PLoS ONE: Epigenetisk Regulering af thyroidhormonreceptor Beta i Renal Cancer

Abstrakt

Thyroid hormon receptor beta (

THRB

) genet er almindeligt dereguleret i kræft, og som styrkes ved dyremodeller, postuleres at spille en tumor-undertrykkende rolle. Vores tidligere undersøgelser viste nedregulering af

THRB

i klar celle renalcellecarcinom (ccRCC), men de culpøse mekanismer er ikke fuldt belyst. Da epigenetisk regulering er en fælles mekanisme påvirke ekspressionen af ​​tumorsuppressorer, vi hypotese, at nedregulering af

THRB

i nyrekræft resultater fra epigenetiske aberrances, herunder CpG methylering og microRNA-afhængige lyddæmpning. Vores undersøgelse viste, at ccRCC tumorer udstillet et fald i 56%

THRB

og en stigning på 37% i DNA methyltransferase en (DNMT1) udtryk sammenlignet med parrede ikke-neoplastiske kontrolprøver. Men

THRB

CpG methylering analyse udføres ved hjælp BSP, Snapshot og MSP-PCR konsekvent viste ingen ændringer i mønstre for methylering mellem matchede tumor og kontrolprøver.

I silico

analyse resulterede i identifikationen af ​​fire mikroRNA (MIR-155, mir-425, MIR-592, og MIR-599) som potentielt rettet mod

THRB

udskrift. Luciferase assay viste direkte binding af miR-155 og miR-425 til 3’UTR af

THRB

og efterfølgende in vivo analyser viste, at transfektion af UOK171 cellelinje med syntetisk miR-155 eller miR-425 resulterede i nedsat udtryk for endogene

TRHB

med 22% og 64%, hhv. Endelig viste real-time PCR-analyse signifikant opregulering af MIR-155 (354%) og MIR-425 (162%) i ccRCC sammenlignet med matchede kontroller. Desuden blev microRNA niveauer negativt korreleret med mængden af ​​

THRB

afskrift i vævsprøver. Vi konkluderer, at CpG methylering er ikke den vigtigste mekanisme bidrager til faldet

THRB

udtryk i ccRCC. I modsætning hertil

THRB

er målrettet efter microRNA miR-155 og miR-425, hvis øget ekspression kan være ansvarlig for nedregulering af

THRB

i ccRCC tumorer

Henvisning.: Wojcicka A, Piekielko-Witkowska A, Kedzierska H, ​​Rybicka B, Poplawski P, Boguslawska J., et al. (2014) Epigenetisk Regulering af thyroidhormonreceptor Beta i nyrekræft. PLoS ONE 9 (5): e97624. doi: 10,1371 /journal.pone.0097624

Redaktør: Javier S. Castresana, Navarra Universitet, Spanien

Modtaget: 18. december 2013; Accepteret: April 23, 2014; Udgivet: 21. maj 2014

Copyright: © 2014 Wojcicka et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Undersøgelsen blev støttet af National Science Centre giver NN401611940 og NN401047638 (til AN), UNESCO /FEBS Collaborative Eksperimentel Scholarship for Central- Østeuropa, 2010 (til AW), og National Science Centre Grant 2012/05 /B /NZ5 /01541 (til APW). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Thyroid hormon-receptorer (TRS): TRa og TR, er ligand (3,5,3′-triiodothyronine, T3) inducerbare transkriptionsfaktorer, der medierer de cellulære virkninger af thyreoideahormoner, nemlig dets aktive form – T3 . Da T3-afhængige gener indbefatter talrige vigtige regulatorer af cellecyklus, såsom MDM2, p53 og retinoblastoma [1], [2], handlinger TRs bidrager til opretholdelse af vigtige cellulære processer, herunder proliferation, differentiering, apoptose og metabolisme [3]. TR’er omfatter 3 funktionelle proteiner: TRα1, TRβ1 og TRβ2, kodet af

