PLoS ONE: pp32 (ANP32A) Expression Hæmmer kræft i bugspytkirtlen Cell Growth og inducerer Gemcitabin Resistance ved at forstyrre HUR Binding til mRNAs

Abstrakt

Udtrykket af protein fosfatase 32 (PP32, ANP32A) er lav i dårligt differentieret pancreas kræft og er knyttet til niveauerne af HUR (ELAV1), en prædiktiv markør for gemcitabin respons. I bugspytkirtelkræftceller, eksogen overekspression af pp32 hæmmede cellevækst, støtter sin længe anerkendt rolle som tumorsuppressor i bugspytkirtelkræft. I kemoterapeutiske følsomhed screeningsassays, celler, der overudtrykker pp32 var selektivt resistente over for nucleosidanaloger gemcitabin og cytarabin (ARA-C), men blev sensibiliseret til 5-fluoruracil; omvendt silencing pp32 i bugspytkirtelkræftceller forbedret gemcitabin følsomhed. De cytoplasmiske niveauer af pp32 steg efter kræftceller behandles med visse stressorer, herunder gemcitabin. pp32 overekspression reducerede associering Hur med mRNA’et koder for gemcitabin-metabolizing enzym deoxycytidinkinase (dCK), hvilket medfører en væsentlig reduktion i DCK proteinniveauer. Tilsvarende ektopisk pp32 ekspression forårsagede en reduktion i Hur binding af mRNA’er der koder tumorfremmende proteiner (fx VEGF og Hur), mens dæmpende pp32 dramatisk forøget binding af disse mRNA-mål. pp32 lav nuklear ekspression korrelerede med high-grade tumorer og tilstedeværelsen af ​​lymfeknudemetastase, sammenlignet med patienternes tumorer med høj nukleare pp32 ekspression. Selvom pp32 ekspressionsniveauerne ikke øge den forudsigende magt cytoplasmatisk Hur status, nukleare pp32 niveauer og cytoplasmatiske HUR niveauer, der forbindes betydeligt i patientprøver. Således tilvejebringer vi hidtil ukendt beviser for, at tumorsuppressorfunktion af pp32 kan tilskrives dets evne til at forstyrre Hur binde til target mRNA, der koder centrale proteiner til cancercelleoverlevelse og lægemiddeleffektivitet

Henvisning:. Williams TK, Costantino CL , Bildzukewicz NA, Richards NG, Rittenhouse DW, Einstein L, et al. (2010) pp32 (ANP32A) Expression Hæmmer kræft i bugspytkirtlen Cell Growth og inducerer Gemcitabin Resistance ved at forstyrre HUR Binding til mRNA. PLoS ONE 5 (11): e15455. doi: 10,1371 /journal.pone.0015455

Redaktør: Janine Santos, University of Medicine og Dentistry of New Jersey, USA

Modtaget: 26 juli, 2010; Accepteret: September 26, 2010; Udgivet: November 29, 2010

Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Public Domain erklæring hvori det hedder, at når det først er i det offentlige rum, dette arbejde kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål

Finansiering:. JRB blev understøttet af en Career Development Award fra PanCAN, American Association of Cancer Research; midler fra den amerikanske Cancer Society (# IRG-08-060-01), og fonden til en Cure, Newtown, PA. MG blev støttet af National Institute on Aging-Intramural Research Program, National Institutes of Health. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

pancreasadenocarcinom (PDA) er en aggressiv malignitet med en dårlig prognose, selv efter kirurgisk resektion [1], [2]. Mens 5-fluorouracil (5-FU) og gemcitabin (GEM) med eller uden strålebehandling udgør standardbehandling i adjuverende de giver en lille forbedring i den langsigtede overlevelse [3], [4], [5]. Derfor er en bedre forståelse af erhvervet og

de novo

kemoterapeutiske resistensmekanismer er nødvendigt for os at forbedre de nuværende behandlingsstrategier. Selvom meget er blevet lært om de molekylære forandringer, der er involveret i processen med pancreas tumorigenese har der været ringe succes i vores forståelse af, hvorfor bugspytkirtelkræftceller er resistente over for kemoterapi [6], [7].

pp32 ( ANP32A) har et unikt mønster af ekspression i mange humane cancere [8], [9], [10], [11]. pp32 fungerer som en tumor suppressor protein [12], som påvist ved dets evne til at inhibere

