PLoS ONE: Hæmning af HDAC1 og DNMT1 Modulate RGS10 Expression og Formindsk Kræft i æggestokkene Chemoresistance

Abstrakt

RGS10 er en vigtig regulator af celle overlevelse og kemoresistens i kræft i æggestokkene. Vi har for nylig viste, at RGS10 udskrift udtryk undertrykkes under erhvervet kemoresistens på kræft i æggestokkene. Undertrykkelsen af ​​RGS10 skyldes DNA hypermethylering og histondeacetylering, to vigtige mekanismer, der bidrager til inaktivering af tumorsuppressorgener under cancer progression. Her vi fuldt ud undersøge de molekylære mekanismer i epigenetisk inaktivering af RGS10 udtryk i kemoterapi A2780-AD æggestokkene cancerceller. Vi identificerer to vigtige epigenetiske regulatorer, HDAC1 og DNMT1, der udviser afvigende association med RGS10 initiativtagere i kemoterapi æggestokkene cancerceller. Knockdown af HDAC1 eller DNMT1 udtryk, og farmakologisk hæmning af DNMT eller HDAC enzymatisk aktivitet, øger RGS10 udtryk og cisplatin-medieret celledød. Endelig DNMT1 vælte også mindsker HDAC1 binding til RGS10 promotor i kemoterapi celler, hvilket tyder HDAC1 rekruttering til RGS10 initiativtagere kræver DNMT1 aktivitet. Vores resultater tyder på, at HDAC1 og DNMT1 bidrager til undertrykkelse af RGS10 i erhvervet kemoresistens og support hæmning af HDAC1 og DNMT1 som adjuvans terapeutisk tilgang til at overvinde kræft i æggestokkene kemoresistens

Henvisning:. Cacan E, Ali MW, Boyd NH , Hooks SB, Greer SF (2014) Hæmning af HDAC1 og DNMT1 Modulate RGS10 Expression og Formindsk Kræft i æggestokkene kemoresistens. PLoS ONE 9 (1): e87455. doi: 10,1371 /journal.pone.0087455

Redaktør: Malú G. Tansey, Emory University, USA

Modtaget: 10. oktober 2013; Accepteret: December 25, 2013; Udgivet: 27 Jan 2014

Copyright: © 2014 Cacan et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Research var støttet af tilskud # RSG-09-067-01-LB fra American Cancer Society. Den bidragyder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i æggestokkene er en af ​​de dødeligste gynækologisk cancer, med en 60% dødelighed hos patienter og en 5-års overlevelse på mindre end 30% i fremskredent stadium sygdom [1]. Den høje dødelighed skyldes for en stor del af udviklingen af ​​resistens over for kemoterapeutiske medikamenter [2], [3]. Således vil forstå de molekylære og genetiske mekanismer, der driver udviklingen af ​​erhvervet kemoresistens sætte os i stand til at forbedre de nuværende terapeutiske midler til kræft i æggestokkene behandling. G-protein-koblede receptorer (GPCR’er) initiere multiple oncogene signalveje i cancerceller ved at aktivere deres associerede G-proteiner [4], [5]. Aktivering af GPCR’er ved vækstfaktorer, såsom lysophosphatidsyre (LPA) udløser overlevelse signalveje, der driver resistens over for kemoterapeutiske lægemidler såsom cisplatin og taxan [6]. GPCR aktivering af G-proteiner er imod af aktiviteten af ​​regulator af G-protein-signalering (RGS) proteiner. RGS-proteiner inhiberer G-protein signaleringsveje ved direkte binding til den aktiverede Ga underenheden af ​​G-proteiner til at fremskynde hydrolysen af ​​GTP til BNP, som returnerer G-proteiner til en inaktiv tilstand [7] – [10]. Relevant for vores studier, seneste rapporter tyder på, at RGS proteiner hæmmer bryst-, lunge-, prostata-, og æggestokkene vækst kræftcelle gennem hæmning af GPCRs signalveje [2], [11] – [15].

RGS10 er blandt den mindste af RGS-proteiner og udtrykkes kraftigt i et bredt område af celletyper [16] – [19]. RGS10 er en vigtig regulator af celleoverlevelse og kemoresistens [2], RGS10 transkriptet ekspression undertrykte signifikant i multiple æggestokkene cancercellelinier [15]. Således kan undertrykkelse af RGS10 proteiner bidrage til kemoresistens ved at amplificere GPCR-medieret cellevækst og overlevelse signalveje. Vi har for nylig vist, at suppression af RGS10 skyldes til dels DNA hypermethylering og histondeacetylering, to vigtige gendæmpning mekanismer, der bidrager til udviklingen af ​​mange cancerformer. DNA methylering vedligeholdes af DNA methyltransferaser (DNMTs) [20] og histondeacetylering vedligeholdes af histondeacetylaser (HDAC) [21]. Ofte er disse to enzymer koordineret undertrykke transkriptionsaktivitet gener [22], [23]. Fuks

et al.