thrA

og

THRB

gener. TRα1 og TRβ1 receptorer udtrykkes i stort set alle væv, men deres ekspressionsniveauer og funktionalitet afhænger af celletypen og udviklingsstadiet af en organisme. Disturbed aktivitet af TRs, der skyldes aberrances i ekspression eller sekvenser af gener, der koder for TRs er et almindeligt fænomen i humane cancere. Det fører til forstyrret udtryk for T3-afhængige gener og følgelig til svær svækkelse i cellulær homeostase. Disse bemærkninger førte til hypotese om tumor undertrykkende rolle TR, yderligere bekræftet i flere elegante undersøgelser i cellelinjer og musemodeller [4], [5].

En af de kræftformer, hvor aberrances i TR-funktion ofte observeres, er den mest almindelige form for nyre tumorer – klar celle renalcellecarcinom (ccRCC). Mest interessant,

THRB

gen bosat inden 3p21-25 kromosomal region, der er kendt som et hot spot for mutationer i gener involveret i ccRCC patogenese [6]. De culpøse mekanismer identificeret hidtil omfatte mutationer, afvigende udtryk og dereguleret splejsning [7], [8] [9].

Det har vist, at ccRCC ledsages af epigenetiske aberrances, der direkte kan bidrage til tumorigen proces , der handler på tidlig og præcancer fase af flertrins renal tumorgenese [10]. Talrige nylige undersøgelser tyder på, at epigenetisk deregulering er blandt de hyppigste årsager til afsporede handlinger tumorsuppressorer i kræft, og hyppigst identificerede mekanismer omfatter DNA methylering og microRNA’er. DNA-methylering består i tilsætning af en methylgruppe til en cytosin foregående guanin (CpG) i DNA-sekvensen, og katalyseres af DNA-methyltransferaser (DNMTs): DNMT1, DNMT3A og DNMT3B. DNMT3A og DNMT3B er

de novo

methyltransferaser udtrykt overvejende i de tidlige stadier af udvikling [11], at opretholde forældrenes methylering mønstre. DNMT1 omtales som opretholdelse methyltransferase, som den er ansvarlig for opretholdelse af mønstre for methylering under DNA-replikation [12]. Afvigende methylering i kræft er forårsaget af nedsat ekspression og funktion af DNMTs. Cancerceller udviser sædvanligvis samlet genomisk hypometylering, hvilket fører til ustabilitet af mikrosatelitter og aktivering af gener involveret i metastatiske ændringer [13], [14]. Samtidig alvorlig hypermethylering af regulatoriske regioner af tumor supressors, DNA-reparation og cellecyklus kontrol gener fører til progression af cancer [15]. For ccRCC blev det vist, at mange tilfælde af nedreguleret udtryk for VHL tumor suppressor, inaktiverede i ca.. 50% af ccRCC patienter, skyldes hypermethylering af genets promotor [16].

MikroRNA’er (miRNA) er korte RNA’er, som inhiberer ekspression af proteinkodende gener ved at binde til komplementære sekvenser i 3’UTRs (utranslaterede regioner ) af deres udskrifter. Sekvensen er ansvarlig for denne anerkendelse omfatter nucleotiderne 2-8 af en miRNA og skal være fuldstændigt komplementær til målsekvensen i mRNA [17]. Talrige kræftformer udviser afvigende ekspression af microRNA, hvilket fører til udtalte ændringer i transkriptom og proteomanalyse af en kræftcelle. For ccRCC blev en række af microRNA vist sig at være dereguleret i tumor [18] – [21]. Både DNA methylering og microRNA-afhængig regulering har for nylig bragt opmærksomhed som to mekanisme med størst potentiale for mulige terapeutiske interventioner [22]. Det blev vist, tumorsuppressorgener, tavse grund DNA hypermethylering, kan reaktiveres med demethyleringsmiddel midler. Desuden er microRNA efterligner og inhibitorer i øjeblikket evalueret som terapeutiske molekyler, der viser lovende i personlig kræftmiddel [23].

