ekspression (Ca9-22, Ho-1-U-1 og Ho-1-N-1) (data ikke vist). RUNX3 mRNA-ekspression blev også undersøgt i forskellige cancercellelinier, herunder coloncancer (RKO og HCT116), gastrisk cancer (MKN-1 og MKN-45), leukæmi (HL60), lymfom (U937) og brystcancer (MCF7 og SK-BR3 ) (figur 1C). RKO, MCF7 og SK-BR3 celler ikke udtrykker RUNX3 mRNA. Som tidligere rapporteret, var RUNX3 ekspression godt korreleret med status for methylering, bortset fra SK-BR3 celler [17] – [20]. I SK-BR3 celler, er nedregulering af RUNX3 menes at være forårsaget af ukendt mekanisme [20]. Vi undersøgte også udtryk for RUNX3 mRNA i 18 HNSCC væv. I 13 ud af 18 (72,2%) HNSCC væv blev RUNX3 mRNA-ekspression observeret (figur 1D). Dernæst blev RUNX3 proteinekspression undersøgt ved Western blot-analyse i 6 HNSCC celler (HSC2, HSC3, HSC4, Ca9-22, Ho-1-U-1 og Ho-1-N-1) (figur 1E). Blandt dem, Ca9-22, Ho-1-U-1 og Ho-1-N-1-celler udtrykte RUNX3 protein, svarende til mRNA-ekspression. Derefter undersøgte vi RUNX3 udtryk i 9 normale orale slimhindevæv og 52 HNSCC sager ved immunhistokemi. Først brugte vi hud epitel og colon mucosa for reaktivitet af RUNX3 ekspression. Som det fremgår af seneste rapport [13], epidermale celler viste også RUNX3 udtryk i sine kerner (figur 2A, øverste panel). Vi undersøgte også RUNX3 udtryk i tyktarmskræft. I koloncancer, er RUNX3 menes at være et tumorsuppressorgen [18]. Som tidligere rapporteret [18], RUNX3 ekspression blev observeret i sine kerner af normal slimhinde, mens colon cancerceller ikke udtrykte RUNX3 (fig S1). I normale orale slimhindevæv, kun nogle få epitelceller i basale lag anelse udtrykt RUNX3 i deres kerner, og de fleste epitelceller udtrykte ikke (figur 2A, midterste panel). Lymfocytter infiltrerer ind i normal mundslimhinden viste RUNX3 udtryk (figur 2A, nederste panel). Immunopositivitet af RUNX3 i lymfocytter blev anvendt som en positiv kontrol med farvning. På den anden side, de fleste cancerceller udtrykte RUNX3 i deres kerner (figur 2B). Vi bekræftede også, at nuklear udtryk for RUNX3 ved at bruge nukleare og cytoplasmatiske fraktion af HNSCC cellelinjer, indikerer ingen protein mislocalization (data ikke vist). RUNX3 ekspression blev hyppigt observeret i 50% (26 af 52) af HNSCC tilfælde (tabel 1). Desuden har vi sammenlignet RUNX3 udtryk med klinisk-patologiske fund, herunder differentiering, invasiv og metastase. Interessant nok blev RUNX3 ekspression godt korreleret med maligne adfærd, herunder dårligt differentiering, invasionsevne og metastase (tabel 1).

Methylering status

RUNX3

var godt korreleret med dets mRNA ekspression i HNSCC

Vi spurgte, hvordan RUNX3 udtryk skyldes i HNSCC. Reduceret udtryk for RUNX3 blev ofte forårsaget af CpG ø hypermethylering i forskellige typer af kræft [9]. Faktisk var RUNX3 ekspression observeret i HSC4 celler uden RUNX3 ekspression efter 5-aza-2′-deoxycytidin behandling (figur 3A). Homma et al. undersøgt status for methylering af multiple regioner i

RUNX3

promotor CpG øen (3478 bp) inden den proksimale promotor (nr 1-10) i gastriske cancere og fundet, at methylering ved det område der spænder transkriptionsstartsitet (nr . 5-8) er kritisk for tab af RUNX3 ekspression (figur 3B) [15]. Til undersøgelse af