Har rapporteret, at DNMT1 er forbundet med histondeacetylaseaktivitet og har evnen til at binde HDAC1 [24]. Men de molekylære mekanismer, som DNA hypermethylering og histondeacetylering undertrykke RGS10 og bidraget af disse enzymer til erhvervet kemoresistens fortsat ukendt.

Vi undersøger her de molekylære mekanismer i epigenetisk regulering af RGS10 udtryk i æggestokkene cancerceller og fokus på chemosensitive forældrenes A2780 celler og deres afledte cellelinie, kemoterapi A2780-AD. Vi identificerer to vigtige epigenetiske regulatorer, HDAC1 og DNMT1, som er stærkt forbundet med RGS10 promotor i kemoterapi æggestokkene cancerceller. HDAC1 og DNMT1 banke ned øger RGS10 udtryk og cisplatin-stimuleret celledød. Vores resultater tyder på, at HDAC1 og DNMT1 bidrager til undertrykkelse af RGS10 i erhvervet kemoresistens og støtte voksende beviser for, at hæmning af HDAC1 /DNMT1 repræsenterer nye terapeutiske metoder til at overvinde kræft i æggestokkene kemoresistens.

Materialer og metoder

cellelinjer og reagenser

chemosensitive A2780 parental cellelinje og deres afledte kemoterapi A2780-AD-celler (afledt som beskrevet [25]) blev generøst tilvejebragt af Dr. Bob Brown, Imperial College London. Disse celler blev opretholdt i RPMI 1640 medium (Mediatech Inc.) suppleret med 10% FBS og 5 mM L-glutamin. Kemoresistent celler blev yderligere opretholdt i 3 pM cisplatin. Alle celler blev dyrket i 5 mM penicillin-streptomycin ved 37 ° C med 5% CO

2. OV2008 og C13-celler (afledt som beskrevet [26], [27]) blev generøst tilvejebragt af Dr. Patricia Kruk, University of South Florida.

5-Aza-2′-deoxycytidin (5-Aza-dC ), blev Trichostatin A (TSA), og cisplatin indkøbt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Antistoffer, der genkender RGS10, HDAC1, gede-anti-rotte-IgG-HRP (Peberrodsperoxidase), og HRP-konjugeret kanin-antistoffer blev opnået fra Santa Cruz (Santa Cruz, CA). Antistoffer, der genkender DNMT1 blev opnået fra Abcam (Cambridge, MA). HRP-konjugeret muse-antistoffer blev erhvervet fra Promega (Madison, WI). Antistoffer, der genkender β-actin blev opnået fra Cell Signaling (Beverly, MA).

siRNA-konstruktioner og transient transfektion

lille interfererende RNA (siRNA) præ-designet til HDAC1 (Qiagen), RGS10 og DNMT1 (Santa Cruz) blev anvendt til at banke ned udtryk for HDAC1, RGS10 eller DNMT1. Scrambled All Star Kontrol siRNA (Qiagen) blev anvendt som kontrol. A2780-AD-celler blev transficeret med 10 nM HDAC1 eller DNMT1 specifik siRNA eller All Star scrambled kontrol siRNA hjælp HiPerfect transfektionsreagens (Qiagen) ifølge producentens anvisninger. Efter angivne inkubationstid blev celler høstet og analyseret i Western blot, RNA-ekspression, eller chromatin immunopræcipitationsforsøg.