K-RAS

medieret malign transformation [13], [14]. Vi har tidligere vist, at pp32 ekspression korrelerer med differentiering status PDA, med normale ekspressionsniveauer detekteret i veldifferentierede tumorer, men reduceret-til-fraværende ekspressionsniveauer i dårligt differentieret tumorer [14]. Disse resultater er vigtige, fordi ringe differentierede former af PDA er almindelig praksis og aggressiv, men lidt er forstået om de specifikke molekylære karakteristika ved denne form for PDA [15]. I en tidligere undersøgelse, indføring af pp32 i et dårligt differentieret pankreatisk cellelinie forårsaget cellecyklusstandsning og inhiberede cellevækst [14].

pp32 har vist sig at være en bindingspartner af multiple vigtige proteiner [14], [16], [17], [18], [19]. Tidligere arbejde viste, at pp32 er involveret i: 1) stabilisering af visse mRNA’er forsynet AU-rige elementer (Ares) i de 5′- og 3′-utranslaterede regioner (UTR’er) via interaktionen af ​​pp32 med RNA-bindende protein Hur (ELAVL1) [18]; 2) ændring af histonacetylering gennem dens rolle i inhibitor af acetyl transferase kompleks (betegnet INHAT) [17]; og 3) modulering af cellecyklussen gennem dets interaktion med den phosphorylerede form af Rb [18], [19], [20], [21].

For nylig har vi også opdaget, at en bindingspartner af pp32, HUR [18], [22], er centralt for GEM effekt mod bugspytkirtelkræftceller [23]. Vi viste, at HUR kan associere med deoxycytidinkinase (dCK) mRNA og dermed regulere dCK proteinekspression [23]. Denne forening er forbedret, når bugspytkirtelkræftceller udsættes for GEM. Ved GEM eksponering, DCK stiger til at metabolisere GEM (en nukleosidanalog) fra en prodrug til dets aktive metabolitter. Derfor patienter behandlet med GEM hvis resektion tumorer udtrykte forhøjede cytoplasmatiske HUR niveauer havde en 7-fold stigning i overlevelse sammenlignet med patienter med operativt fjernede tumorer udtrykker lav cytoplasmatisk HUR [23]. Denne tidligere arbejde danner rammen for at udforske HUR og beslægtede proteiner (pp32) i forbindelse med kemoterapeutiske effekt [24].

Den nøjagtige rolle pp32 som et tumorsuppressorgen og i sin rolle i HURs posttransskriptionel regulering af target mRNA’er er stort set ukendt. Tidligere pp32 co-immunpræcipiteret med HUR i cellekulturmodeller og det blev vist, at pp32 s motiver RNA anerkendelse var kritisk for denne interaktion [18]. Endvidere har forskellige forskere hævdet, at pp32 er strengt nukleare eller cytoplasmatisk. Brennan

et al.

Først beskrevet pp32 som et protein, der kan shuttle mellem kernen og cytoplasmaet sammen med Hur [18]. Baseret på dette arbejde, vi søgte at udforske funktionelle forbindelser mellem pp32 og HUR i forbindelse med kræft i bugspytkirtlen celleoverlevelse (dvs. vækst kræftcellen og GEM effekt).

Metoder

Etablering af isogene pp32 -overexpressing og kontrol cellelinier

MiaPaCa2 celler blev transficeret under anvendelse af Lipofectamine (Invitrogen, Carlsbad, CA). Fuldlængde pp32 cDNA blev subklonet ind i plasmidet pC3.1 Zeo (Invitrogen), som har en Zeocin ™ resistens til selektion som beskrevet tidligere [14], [23].

For hver prøve 5 ul af VERIFY Antigen Standard Origene overekspression lysat (1 ug /1UL) blev placeret med 5 pi 2x SDS Sample Buffer (OriGene Rockville, Maryland). Overekspression af pp32, Hur, eller tom vektor var drevet af en pCMV6-indtastning Vector plasmid, som tilføjede en C-terminal Myc /DDK tag til hvert gen (OriGene). Prøver blev fremstillet og derefter sat på en NuPage 10% Bis-Tris Gel og separeret ved 200 volt i 60 minutter. Proteiner blev derefter overført til en PDVF-membran ved 30 volt i 90 minutter. Membranen blev blokeret i 1 time. Membranerne blev undersøgt med primære antistoffer (thymidylatsyntaseinhibitorer, DCK, pp32, Hur, og alpha-tubulin, Santa Cruz Bioteknologi, Santa Cruz, CA) natten over. Koncentrationerne for primært antistof var som følger: Hur 1:1000, dCK 1:500, TS og alfa tubulin 1:200. Probet antistoffer blev derefter vasket med TBST-opløsning og sekundært antistof blev påført med Santa Cruz gede-anti-muse-IgG-HRP-antistof i en koncentration på 1:10,000. Membraner blev derefter vasket og udviklet ved hjælp af Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate detektionssystem (Millipore, Billerica, MA).