RUNX3

status for methylering i HNSCC, analyserede vi methylering af

RUNX3 dele på alle promotorregioner (nr 1-10) ved methylering-specifik PCR på panelet af HNSCC cellelinier (figur 3C og 3D). HNSCC celler med RUNX3 ekspression viste unmethylation eller delvis methylering på nr 5-8 region (figur 3D). HNSCC celler uden RUNX3 ekspression viste fuldt methylering ved No. 5 og nr 6 region. Således status methylering af

RUNX3

promotor-regionen var godt korreleret med RUNX3 mRNA ekspression i HNSCC cellelinjer

A:. RUNX3 ekspression blev undersøgt efter 5-aza-2′-deoxycytidin (5 aza) behandling. HSC4 celler blev behandlet med medium indeholdende 300 nM 5-aza-2′-deoxycytidin i 72 timer. Efter behandling blev cellerne opsamlet og undersøgt ekspressionen af ​​RUNX3 mRNA ved RT-PCR. B:

RUNX3

CpG ø og analyserede regioner (nr 1-10) er vist som lodrette streger. Transskriptionsstartstedet (TSS) er placeret inden region No. 7. C: Methylering status RUNX3 i HNSCC cellelinier. Genomisk DNA blev ekstraheret fra HNSCC cellelinier og blev behandlet med bisulfit. Status for methylering af promotorregionen (No. 1-10) undersøgt ved methylering specifik PCR-metode. D: Resuméet af methylering og udtryk status RUNX3 i HNSCC cellelinjer. E: Ekspression af RUNX3 i mus tunge epitel af embryo (øverste panel) og voksne (nederste panel) mus ved immunhistokemi. Tongue væv af musefostre på embryonisk dag 15,5 og 10 uger gamle BALB /c-mus blev anvendt. F: RUNX3 mRNA-ekspression blev undersøgt ved RT-PCR i 4 primære dyrkede normale orale epitelceller (# 1- # 4). HSC4 celle blev anvendt som en negativ kontrol og Ca9-22 celle blev anvendt som en positiv kontrol for RUNX3 ekspression. GAPDH blev anvendt som kontrol. G: RUNX3 ekspression blev undersøgt efter 5-aza-2′-deoxycytidin (5-Aza) behandling. Primære dyrkede normale orale epitelceller (# 1 og # 2) blev behandlet med medium indeholdende 300 nM 5-aza-2′-deoxycytidin i 72 timer. Efter behandling blev cellerne opsamlet og undersøgt ekspressionen af ​​RUNX3 mRNA ved RT-PCR. H: Genomisk DNA blev ekstraheret fra 4 primære dyrkede normale orale epitelceller (# 1- # 4). Methylering status på region No. 5-8 blev undersøgt ved methylering specifik PCR-metode. I: Resuméet af methylering og udtryk status RUNX3 i normale epitelceller

Seneste rapport viser, at RUNX3 udtrykkes i tungen og ganen epitel af mus embryoner fra embryonale dag 12,5-16,5, og at. RUNX3 udtryk falder efter embryonal dag 16,5 og forsvinder i nyfødte mus [21]. Her har vi også bekræftet, at RUNX3 ekspression blev observeret i fer epitel af musefostre (E15.5), men ikke i voksne mus tungen epitel (10 uger gamle) (figur 3E). Disse fund gjort os hypotesen, at

RUNX3

kunne afbrydes ved methylering i voksne orale epitelceller. Oral slimhindevæv indeholder normalt bindevæv og infiltrerende lymfocytter. Som vist i figur 2A (nederste panel), lymfocytter infiltrerer ind normal mundslimhinden viste RUNX3 ekspression. Derfor brugte vi primære dyrkede epitelceller opnået fra normale oralt epitel i denne undersøgelse for at undgå kontaminering af lymfocytter. I lighed med immunhistokemiske undersøgelser (figur 2A), 4 primære dyrkede epitelceller opnået fra normale oralt epitel (# 1- # 4) udtrykte ikke RUNX3 mRNA (figur 3F), hvilket viser, at ekspressionsniveauet af RUNX3 er lav eller fraværende i voksent normal oralt epitel. Vi undersøgte RUNX3 ekspression efter 5-aza-2′-deoxycytidin behandling. RUNX3 ekspression opreguleret med 5-aza-2′-deoxycytidin behandling i 2 primære dyrkede epithelceller (# 1 og # 3) (Figur 3G). Derefter undersøgte vi, om

RUNX3

blev stille ved methylering i voksne orale epitelceller. Vi udførte methyleringsspecifik PCR i 4 primære dyrkede epitelceller ved området, der spænder over transkriptionsstartstedet af

RUNX3

(nr 5-8), hvilket er kritisk for tab af RUNX3 ekspression i HNSCC celler (figur 3C). Interessant 2 primære dyrkede epithelceller (# 1 og # 2) viste delvis methylering på No. 6 og No. 7 region, og en anden 2 primære dyrkede epithelceller (# 3 og # 4) fuldstændig viste methylering på nr 7 og nr . 8 region (figur 3H og 3I).