rolle epigenetiske ændringer i

THRB

forstyrrelser i kræft er blevet undersøgt i en få undersøgelser. Den potentielle rolle microRNA-afhængig regulering i

THRB

lyddæmpning blev foreslået for ccRCC [9] og bevist for papillær thyreoideakarcinom [24]. Flere andre undersøgelser antydet DNA hypermethylering som en mekanisme bidrager til

THRB

nedregulering i leukæmi og kræft i bryst, lunge, og skjoldbruskkirtel [25] – [30]

Disse undersøgelser samt hyppige. epigenetiske deregulering observeret i ccRCC [31], fik os til at analysere de mulige konsekvenser af DNA methylering og microRNA-afhængige forordning om

THRB

udtryk i nyrekræft.

Materialer og Metoder

Materiale

Vævsprøver blev opnået med tilladelse af bioetiske komité af Center for Postgraduate Medical Education i Warszawa fra patienter med klar celle renalcellecarcinom (ccRCC) (tabel S1). Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle patienter. Prøverne blev opdelt i to grupper: cancervæv (n = 35, T) og kontrol-væv (parret normalt væv fra den modsatte pol af maligne nyre ( 5 cm fra tumor) med ingen histologiske tegn på tumor; n = 35 , C). ccRCC blev diagnosticeret ved histologi ifølge WHO kriterier [32]

Følgende cellelinier blev anvendt i undersøgelsen:. 1) HK-2 (ATCC nr .: CRL-2190), en proksimal rørformet cellelinie afledt fra normal nyre, udødeliggjort af transduktion med human papillomavirus 16 (HPV-16) E6 /E7-gener. 2) UOK171 (UOB tumorcellelinjen Repository, leveret af Dr. W Marston Linehan, NIH, NCI, Bethesda, USA, patent E-033-2010 /0): stammer fra IV etape ccRCC tumor, spontant udødeliggjort. 3) HeLa (ATTC nr CCL-livmoderhals adenocarcinom. Alle cellelinier blev dyrket i overensstemmelse med udbyders anvisninger.

Real-time PCR

RNA blev isoleret og revers transskriberet som tidligere [33] beskrevet. 200 ng RNA blev anvendt til revers transkription Real-time PCR blev udført som tidligere beskrevet [33] anvendelse af primere specifikke for transkripter af

THRB

(THRB-RT-F:. GAACAGTCGTCGCCACATC og THRB-RT-R: GCTCGTCCTTGTCTAAGTAAC) og

DNMT1

(DNMT1-RT-F: TTATCCGAGGAGGGCTAC og DNMT1-RT-R:. GGCTTCACTTCTTGCTTG) revers transkription og real-time PCR af microRNA blev udført som beskrevet tidligere [34] ved hjælp af Taq-mand sonder specifikt for HSA-mIR-155 (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA, kat. nr. 002.623) og HSA-mIR-425 (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA, kat. nr. 001.516). Relativ kvantificering af hver udtrykt miRNA blev beregnet under anvendelse af standard 2-ACt metode associering mellem microRNA og

THRB

ekspression i vævsprøver blev beregnet ved anvendelse af R miljøet [35] og den multiple korrelationsanalyse ifølge formlen:.

5-aza-2′-deoxycytidin behandling

UOK-171-celler podedes på plader med 12 brønde (Corning, NY, USA) i en mængde på 5 × 10∧4 per brønd. Cellerne blev dyrket i 24 timer i standardbetingelser, efterfulgt af tilsætning af 100 mM eller 10 mM 5-aza-2′-deoxycytidin (5-aza-dC) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Efter 24 timer blev cellerne vasket med PBS og anvendt til RNA isolering.

Analyse af

THRB

Methylering

For methylering analyse, vi brugte sekvensen af ​​tidligere offentliggjorte

THRB

promotor [36], GenBank Acc. ingen. S37458.1), ajourført i overensstemmelse med rækkefølgen af ​​kromosom 3 genomisk contig (GenBank Acc. Nr. NT_022517.18). På grund af disconcordance mellem de to deponerede sekvenser, vi klonet og direkte sekventeret DNA-region omfatter

THRB

promotor.