RNA-ekspression og kvantitativ real-time PCR

mRNA blev isoleret under anvendelse Qiazol RNA-ekstraktion reagens (Qiagen) som beskrevet i producentens protokol. Kort fortalt blev cellerne lyseret i Qiazol og rystet på et 3D rotator i 5 minutter. 200 pi chloroform tilsat og blev inkuberet i tre minutter ved stuetemperatur. Prøver blev centrifugeret, og den vandige fase (400 pi) blev overført til et Eppendorf-rør. 500 pi isopropanol blev tilsat og blev inkuberet i 10 minutter ved stuetemperatur. Efter centrifugering blev pellets vasket med 1 ml kold 75% ethanol, centrifugeret og resuspenderet i 50 pi RNase-frit vand. RNA blev kvantificeret og cDNA blev dannet fra 1 ug af det samlede ekstraherede RNA ved anvendelse af en Omniscript Reverse Transcription Kit (Qiagen). Efter cDNA syntese blev kvantitativ real-time polymerasekædereaktion udført ved anvendelse af TaqMan Universal PCR Master Mix (Roche) og specifikke primere og prober rettet mod RGS10 eller GAPDH kodende regioner. Transcript ekspression blev vurderet ved anvendelse af en ABI prisme 7900HT Real-Time PCR System (Applied Biosystems). Reaktioner blev normaliseret mod GAPDH udtryk og beregninger blev udført under anvendelse af standardkurver genereret. Anvendte primere var: RGS10 Forward: 5′-GAC CCA AGA AGG CGT GAA AAG A-3 ‘, RGS10 bagside: 5′-GCT GGA CAG AAA GGT CAT GTA GA-3′, RGS10 probe: 5’-AGA TAA GAC GCA GAT GCA GGA AAA GGC-3 ‘, GAPDH Forward: 5′-GGA AGC TCA CTG GCA TGG C-3′, GAPDH bagside: 5’-TAG ACG GCA GGT CAG GTC CA-3 ‘og GAPDH probe: 5’- CCC CAC TGC CAA CGT GTC AGT G-3 ‘.

for at bestemme virkningen af ​​5-Aza-dC og TSA eksponering på RGS10 udskrift udtryk, 1 × 10

6 A2780-AD-celler blev udsået per 10 cm

2 vævskulturplade og inkuberet natten over. Celler blev behandlet med 20 pM 5-aza-dC eller med 500 ng TSA opløst i DMSO. TSA-behandlede celler blev inkuberet i 48 timer og 5-aza-dC-behandlede celler blev inkuberet i tre, fem eller syv dage med medier aspireret og erstattet dagligt. RNA-isolering og DNA-syntese blev udført som beskrevet ovenfor.

chromatin immunoprecipitation (chip) assay

chip assays blev udført som tidligere beskrevet [15]. Kort beskrevet blev celler udpladet ved en densitet på 2 x 10

6 i 10 cm

2 plader. Tre millioner celler blev tværbundet med 1% formaldehyd i otte minutter ved stuetemperatur. Tværbindingsreaktioner blev standset ved tilsætning af 0,125 M glycin. Cellekerner blev isoleret og blev koncentreret ved lyse i SDS-lysepuffer (1% SDS, 10 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8,0) plus proteaseinhibitorer i 30 minutter på is, efterfulgt af flash frysning i flydende nitrogen. Kerner blev sonikeret under anvendelse af en Bioruptor vandbad-sonikator (Diagenode) til at generere et gennemsnit på 500 bp af klippet DNA, som blev bekræftet ved agarosegelelektroforese. Sonikerede lysater blev klaret med laksesperma-/agaroseperler (Millipore), 5% af det samlede lysat blev lagret som input til normalisering. Halvdelen af ​​det resterende lysat blev immunudfældet med 5 ug angivne antistof natten over ved 4 ° C og den anden halvdel af lysatet blev immunpræcipiteret med et kontrolantistof. Efter yderligere to time immunpræcipitering med laksesperma-overtrukne agaroseperler blev alle prøver vasket med hver af følgende puffere: lavsaltbuffer (0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl), puffer med højt saltindhold (0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8,0, 500 mM NaCl), LiCI (0,25 M LiCI, 1% NP40, 1% DOC, 1 mM EDTA, 10 mM Tris pH 8,0) og 1 × TE (Tris-EDTA); DNA blev derefter elueret med SDS elueringspuffer (1% SDS, 0,1 M NaHCO3). Efter eluering blev tværbindinger vendes natten over med 5 M NaCl ved 65 ° C, og immunopræcipiterede DNA blev isoleret ved anvendelse phenol: chloroform: isopropanol-blanding (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner. Isolerede DNA blev kvantificeret ved real time PCR på en ABI prisme 7900 HT (Applied Biosystems, Foster City, CA) under anvendelse af specifikke primere og prober rettet mod RGS10 og GAPDH-promotorer region. Værdier genereret fra real time PCR reaktioner blev beregnet ud fra standardkurver genereret, blev kørt i tredobbelte reaktioner, og blev analyseret ved hjælp af SDS 2,0 program (Applied Biosystems).

chromatin immunopræcipitationsassay i siRNA behandlede celler

kemoresistent A2780-aD-celler blev udpladet ved en densitet på 1,2 x 10

6 celler pr 10 cm

2 vævskulturplader. Celler blev behandlet med siRNA-konstruktioner som beskrevet ovenfor og inkuberet i 72 timer. Celler blev høstet og 1/10 af cellen volumen blev fjernet til analyse af knockdown effektivitet ved western blot-analyse. Chip assays blev udført som beskrevet ovenfor på de resterende høstede celler.