Transient transfektion af pp32 ekspressionsvektor og siRNA for ribonucleoprotein immunfældning binding (RNP-IP) assays.

Transient transfektion blev udført som beskrevet ovenfor. siRNA knockdown blev udført ved anvendelse af et pp32 designet lille interfererende siRNA (Dharmacon, Thermoscientific) med anvendelse af oligofectamine (Invitrogen) som tidligere beskrevet [9], [23]. I korte, bugspytkirtelkræft cellelinier PL5 og MiaPaCa2 celler udpladet ved 60% sammenløb og transficeret i Oligofectamine og Optimem (Invitrogen) ved hjælp af pp32 siRNA og en negativ kontrol scramble sekvens (Dharmacon). Celler blev indsamlet efter 48 timer for immunoblot, følsomhed analyser, og RNP-IP-analyser.

Isolering af RNA og genomisk DNA påvisning af plasmider

For at bekræfte overekspression og reduktion af pp32 mRNA i cellen linjer, blev semikvantitativ RT-PCR udført. MiaPaCa2 pp32-transficerede (Mia.pp32) og tom vektor (Mia.EV) celler blev trypsinbehandlet og opsamles som tidligere beskrevet [25] og vores genereret gøre novo ud fra den tidligere genererede og købt parental bugspytkirtelkræft cellelinje (ATCC, Manassas, VA ). Genomisk DNA blev isoleret fra Mia.pp32 og Mia.EV cellelinier og plasmid integration blev bekræftet ved udførelse af PCR med en fremadrettet primer specifik for T7-sekvens af plasmidet og en revers primer specifik for pp32: FWD 5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3 ‘ , REV 5’-CAGGTTCTCGTTTTCGCTTC-3 ‘.

Samlet RNA blev isoleret under anvendelse RNeasy RNA-isolering (Qiagen) og derefter behandlet med Turbo-DNA

gratis

(Ambion, Austin, TX) til fjerne spormængder af gDNA [25].

ribonukleoprotein immunpræcipitering (RNP-IP) og real-time kvantitativ PCR (qPCR).

Celler blev udpladet ved 65% konfluens og behandles som anført. Immunpræcipitation blev udført under anvendelse af enten anti-Hur eller anti-IgG-kontrol antistoffer som beskrevet tidligere (MBL International, Woburn, MA) [23], [26]. RT-PCR blev derefter udført, efter masse normalisering af RNA-prøver, for at generere cDNA. Optisk densitet af cDNA blev målt og RT-kvantitativ PCR (qPCR) blev udført på et ABI 7500 instrument; 75 ng cDNA skabelon blev anvendt pr reaktion at bestemme den relative forekomst af dCK, VEGF og Hur mRNA’er; Prøverne blev normaliseret til GAPDH mRNA-niveauer.

SDS-PAGE /Western Blotting

Mia.pp32 og Mia.EV celler blev trypsinbehandlet og hel-cellelysater blev opnået under anvendelse af RIPA-lysepuffer. Proteinkvantificering blev udført under anvendelse af et Bradford-assay (BioRad, Hercules, CA). Prøvekoncentrationer blev udlignet ved anvendelse af RIPA. Prøver blev derefter blandet 1:01 med 2X Laemmli-buffer og adskilt anvendelse af en 10% Bis-Tris polyacrylimide gel i 1x MOPS løbebuffer og proteiner blev overført og blottet med viste antistoffer som tidligere beskrevet ovenfor [13].

immunofluorescens

Mia.pp32 og Mia.EV celler blev udpladet på kammerobjektglas og behandlet med de angivne lægemidler. Efter behandling blev cellerne vasket i PBS, inkuberet med den angivne antistof og behandles som beskrevet tidligere [23]. Cellekerner blev farvet med DAPI og kammer slides blev monteret til analyse med en Zeiss LSM-510 Konfokal Laser Microscope.