RUNX3 overekspression forbedret celleproliferation og hæmmede apoptose

at kende rolle RUNX3 i HNSCC, vi stabilt transficeret et udtryk vektor af FLAG-RUNX3 ind HSC3 celler med lavere ekspression af RUNX3. Vi opnåede stabilt RUNX3 overudtrykkende celler (figur 4A). Interessant RUNX3 overekspression forøget cellevækst (figur 4B). På seks dage, antallet af RUNX3 overudtrykker celler var bemærkelsesværdigt højere end kontrolceller. Selvom vi undersøgte migration og invasion, har RUNX3 overekspression ikke fremme migration og invasion (figur S2). Desuden øgede befolkning svarende til sub-G1 efter serum sult blev kun observeret i kontrolceller, men ikke i RUNX3 overudtrykker celler (figur 4C). For at påvise, om denne forøgelse af sub-G1 detekteret i kontrolceller efter serum sult skyldes apoptose blev niveauet af apoptose vurderet ved hjælp annexin V-FITC /propidiumiodid assays (figur 4D). Annexin V /propidiumiodid dobbelt-positive celler blev observeret hos 1,8% af RUNX3 overudtrykker celler, mens der i 21,7% af kontrolceller, hvilket indikerer, at RUNX3 overekspression inhiberede serumudsultning induceret apoptose. For at bekræfte disse fænotyper, undersøgte vi knockdown af RUNX3 i Ca9-22 celler, som viste RUNX3 overekspression og var resistente over for serumudsultning-induceret apoptose. For knockdown af RUNX3, vi brugte tre forskellige siRNAs (si-RUNX3-1, si-RUNX3-2 og si-RUNX3-3) og deres cocktail. RUNX3 udtryk blev bemærkelsesværdigt tavse af si-RUNX3-1 (figur S3A). Derfor brugte vi si-RUNX3-1 for følgende undersøgelser. RUNX3 siRNA transfektion reducerede ekspressionen af ​​RUNX3 mRNA og protein i Ca9-22 celler (figur 5A). Vi undersøgte, om siRNA inducerede en uspecifik interferon stressrespons. RUNX3 siRNA behandling inducerede ikke klassiske interferon-responsive gener, OAS1 og ISG54 mRNA, hvilket indikerer, at RUNX3 siRNA behandling ikke inducerede signifikant interferon respons (Figur S3B). Som vi forventede, RUNX3 siRNA inhiberede cellevækst (figur 5B). På seks dage, antallet af RUNX3 siRNA behandlede celler var bemærkelsesværdigt lavere end for kontrolceller. Desuden RUNX3 siRNA steg befolkningen svarende til sub-G1 efter serum sult (figur 5C). Annexin V /propidiumiodid dobbelt-positive celler blev observeret hos 10,5% af kontrol celler, mens der i 18,1% af RUNX3 knockdown celler (figur 5D)

A:. Generation af RUNX3 overekspression celler. Den RUNX3 /pcDNA3 plasmid eller vektoren alene blev indført i HSC3 celler, og de stabile pool kloner blev opnået ved G418-selektion i 2 uger. Exogen ekspression af RUNX3 mRNA og protein blev undersøgt ved RT-PCR og Western blot-analyse (WB). CUL1 blev anvendt som en loading kontrol. B: Grafen viser cellevækst af RUNX3 overudtrykker og kontrol HSC3 celler. Celler blev udpladet på plader med 24 brønde, og trypsiniserede celler blev talt ved Cell Counter (Coulter Z1) ved 0, 2, 4 og 6 døgn. C: RUNX3 overekspression hæmmede serumudsultning apoptose. Celler blev inkuberet i 0, 48 og 96 timer efter serumudsultning og fikseret i 70% ethanol. Cellecyklusfordeling blev bestemt ved DNA-indhold analyse efter propidiumiodidfarvning ved anvendelse af en flowcytometer. For hver prøve blev 20.000 begivenheder gemt. Vi udførte to uafhængige forsøg. D: Flowcytometrisk analyse af Annexin V og propidiumiodid-farvning i kontrol og RUNX3 overudtrykkende celler efter serum sult i 96 timer. Vi udførte to uafhængige forsøg