RNA-ekspression i siRNA behandlede celler

Celler blev udpladet ved en tæthed på 1 x 10

6 celler pr 10 cm

2 vævskulturplade og inkuberet natten over. Cellerne blev derefter transficeret med den angivne siRNA-konstruktion som beskrevet ovenfor og inkuberet i 72 timer, og en RNA-ekstraktion blev udført som beskrevet ovenfor.

Apoptose assay

apoptose af A2780-AD-celler var vurderet ved hjælp af Annexin V: PE Apoptose Detection Kit i (BD Pharmingen). 1 × 10

6 A2780-AD-celler blev udpladet på en 10 cm

2 vævskulturplade og inkuberet i 24 timer ved 37 ° C. Cellerne blev behandlet med HDAC1 siRNA eller med kontrol siRNA hjælp af HiPerfect transfektionsreagens. Efter 48 timer inkubation, 50 pM af cisplatin blev tilsat til både HDAC1 siRNA og styre siRNA behandlede celler, og cellerne blev inkuberet i yderligere 48 timer. A2780-AD-celler blev kortvarigt trypsiniseret og høstet. En fraktion af cellen volumenet blev fjernet til western blot-analyse, og den resterende del af cellerne blev vasket med kold PBS to gange og resuspenderedes i Annexin V binding buffer ved en koncentration på 1 × 10

6 celler /ml. Cellerne blev derefter overført til 5 ml kultur rør indeholdende 5 pi Annexin V-PE og /eller 5 pi 7-aminoactinomycin D (7-AAD). Prøverne blev blandet forsigtigt og inkuberet i 20 minutter ved stuetemperatur. Efter tilsætning af 400 pi Annexin V-bindende buffer til hvert rør blev prøver analyseret og kvantificeret ved flowcytometri og resulterende data blev analyseret under anvendelse FlowJo software.

Resultater

histonacetylering undertrykkes ved RGS10 initiativtagere i æggestokkene cancerceller

Vi har for nylig vist, at niveauet af acetyleret histon H3 histon er faldet betydeligt på RGS10-1 promotor i A2780-AD celle model af ovariecancer kemoresistens [15]. For at bekræfte disse resultater i yderligere cellelinjer, chromatin immunoprecipitation (chip) blev udført i chemosensitive ovariecancer cellelinie OV2008 og i kemoresistent C13 datterceller. Mens det samlede niveau af histon H3 er ens i begge RGS10 og GAPDH promotorer i chemosensitive og kemoterapi celler (fig. 1A), niveauer af acetyleret histon H3 er betydeligt lavere ved RGS10 initiativtagere i kemoterapi C13 ovariecancerceller sammenlignet med chemosensitive OV2008 celler ( fig. 1B).

chip assays blev udført i OV2008 parentale celler og lægemiddelresistente C13-celler. Lysater blev immunfældet med kontrol, anti-histon H3, anti-acetyl histon H3, eller anti-acetyl H3K18 antistoffer. Associerede DNA blev isoleret og analyseret via real time PCR under anvendelse af primere spænder over RGS10 og GAPDH promotorer. Real-time PCR værdier blev normaliseret til den samlede mængde promotor-DNA tilsat (input). Input værdier repræsenterer 5% af det samlede cellelysat. ** P 0,005. A) Global histon H3 der er forbundet med RGS10 og GAPDH initiativtagere. B) Globale niveauer af histon H3 acetylering forbundet med RGS10 og GAPDH initiativtagere. C) Niveauer af histon H3 acetyleret ved lysin 18 forbundet med RGS10 og GAPDH initiativtagere.

Reduktioner i H3 lysin 18 acetylering (H3K18Ac) har været forbundet med aggressive kræft fænotyper og med dårlig patient prognose [28] , [29]. Dernæst udføres chip assays for at bestemme om tab af H3K18 bidrager til tabet af globale histonacetylering på RGS10 promotorer i kemoresistent C13-celler. Et signifikant fald i H3K18 acetylering ved RGS10 promotorer blev observeret i kemoresistent C13-celler, mens H3K18 acetylering ved GAPDH promotorer i OV2008 og C13-celler forblev uændret (fig. 1C). Sammen antyder disse data tabet af acetylering på RGS10 initiativtagere bidrager til tabet af RGS10 udtryk i to uafhængige celle modeller af kemoterapi kræft i æggestokkene.