Cytoplasmiske Uddrag

MiaPaCa2 celler blev udsået på 60% sammenløb. Seks timer efter behandling med 1 uM gemcitabin (Eli Lilly) eller ingen behandling blev cytoplasmatiske ekstrakter fremstillet som beskrevet [23], [26], og immunoblotanalyse udført [23] ved hjælp af primære antistoffer, der er anerkendt HUR (3A2, 1:1000, Santa Cruz), hnRNP eller pp32 (1:500) [13].

vækst assay

Brug af samme transfektion protokol skitseret ovenfor, MiaPaCa2 parentale celler blev transficeret med lige store mængder af pp32-kodning og tom vektor pcDNA i T-75 kolber. Medier blev ændret, og Zeocin ™ selektion blev udført som beskrevet ovenfor. Ved afslutningen af ​​perioden på to uger, mediet blev aspireret og kolber blev farvet med krystalviolet-opløsning i 20 minutter, efterfulgt af grundige vaske eller celler blev talt som beskrevet i figuren legenden. Salg

lægemiddelfølsomhed Assays

Følsomhed assays blev udført under anvendelse PicoGreen ™ (Invitrogen), et fluorescerende farvestof, der selektivt binder dobbeltstrenget DNA. Intensiteten af ​​fluorescenssignalet korrelerer med antallet af levedygtige celler. Kort fortalt blev 2000 celler udpladet pr brønd i en plade med 96 brønde og behandlet 24 timer senere [23]. Kemoterapeutika blev købt fra Sigma, medmindre andet er nævnt.

RNA bindende analyser

For ribonukleoprotein immunpræcipitering (RNP-IP) analyse, MiaPaCa2 celler udpladedes på en 65% sammenflydning, behandlet 24 timer senere med 1 uM gemcitabin i 3 timer og IP udføres ved anvendelse af enten anti-Hur eller IgG-kontrolantistoffer som beskrevet [23], [26]. Efter RNA isolering blev dCK mRNA-niveauer målt ved PCR-analyse ved anvendelse af primere TCTCTGAATGGCAAGCTCAA og CTATGCAGGAGCCAGCTTTC [23].

Immunhistokemi og patientprøver

formalin-fikseret, paraffinindlejrede blokke blev behandlet som beskrevet [ ,,,0],23] ved hjælp af varme antigen-genvinding og avidin-biotin kompleks detektion. Immunfarvning blev udført på 37 resektion PDA prøver fra Thomas Jefferson University patologi arkiver efter Thomas Jefferson University Institutional Review Board (IRB). Vi levet op til alle etiske overvejelser heri. Alle patientprøver anvendte var under Thomas Jefferson University Institutional Review Board (IRB) godkendt protokol. denne undersøgelse blev således udført med 100% patient samtykke. Ingen nye cellelinjer genereret direkte fra humant væv blev anvendt til denne undersøgelse. Samtykke blev skrevet. IRB godkendelse titel er “Indsamling, Banking, og evaluering af væv, blod, bugspyt og galde fra patienter med pancreas og relaterede karcinomer gennemgår kirurgisk resektion.” I overensstemmelse med den amerikanske Department of Health og Human Services (IRB godkendt). Størstedelen af ​​patienterne fik GEM alene eller i kombination med Xeloda eller strålebehandling. Antistoffer, som genkender pp32 [14] eller HUR [23] blev anvendt tidligere [23]. Cellulær lokalisering (nuklear versus cytoplasmatisk) og farvningsintensitet (stærk versus svag) blev bedømt. Baseret på procentdelen af ​​farvede celler ( 50% versus 5-50%) ekspressionen blev scoret som diffus eller fokal, henholdsvis. Overlevelse kurver blev genereret ved hjælp af GraphPad Prism (version 4.0), og p-værdier beregnet ved hjælp af en log-rank (Mantel-Cox) test.

Resultater

Karakterisering af pp32 overudtrykkende cellelinjer

Plasmid integration i MiaPaCa2 celler blev bekræftet ved PCR amplifikation af genomisk DNA (data ikke vist). Figur 1 viser en bekræftelse af pp32-protein-overekspression i Mia.pp32 cellelinje i forhold til Mia.EV. Lig protein loading blev bekræftet ved farvning af membranen ved hjælp af Fast Green (figur 1A). Den stærke nukleare tilstedeværelse af pp32 i Mia.pp32 celler blev påvist ved immunfluorescens (figur 1B). Periodisk immunoblotanalyse blev udført for at validere fortsat overekspression af pp32 protein i Mia.pp32 celler (figur 1).