A:. RUNX3 lyddæmpning af små interfererende RNA. Logaritmisk voksende Ca9-22 celler med RUNX3 ekspression blev podet ved en densitet på 10

5cells /6 cm skål og transficeret med oligoer to gange (ved 24 og 48 timer efter udpladning). Otteogfyrre timer efter den sidste transfektion blev celler opsamlet og RUNX3 mRNA og proteinekspression blev undersøgt ved RT-PCR og Western blot-analyse. B: Grafen viser, at cellevækst i RUNX3 siRNA behandlet og styre Ca9-22 celler. Celler blev udpladet på plader med 24 brønde, og trypsiniserede celler blev talt ved Cell Counter ved 0, 2, 4 og 6 døgn. C: RUNX3 siRNA forøgede serumudsultning apoptose. Cellecyklusfordeling blev bestemt ved DNA-indhold analyse efter propidiumiodidfarvning ved anvendelse af en flowcytometer. For hver prøve blev 20.000 begivenheder gemt. Vi udførte to uafhængige forsøg. D: Flowcytometrisk analyse af Annexin V og propidiumiodid-farvning i kontrol og RUNX3 knockdown celler efter serum sult i 96 timer. Vi udførte to uafhængige forsøg.

Derudover undersøgte vi hæmning af apoptose efter behandling med kemoterapeutiske stof i kontrol og RUNX3 overekspression HNSCC (figur 6). Kontrol- og RUNX3 overudtrykker HSC3 celler blev udsat i 72 timer til adriamycin (DOX; 0,5 og 1 ug /ml), som er et kemoterapeutisk middel almindeligvis anvendes til behandling af HNSCC. Sub-G1 population af RUNX3 overudtrykker HSC3 celler var 7,49%, medens den af ​​kontrolceller var 44.76% efter behandling med 1 ug /ml DOX (figur 6A). Desuden efter behandling med 1 ug /ml DOX, Annexin V /propidiumiodid dobbelt-positive celler blev observeret hos 25,2% af kontrolceller, mens i 8,9% af RUNX3 overudtrykker celler (figur 6B). På den anden side, Annexin V /propidiumiodid dobbelt-positive celler steg med RUNX3 knockdown (figur 6C). disse tyder Samlet at RUNX3 overekspression kan være involveret i HNSCC udvikling ved at fremme cellevækst og hæmning af apoptose

A:. Adriamycin (Dox, 0, 0,5 og 1 mg /ml) blev behandlet i 72 timer i kontrol og RUNX3 overudtrykker HSC3 celler. Cellecyklusfordeling blev bestemt ved DNA-indhold analyse efter propidiumiodidfarvning ved anvendelse af en flowcytometer. For hver prøve blev 20.000 begivenheder gemt. Procentdel af sub-G1 population er indiceret. Vi udførte to uafhængige forsøg med tredobbelte brønde pr tilstand. Repræsentative data vises. B: Flowcytometrisk analyse af Annexin V og propidiumiodid-farvning i kontrol og RUNX3 overudtrykker celler efter DOX behandling i 72 timer ved de angivne doser. C: Flowcytometrisk analyse af Annexin V og propidiumiodid-farvning i kontrol og RUNX3 knockdown celler efter DOX behandling i 72 timer ved de angivne doser. Vi udførte to uafhængige forsøg.

At kende rolle RUNX3 i tumorigenese undersøgte vi tumorsphere dannelse ved hjælp af ultra vedhæftede plader lave. RUNX3 overekspression fremmet tumorsphere dannelse (Figur S4A og s4b). Det gennemsnitlige antal kolonier var 535,6 og 663,3 i kontrol og RUNX3 overekspression celler, (figur s4b). Endvidere RUNX3 knockdown inhiberede tumorsphere dannelse (fig S4C og S4D).