HDAC1 og DNMT1 undertrykke RGS10 udtryk i kemoterapi ovariecancerceller

Vi har tidligere vist, at HDAC1 proteiner binder med signifikant øget frekvens til RGS10 promotor i kemoterapi A2780-AD-celler i forhold til forældrenes chemosensitive A2780 celler [15]. At undersøge molekylære roller for HDAC1 i regulering RGS10 udtryk blev en siRNA duplex udnyttes til specifikt banke ned endogen HDAC1 udtryk i A2780-AD-celler. siRNA-medieret knockdown af HDAC1 resulterede i en mere end 3 gange stigning i endogen RGS10 transkript ekspression sammenlignet med kontroldyr siRNA (Fig. 2A), hvilket antyder, at HDAC1 spiller en kritisk rolle i reguleringen af ​​RGS10 transkription. Western blot-analyse bekræftede HDAC1 vælte forøget RGS10 proteinekspression (Fig.2B). I et lignende eksperiment blev A2780-AD-celler transficeret med HDAC1 at bestemme virkningerne af ektopisk ekspression af HDAC1. Overekspression af HDAC1 drastisk reduceret RGS10 udtryk i kemoterapi A2780-AD-celler (Fig. 2C-E). Tilsammen udgør disse data viser, at HDAC1 ophobning på RGS10 initiativtagere sandsynligvis bidrager til undertrykkelse af RGS10 i kemoterapi æggestokkene cancerceller.

A) Knockdown af HDAC1 øger RGS10 mRNA transkription. A2780-AD-celler blev transficeret med HDAC1 siRNA eller kontrol siRNA og inkuberet i 72 timer. RNA blev ekstraheret og cDNA blev frembragt ved anvendelse af en revers primer målretning for RGS10 eller GAPDH kodende region. Dataene blev kvantificeret ved anvendelse qPCR med primere og prober specifikke for RGS10 og GAPDH kodende regioner. Afbildet data viser gennemsnittet af tre uafhængige forsøg, med fejlsøjler betegner standardfejlen af ​​middelværdien (SEM). Betydning blev beregnet med en Students t-test ** p 0,005. B) Western blot analyse demonstrerer effektiviteten af ​​HDAC1 knockdown og RGS10 proteinekspression efter HDAC1 banke ned med Beta-Actin kontroller. C-D) HDAC1 overekspression formindsker RGS10 ekspression i kemoterapi celler. A2780 /AD-celler blev udpladet i 24-brønds plade og får lov at binde natten over. Celler blev transficeret med 500 ng HDAC1 eller tom vektor ved anvendelse FuGene 6 reagens (Promega) ifølge fabrikantens protokol. Efter 48 timers inkubation blev cellerne høstet i TRIzol (Invitrogen), og ekspressionen af ​​RGS10 og HDAC1 gener blev vurderet ved anvendelse af RT-PCR som beskrevet, og normaliseret til actin genekspression. Værdier repræsenterer middel ± SEM af fire uafhængige forsøg *** p 0,0005. E) Western blot analyse demonstrerer RGS10 proteinekspression efter HDAC1 overekspression med Beta-Actin kontroller.

RGS10-1 promotor indeholder en høj koncentration af CpG-dinukleotider gør det et potentielt mål for DNMT vedligeholdelse methylering under æggestokkene cancer progression. Vi først bestemt ved Western blot-analyse, at DNMT1 ekspressionsniveauer er ens hos A2780 og A2780-AD-cellelinier (fig. 3B). For yderligere at undersøge relevansen af ​​DNMT1 i den specifikke undertrykkelse af RGS10 udtryk blev chip assays udført i A2780 forældrenes og deres afledte resistente A2780-AD-celler. Lysater blev immunfældet med kontrol eller anti-DNMT1 antistof og associerede DNA blev analyseret via kvantitativ realtids-PCR (QRT-PCR) under anvendelse af specifikke primere og prober spænder over RGS10 og GAPDH promotorer. I modsætning til total protein overflod, chip assays afslører, at binding af DNMT1 øges signifikant ved RGS10 promotoren i kemoresistent celler sammenlignet med chemosensitive ovariecancerceller (fig. 3A). Sammen disse data indikerer, at ophobning af DNMT1 på RGS10 promotor sandsynligvis bidrager til undertrykkelse af RGS10 under ovariecancer kemoresistens.