(A) Immunoblotanalyse af proteinlysater fra Mia.pp32 celler og kontroller. Mia.pp32 celler udtrykker øget pp32 niveauer end Mia.EV celler. (B) Immunofluorescens med Mia.pp32 og Mia.EV celler (

top

). Immunofluorescens blev også udført med mærkning af HUR, pp32 og DAPI under en større forstørrelse (

bund

). Celler blev derefter analyseret ved hjælp af laser konfokal mikroskopi. (C) Mia.pp32 celler har reduceret vækstpotentiale i forhold til Mia.EV celler. (

Venstre

) Cellerne blev ligeligt belagt og indsamlet på dag 3 og 5 og tælles. Fem gange færre Mia.pp32 celler blev talt på fem døgn i forhold til Mia.EV celler. (

Right

) MiaPaCa2 celler blev transficeret med lige store mængder af pp32 og tomme pcDNA 3.1 (Zeo). Kolberne blev behandlet på samme måde over en periode på to uger og efterfølgende farvet med krystalviolet til kvantificering af antallet af levedygtige celler (se metoder). Hver kolbe er repræsentativt for 3 kolber.

bugspytkirtelkræftceller har reduceret vækstpotentiale i forhold til at styre celler.

Talrige forsøg på at generere Hs766T og PL5 celler overekspression pp32 lykkedes, mens den tomme vektor plasmidet genereret kolonier rutinemæssigt (upublicerede data, se fremgangsmåder) [14]. Lignende resultater blev beskrevet i tidligere undersøgelser [8], [14].

Mia.pp32 celler rutinemæssigt kræves mindre hyppig passage end Mia.EV celler. Vækst-assays (figur 1C,

venstre

) udført som beskrevet (se metoder) viste, at ved dag 5, der var 5 gange færre Mia.pp32 celler end Mia.EV celler. Bemærk den typiske logartihmic vækst af Mia.EV sammenlignet med den stumpe, lineær vækstrate på Mia.pp32. Vi har ikke observere betydelig celledød i enten cellelinje i sub-sammenflydende tilstand, støtter den konklusion, at reducerede cellevækst, snarere end apoptose, tegnede sig for den dramatiske forskel i celletal, som tidligere beskrevet [14].

Vi transficeret de pp32 og tomme vektor plasmider i lige store mængder af forældrenes MiaPaCa2 celler. En dramatisk reduktion i vækst i MiaPaCa2 celler transficeret med pp32 blev detekteret i forhold til cellerne transficeret med tom vektor. Vi bemærkede markant nedsat farvning i pp32-transficerede kolbe (figur 1C,

højre

), hvilket viser formindsket vækst potentiale i disse celler sammenlignet med kontrollen. Tilsammen udgør disse eksperimenter udelukkede den mulighed, at pp32 reduceret celleproliferation skyldes “positions-virkning variegation” som følge af den tilfældige integration af et gen i en uønsket region i genomet.

lægemiddelfølsomhed assays afslørede Mia.pp32 celler til at være resistente over for nukleosidanaloger

Når stabilt transficerede Mia.pp32 og Mia.EV cellelinier blev etableret, blev cellerne behandlet med forskellige kemoterapeutiske midler fra forskellige lægemiddelklasser (tabel 1). For de fleste lægemidler, såsom etoposid, cisplatin, oxaliplatin (figur 2A), cyclophosphamid og paclitaxel (figur 2B, se tabel 1 for narkotika klasse beskrivelser) kun ubetydelige ændringer i kemosensitivitet blev set mellem Mia.pp32 og Mia.EV celler (tabel 1 og Figur 2A og B). En ekstra sub-linje af pp32 transfekterede celler (Mia.pp32-2) blev inkluderet som en eksperimentel kontrol, og forskelle blev fundet mellem alle pp32 overekspression cellelinjer og de tomme vektor kontrol celler, hvilket udelukker en artefakt af kloning (figur 2 ). Både Mia.pp32 linjer og Mia.EV prolifererede med samme hastighed, som angivet ved ubetydelige forskelle observeret i celle surivival procentdele mellem cellelinierne ved ekstremt lave doser og koncentrationen af ​​hver testet (Figur 2A-C) lægemiddel.

Overlevelse af Mia.pp32 og Mia.EV linjer blev målt ved PicoGreen assayet efter 5-7 dages inkubation med de angivne lægemiddeldoser. (A) Lægemidler, der forårsager ingen pp32-afhængig følsomhed; (B), lægemidler udviser beskedne forskelle i følsomhed; (C) stoffer, for hvilke pp32 tillagt forøget modstand. Grafer udgør enkeltstående eksperimenter (± S.E.M.); hvert forsøg er repræsentativt for tre individuelle eksperimenter. Mia.pp32 linjer er angivet som ▴▪ og de tomme vektor kontrol celler er angivet som ♦.