A) Niveauer af DNMT1 forbundet med RGS10 initiativtagere i A2780 og A2780-AD ovariecancer celler. Chip assays blev udført i A2780 forældrenes og deres afledte resistente A2780-AD-celler. Lysater blev immunfældet med kontrol eller anti-DNMT1 antistof. Associerede DNA blev isoleret og analyseret via real time PCR under anvendelse af specifikke primere og prober spænder over RGS10 og GAPDH promotorer. Real-time PCR værdier blev normaliseret til den samlede mængde promotor-DNA tilsat (input). Værdier blev normaliseret til GAPDH og repræsenterer middelværdi ± SEM af tre uafhængige forsøg ** p 0,005. B) Western blot analyse af globale DNMT1 niveauer i A2780 og A2780-AD-celler. Celler blev høstet og lysater blev anvendt til immunfældning. Antistof-konjugerede agaroseperler (IP) for DNMT1 blev inkuberet med rotation natten over. Perlerne vaskedes, elueret og underkastet western blot med respektive antistoffer. C) A2780-AD-celler blev transficeret med DNMT1 siRNA eller med kontrol siRNA og blev inkuberet i 72 timer. RNA blev ekstraheret og cDNA blev frembragt ved anvendelse af reverse primere rettet mod RGS10 og GAPDH kodende regioner. Data genereret blev kvantificeret under anvendelse QRT-PCR med primere og prober specifikke for RGS10 kodende område. Værdier repræsenterer middel ± SEM af fire uafhængige forsøg ** p 0,005. D) Western blot analyse for effektivitet af banker ned DNMT1 og for RGS10 proteinekspression efter DNMT1 vælte.

Ophobning af DNMT1 på RGS10 promotor førte os til at afgøre, om der ophobning påvirker RGS10 udskrift udtryk niveau i kemoterapi celler. Til dette formål blev der A2780-AD-celler transficeret med DNMT1 siRNA eller kontrol siRNA. RNA blev ekstraheret og omsatte cDNA blev kvantificeret ved anvendelse QRT-PCR med primere og prober specifikke for RGS10 kodende område og normaliseret til husholdning gen GAPDH-ekspression. Dataene viser, at vælte DNMT1 øger endogen RGS10 transkript ekspression (fig. 3C) og proteinekspression (fig. 3D) i A2780-AD-celler. Denne stigning viser, at DNMT1 funktioner med HDAC1 at regulere undertrykkelse af RGS10 transkription i kemoterapi A2780-AD-celler.

Hæmning af HDAC og DNMT aktivitet forbedrer RGS10 udtryk og reducerer kræft i æggestokkene cellernes levedygtighed

Vi næste forsøgt at bestemme, om farmakologiske inhibitorer af histondeacetylering og DNA-methylering kan ændre ekspressionen af ​​RGS10 i kemoterapi ovariecancerceller. Den HDAC-hæmmer TSA og DNMT inhibitor 5-Aza-dC blev brugt til at hæmme HDAC og DNMTs hhv. A2780-AD-celler blev behandlet med 500 nM TSA og blev inkuberet i 2 dage eller blev behandlet med 20 pM 5-aza-dC og inkuberet i 3, 5 og 7 dage. Totalt RNA blev isoleret fra ubehandlede kontrolceller, TSA, og 5-aza-dC behandlede celler. Den relative ekspression af RGS10 transkriptet ekspression blev kvantificeret ved QRT-PCR og blev normaliseret til GAPDH transcript ekspression. I overensstemmelse med observationer fra HDAC1 og DNMT1 banke ned eksperimenter, TSA og 5-Aza-dC behandlinger både væsentligt forbedret RGS10 udskrift udtryk i kemoterapi A2780-AD-celler (fig. 4A og 4B). At udforske potentielle synergistiske roller for HDAC1 og DNMT1 i regulering RGS10 udtryk, blev kombinationsundersøgelser udført ved hjælp af TSA og 5-Aza-dC i kemoterapi æggestokkene cancerceller. Igen, TSA eller 5-aza-dC alene forbedret RGS10 ekspression i A2780-AD-celler, og kombinationen af ​​disse to lægemidler resulterer i en fold stigning i RGS10 ekspression større end summen af ​​den individuelle virkning, hvilket antyder en potentiel kooperativ virkning (fig . 4C). At undersøge kooperative roller for HDAC1 og DNMT1 i cellevækst og kemoresistens blev A2780-AD-celler behandlet med TSA og /eller 5-aza-dC i nærvær af cisplatin og cellelevedygtighedsassays blev udført. 5-Aza-dC alene reducerede cellevækst med ca. 40%, mens TSA alene havde en beskeden, men signifikant effekt på cellelevedygtighed; Kombinationen af ​​TSA og 5-aza-dC inhiberede cellelevedygtigheden med 90%. Som forventet, A2780-AD-celler var resistente over for cisplatin toksicitet, men enten TSA eller 5-aza-dC delvis re-sensibiliserede cellerne for cisplatin-medieret cytotoksicitet (Fig. 4D). For at bestemme om RGS10 opregulering af TSA /5-Aza-dC kombineret behandling fuldt kunne redegøre for tab af cellelevedygtighed, vi forsøgte at redde cellelevedygtighed i nærvær af 5-aza-dC og TSA med RGS10 siRNA. Ikke overraskende knock-down af RGS10 alene ikke redde cellelevedygtighed, i overensstemmelse med den brede vifte af HDAC og DNMT målgener i cancerceller (fig. 4E). Således RGS10 koordineret regulerer cellernes levedygtighed og kemosensitivitet med yderligere HDAC og DNMT målgener.

Totalt RNA blev isoleret fra ubehandlede kontrolceller og TSA eller 5-aza-dC-behandlede celler. Den relative ekspression af RGS10 mRNA blev kvantificeret ved QRT-PCR og normaliseret til GAPDH transcript ekspression * p 0,05; ** P 0,005. A) HDAC-inhibering forøger RGS10 ekspression i kemoresistent A2780-AD-celler. Cellerne blev udpladet i en 10 cm

2 plade og inkuberet i 24 timer. Den følgende dag blev celler behandlet med 500 nM TSA og blev inkuberet i yderligere 48 timer. B) DNMT hæmmer 5-Aza-dC forbedrer RGS10 udtryk i kemoterapi celler. To millioner A2780-AD-celler blev podet i 10 cm

2 plader og blev inkuberet i 24 timer. Den følgende dag blev celler behandlet med 20 pM 5-aza-dC. Medier og narkotika var opdateres hver 24 timer. Efter angivne inkubationstid (3, 5 og 7 dage) blev cellerne høstet, mRNA blev isoleret, og cDNA blev genereret og kvantificeret ved anvendelse QRT-PCR med specifikke primere og probe. C) A2780-AD-celler blev udpladet i 96-brønds plader og behandlet med 5 pM 5-aza-dC i 5 dage, 500 nM TSA i 36 timer, en kombination af 5 uM 5-aza-dC i 5 dage og 500 nM TSA for de sidste 36 timer eller DMSO. Genekspression blev vurderet ved anvendelse QRT-PCR som beskrevet, og normaliseret til RPL13A genekspression. Pilen angiver ekspressionsniveauet forudsagt af en additiv effekt af TSA og 5-Aza-dC. D) I et parallelt forsøg blev A2780-AD-celler behandlet under de samme betingelser som 4C med eller uden 30 pM cisplatin for de sidste 12 timer. Celle overlevelse blev vurderet ved anvendelse af CellTiter-Blå fluorimetriske levedygtighed assays. ***: P 0,001 sammenligne epigenetisk lægemiddel til DMSO-kontrol i fravær af cisplatin. ###: P 0,001 sammenligne køretøj versus cisplatin behandling inden epigenetiske lægemidler behandlingsgrupper. Den stiplede kasse angiver cellelevedygtigheden forudsagt af en additiv effekt af TSA og 5-Aza-dC. E) A2780 /AD-celler (5000 celler /brønd) blev udpladet i 96-brønds plade og transfekteret med negativ kontrol eller RGS10 siRNA-duplexer (Ambion Grand Island, NY), som pr fabrikantens protokol under anvendelse Dharmafect1 transfektionsreagens (Dharmacon). Celler blev doseret med en kombination af 5 uM 5-aza-dC i 3 dage og 500 nM TSA for sidste 36 timer eller DMSO. 30 uM cisplatin eller køretøj blev tilføjet til den sidste 12 timer. Cell overlevelse blev vurderet ved hjælp CellTiter-Blå fluorimetriske levedygtighed analyser.