Der var en beskeden stigning i følsomheden af ​​Mia.pp32 linjer til protein kinase C inhibitor STAUROSPORIN (STS) sammenlignet med Mia.EV (figur 2B,

højre

). Mia.pp32 celler var to gange mere følsom over for 5-FU i forhold til Mia.EV celler (figur 2C,

venstre

). Imidlertid blev den mest dramatiske ændring noterede sig med narkotika fra samme klasse, der benytter dCK for cellulær metabolisme: GEM og cytarabin (Ara-C) (tabel 1 og figur 2C,

center og højre

). Mia.pp32 celler viste en ti-fold resistens over for GEM forhold til Mia.EV, og en 2-fold resistens over for ARA-C (tabel 1 og repræsentative data, figur 2C,

center

).

siRNA knockdown af endogen pp32 udtryk sensibiliserer celler til gemcitabin

pancreascancer cellelinje PL5, med rigelige pp32 udtryk, blev forbigående transficeret med enten pp32 siRNA eller en kontrol forvrænget sekvens. Knockdown af pp32-ekspression (figur 3A) afsmeltet celler ca. 3 gange mere følsomme over for GEM sammenlignet med kontrolceller (figur 3B). pp32 knockdown påvirkede ikke cellernes levedygtighed efter etoposid (en negativ kontrol) behandling (figur 3C). Vi har ikke observere ændringer i cellevækst parametre eller cellulære fænotype i pp32 siRNA celler.

(A) Immunoblotanalyse af pp32 overflod i lysater fra PL5 celler 48 timer efter transfektion. I celler transficeret som beskrevet i (A), blev følsomheden over for GEM (B) eller etoposid (C) blev testet af PicoGreen celleoverlevelse assay.

Overekspression og reduktion af pp32 forstyrrer VEGF, Hur og dCK mRNA udskrift binding til HUR og reducerer dCK proteinekspression

Tidligere vi demonstreret, at dCK mRNA binder til HUR og forbedrer dermed dCK protein oversættelse [23]. Vi manipuleret pp32 ekspressionsniveauer (figur 4A) i isogene cancerceller og derefter vurderes kvantitativt associering af kendte Hur mRNA målretter DCK [23], vaskulær endothelial vækstfaktor (VEGF) [27], og Hur [28] mRNA’er med HUR ved ribonucleoprotein immunopræcipitation (RNP-IP) assay som tidligere beskrevet [23]. Efter en kort GEM behandling blev associering mellem Hur og dCK mRNA detekteret i MiaPaCa2 celler (figur 4B). Imidlertid blev en signifikant reduktion i dCK, VEGF og Hur mRNA’er detekteret i Hur antistof-immunpræcipiteret-RNA fra celler, der overudtrykker pp32 (Figur S1 og figur 4A og B); mens i pp32 siRNA-transficerede celler en betydelig, konsekvent forbedring ( 4-fold) i dCK, VEGF og Hur mRNA’er bundet til Hur (figur 4A og B). Fold ændringer blev bestemt ved at sammenligne Hur antistof-immunpræcipiteret-RNA’er fra transficerede celler at tømme-vektor transficerede celler, med normale, endogene pp32 ekspressionsniveauer. For specificitet, vi evalueret og fandt ikke nogen binding af GAPDH og pp32 mRNA (figur 4B og data ikke vist). Figur S1 viser den dramatiske effekt af stabil overekspression af pp32 (Mia.pp32 celler) har på dCK mRNA binding til HUR.

(A) pp32 mRNA niveauer normaliseret til GAPDH mRNA niveauer i tom-vektor transficerede celler, pp32 siRNA transficerede celler, og pp32 transficeres celler. Tal angiver gange ændring af pp32-mRNA-ekspression af mærket genereret cellelinjer sammenlignet med tom vektor kontrolceller. (B) Hur binding til VEGF og dCK mRNA’er blev påvist ved RNP-IP-analyse i MiaPaCa2 celler transficeret med pp32 siRNA, pp32 plasmidet eller tom vektor kontrol (A). mRNA-niveauer i HUR og IgG IP prøver blev først normaliseret til GAPDH mRNA-niveauer i de samme IP reaktioner, og derefter plottes som relativ fold berigelse i VEGF, dCK, og HUR mRNA i HUR IP vs IgG IP. Data viser middelværdien fra 3 uafhængige datapunkter. To uafhængige forsøg blev udført for at bekræfte resultaterne. Tal angiver fold ændringer i forhold til IgG kontrol. (C) Western blot-analyse af pp32 og DCK ekspressionsniveauer i proteinlysater fra Mia.pp32 og Mia.EV celler. (D) Tre baner repræsenterer lysater fra HEK293T celler genereret at enten venstre mod højre: overudtrykker HUR, tom vektor eller pp32 tagget med myc /DCK. Western blot-analyse omfattede antistoffer, som genkender pp32, HUR, DCK, alpha-tubulin, og thymidylatsyntase (TS) proteiner.

Derudover fandt vi, at DCK protein niveauer blev reduceret i Mia.pp32 celler i forhold til kontrolceller (figur 4C). Endelig har vi anvendt en anden cellekultur model til at validere disse resultater. Protein lysater fra Humane HEK293T celler (se metoder), der overudtrykkes HUR, pp32 og en kontrol vektor. Validering af HUR og pp32 overekspression blev bekræftet ved immunoblotting (figur 4D). Som forventet, vi har registreret øget dCK proteinekspression i HUR overekspression lysaterne [23] i forhold til at styre og faldt dCK proteinekspression i pp32 overekspression lysater i forhold til kontrol (figur 4D). Alpha-tubulin og thymidylatsyntase blev brugt til at vise lige protein belastning. Disse data bekræfter, at dCK er opreguleret i en indstilling, når HUR er overudtrykt og nedreguleres i en indstilling, når pp32 er overudtrykt. Tilsammen indikerer disse data, at pp32 kan påvirke både dCK mRNA binding til HUR og dCK proteinekspression (figur 4).

STS og GEM forbedret cytoplasmatisk pp32 overflod

Vi bekræftede tidligere rapporter [29 ] at STS kan øge de cytoplasmatiske niveauer af både Hur og pp32 i cancerceller (figur 5A). Tilsvarende GEM behandling steg pp32 cytoplasmatisk overflod, men i mindre grad end Hur (figur 5A). Stigningen i pp32 og Hur cytoplasmiske niveauer efter GEM behandling blev vurderet ved Western blot-analyse (figur 5B). Ingen ændring i pp32 og Hur ekspression blev påvist i helcellelysater fra GEM-behandlede celler (figur 5B), i overensstemmelse med vores tidligere resultater [23]. Kontrol af niveauerne for hnRNP (C1 /C2) bekræftede renheden af ​​de cytoplasmatiske lysater (figur 5B).

(A) immunofluorescens viser forøget Hur og pp32 cytoplasmatisk ekspression i celler behandlet med STS (1 uM i 3 timer ) og GEM (1 uM til 3 h), som angivet ved de hvide pile. (B) Immunoblotanalyse af HUR og pp32 niveauer i cytoplasmatiske og helcellelysater fremstillet ud fra celler, der blev behandlet som forklaret i (figur 5).

Nuklear pp32 intensitet er en biomarkør for dårlig prognose i PDA, men ikke øge den prædiktive værdi af HUR til GEM behandling

Vi separat opdaget både stærke og svage kernekraft og cytoplasmatisk udtryk for både Hur og pp32 i PDA prøver [14], [23] (tabel 2 og figur 6A, HUR,

venstre panel

og pp32,

højre panel

). For alle patienter behandlet med GEM (n = 31) [23], har pp32 nukleare intensitet ikke korrelerer signifikant med GEM respons med hensyn til samlet overlevelse (figur 6B). pp32 nukleare ekspressionsniveauer i kombination med HUR cytoplasmatisk status (figur 6C og D) ikke øge den prædiktive værdi af HUR alene som en markør for GEM respons (p = 0,0009, data nu vist [23]). Vi fandt en beskeden sammenhæng mellem pp32 og Hur subcellulære lokalisering ekspressionsniveauer (tabel 3). Tabel 2 beskriver sammenhængen mellem lave nukleare pp32 niveauer og mere aggressive tumorer (højere lønklasse, p = 0,0002, og positiv for lymfeknude metastaser, p = 0,0069, se tabel 2). Dette beviser understøtter vores tidligere fund, i en særskilt klinisk datasæt, der viser, at lav pp32 udtryk korreleret med dårligt differentierede PDA’er [14], [15].