Knocking ned HDAC1 øger cisplatin-stimuleret apoptose i kemoterapi celler

Vores tidligere arbejde tyder på, at undertrykkelsen af ​​RGS10 udtryk bidrager til udvikling af kemoresistens under ovariecancer progression gennem amplifikation af endogene overlevelse signalveje [2], [15], og her præsenterede resultater antyder, at HDAC1 bidrager til tabet af RGS10 ekspression i kemoterapi ovariecancerceller. Til bestemmelse HDAC1-medierede ændringer i celleoverlevelse af kemoterapi ovariecancerceller, blev cisplatin resistente A2780-AD-celler transficeret med HDAC1 siRNA. Efter transfektion blev celler inkuberet med 50 pM cisplatin og apoptose blev analyseret ved anvendelse af et Annexin V: PE apoptose afsløring kit (BD Pharmingen). Annexin V binder phosphatidylserin, som er udsat kun apoptotiske celler, medens membranen impermeabel DNA label 7-aminoactinomycin D (7-AAD) selektivt binder til GC regioner af DNA kun i sent apoptotisk eller døde celler med kompromitterede membraner [30] – [32]. Således er tidligt apoptotiske celler farvet med kun annexin V-PE, medens sent apoptotiske og døde celler farves med både annexin V-PE og 7-AAD. Flowcytometrisk analyse blev anvendt til at skelne mellem populationer af umærkede og singly- eller dobbelt-mærkede celler. HDAC1 vælte steget betydeligt populationen af ​​cisplatin-stimulerede celler fra 12,9% til 32,1%, der er positive for begge annexin V-PE og 7-AAD (sene apoptotiske eller døde celler) (fig. 5A). Resultaterne bekræftes af tre uafhængige eksperimenter (fig. 5B). Knock down effektivitet HDAC1 og RGS10 proteinekspression efter HDAC1 vælte blev bekræftet i A2780-AD-celler ved Western blot-analyse (fig. 5C). Sammen antyder disse data at HDAC1 medieret reduktion af RGS10 ekspression sløver evne cisplatin til at inducere celledød i A2780 /AD ovariecancerceller.

A2780-AD-celler blev behandlet med HDAC1 siRNA eller kontrol siRNA og blev inkuberet i 48 timer. Efter inkubation blev cellerne behandlet med 50 pM cisplatin og inkuberet i tilsætning 48 timer i RPMI 1640-medier. En Annexin V: PE Apoptose Detektion Kit I (BD Pharmingen) blev anvendt til farvning; Resultaterne blev kvantificeret ved hjælp af flowcytometri analyse og blev analyseret under anvendelse FlowJo software. Levedygtige celler var negative for både annexin V-PE og 7-AAD; tidlige apoptotiske celler var positive for annexin V-PE og negativ for 7-AAD, hvorimod sene apoptotiske døde celler var positive for både annexin V-PE og 7-AAD mærkning. A) Den relative stigning af apoptotiske celler i HDAC1- siRNA transficerede A2780-AD-celler som inkorporeret Annexin V-PE og 7-AAD pletter. B) Graf repræsenterer gennemsnittet af tre uafhængige forsøg, med fejlsøjler betegner SEM * p 0,05. C) Western blot analyse repræsenterer effektiviteten af ​​HDAC1 knockdown og RGS10 proteinekspression efter HDAC1 vælte.

DNMT1 banke ned aftager HDAC1 binding til RGS10 promotor i kemoterapi ovariecancerceller

HDAC1 og DNMT1 bidrager til gen silencing gennem rekruttere transkriptionelle repressorer at promotorområder [33] – [35], og arbejde sammen om at undertrykke genekspression [24], [36]. Vore data antyder, at HDAC og DNMT aktiviteter samvirkende stilhed RGS10 (fig. 4C). At undersøge krydstale mellem disse to epigenetiske regulatorer, blev A2780-AD-celler transficeret med DNMT1 siRNA eller kontrol siRNA og blev inkuberet i 72 timer. HDAC1 binding til RGS10 promotoren blev undersøgt ved chip assays i DNMT1 siRNA eller kontrol siRNA behandlet A2780-AD-celler. DNMT1 vælte faldt betydeligt binding af HDAC1 til RGS10 promotor (fig. 6A) og western blot analyse (fig. 6B) demonstrerede vellykket og specifik knockdown af DNMT1. Det omvendte forsøg blev også udført, hvor A2780-AD-celler blev transficeret med HDAC1 siRNA. Western blot-analyse viste knockdown af HDAC1 resulterede i suppression af DNMT1 proteinekspression (data ikke vist); en observation set af andre samt [37]. Disse data antyder, at HDAC1 rekrutteres til RGS10 promotoren via DNMT1 og methyl-CpG bindende protein 2 (MeCP2) afhængige mekanismer (fig. 6C).