(A) Den overflod og subcellulære lokalisering af HUR (

venstre

) og lav til fraværende nukleare pp32 udtryk (

rigtige

) i prøver fra bugspytkirtlen kræftpatienter blev vurderet ved immunhistokemi; forstørrelse, 200x. Prøver er repræsentative for det analyserede i B-D kohorte. (B) Sammenhæng mellem pp32 nukleare udtryk og respons på GEM behandling (p = 0,3, log rank test). (C) Sammenhæng mellem høje pp32-udtrykkende tumor prøver nukleare stratificeret i høj eller lav HUR status i forhold til GEM respons (p = 0,88, log rank test). (D) Sammenhæng mellem høje cytoplasmatiske HUR-udtrykkende tumor prøver stratificeret i høj og lav pp32 nukleare udtryk korreleret med GEM respons (p = 0,25, log rank test). Vejviser

Diskussion

Talrige forskere har uafhængigt karakteriseret pp32 som et tumor-suppressor-protein i en række forsøgsmodeller [8], [9], [12], [13], [30], [31]. Tidlige undersøgelser viste, at pp32, gennem et bestemt domæne består af ca. 25 aminosyrer, handlet som en tumorsuppressor ved at inhibere K-ras, en mutant p53, c-Jun, E1A, E6, E7 og [12], [13]. Vi fandt en stærk korrelation mellem de to high-grade tumorer og lymfeknude metastaser med svag pp32 nukleare udtryk (tabel 2), støtte vores tidligere resultater, som pp32 fungerer som en tumor suppressor protein i PDA [14]. Vores resultater antyder, at pp32 ekspressionsniveauer direkte forstyrre eller lette Hur evne til at understøtte levedygtigheden cancercelle og proliferation ved at forstyrre stabilisering af mRNA-transkripter koder for proteiner nødvendige for tumorcelleoverlevelse, såsom dCK, VEGF, eller Hur (figur 7). Vi postulerer, at tilstedeværelsen af ​​pp32 kan forstyrre HURs rolle i at støtte tumorigenese og kræft celle overlevelse, mens fraværet af pp32 letter tumorigenese. Vores arbejde støtter og udvider over ti års forskning, der har vist, at pp32 virker som et tumorsuppressorgen i flere modeller og tumor-systemer [8], [9], [11], [12], [13], [30] [31], [32] (Figur 7).

på venstre side viser et scenarie, hvor pp32 formindskes eller fraværende (tumorigenese) og HUR er til rådighed til at associere og stabilisere mRNA, der understøtter kræftcelle overlevelse og levedygtighed. På højre side er et scenarie, hvor pp32 er til stede (tumor undertrykkelse) og HUR ikke kan binde til mRNA vigtige for kræftcellen overlevelse. Bemærk: GEM er mere tilbøjelige til at blive metaboliseret fra dets prodrug formular til dets aktive metabolitter af dCK i scenariet til venstre

Modulation af pp32 udtryk gennem overekspression eller lyddæmpning ændret følsomhed af kræftceller til. de nukleosidanaloger perle og Ara-C (figurerne 2C og 3). Yderligere, forstærkede eller reducerede pp32 ekspressionsniveauer direkte ændret interaktionen af ​​Hur med dCK mRNA (figur 4) og signifikant sænket dCK proteinekspression (fig 4C og D). Disse data indikerer, at pp32 spiller en rolle i HURs post-transkriptionel regulering af dCK. Vi verificerede tidligere rapporter om, at cytoplasmatiske pp32 niveauer kan stige i tilstedeværelse af specifikke stressfaktorer [22], [33]. Måske forskellige stressfaktorer transportere forskellige pp32 gen familiemedlemmer sammen med HUR. For eksempel, Fries B

et al.

Viste, at

april

og ikke pp32 fungerer som en ligand og kan hjælpe HUR i sin transkriptionel regulering af CD83 [33]. Medlemmer af pp32 protein familien (f.eks APRIL pp32r1, pp32) sandsynligvis give yderligere reguleringsmekanismer for HUR og sit mål mRNA [31].

Selvom vores data giver stærke beviser for, at pp32 modulerer HURs funktion, vores kliniske data viser, at, før behandling, endogen pp32 udtryk og subcellulære lokalisering ændrer ikke HURs prædiktiv værdi af GEM respons (figur 6). Endvidere medens en forening blev fundet mellem pp32 og Hur subcellulære lokalisering i tumorprøver (tabel 3), fremgår det, at hvert protein ikke helt regulere den subcellulære lokalisering af den anden

in vivo

.