For at opnå dette, genomisk DNA blev isoleret fra en ikke-tumorform nyre prøve som tidligere beskrevet [37]. Den region, der indeholder

THRB

promotor blev amplificeret ved anvendelse af primere THRB-HindIII-PromU (CGTAAAGCTTCATATGGGTAACACTGAGGGCATAGC) og THRB-HindIII-PromL (CGTAAAGCTTACTCCTTGGGCGAAGAGAGGC) og Hot Start Perpetual OptiTaq (EURx, Gdansk, Polen), på følgende betingelser: . 95 ° C-10 min, 5 cykler: [96 ° C-35 s, 62 ° C-30 s, 73 ° C-80 s], 40 cykler: [96 ° C-40 s, 59 ° C-30 s, 72 ° C-80 s], sidste forlængelse: 72 ° C, 10 min. Det opnåede PCR-produkt blev klonet i pGEM-T-vektoren (Promega, Madison, WI, USA) og sekventeret. Den opnåede sekvens blev deponeret i GenBank (Acc nr. KF669869).

For at identificere CpG øer, vi ansat

i silico

analyse ved hjælp CpG Plot [38] og CpG Island Searcher [39], CpG-rige region blev fundet i en sekvens der omfatter promotoren og 5’UTR (exon 1) af TR udskrift.

at analysere methylering af

THRB

CpG øer, 800 ng genomisk DNA var graensevaerdi-omregnet ved hjælp Imprint DNA Modification Kit (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA) i henhold til manufecturer anvisninger. At forudsige nukleotid ændringer som følge af bisulfit konvertering,

THRB

sekvens var

i silico

omregnet ved hjælp af slangetæmmer (https://insilico.ehu.es/restriction/two_seq/snake_charmer.html) og anvendes til design af primere.

for at udføre Bisulfite-sekventering PCR (BSP), 100 ng bisulfit-konverterede DNA blev anvendt sammen med Perpetual Taq HOT START (EURx, Gdansk, Polen) polymerase og primere givet i tabel S2, på følgende betingelser: indledende denaturering: 95 ° C, 10 min, 38 cyklusser: [denaturering: 95 ° C-15 s, annealing: 56 ° C eller 57 ° C-15 s, forlængelse: 68 ° C -30 s], sidste forlængelse: 75 ° C, 15 min, sidste inkubation: 4 ° C. Annealingstemperaturen varierede fra 56 ° C til 67 ° C, afhængigt af de anvendte primere (Tabel S2). De opnåede PCR-produkter var direkte sekventeret ved en kommerciel tjeneste (Genomed, Warszawa, Polen).

Methylering-specifik PCR (MSP-PCR) blev udført som tidligere [26] beskrevet. Sekvenserne af primerne er givet i tabel S3.

snapshot analyse blev udført ved anvendelse af snapshot Multiplex Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) og primere i tabel S3 ifølge producentens anvisninger. Produkterne blev analyseret af en kommerciel tjeneste (Biote21, Krakow, Polen).

Specificiteten af ​​primere anvendt til methylering analyse blev analyseret ved hjælp MethPrimer [40].

Analyse af microRNA målretning

THRB

Transcript

microRNA potentielt bindende

THRB

3’UTR blev forudsagt ved hjælp miRecords og DIANA-mirPath [41], [42] (tabel S4). Dernæst blev PubMed søgt at finde oplysninger på ekspressionen af ​​de forudsagte microRNA i ccRCC. Kun microRNA med både rapporteret forøget ekspression i renale tumorer og potentielt rettet mod

THRB

udskrift blev taget til yderligere analyse.

For at analysere effekten af ​​microRNA på indfødte

THRB

udtryk blev UOK171 celler podet på plader med 12 brønde (Corning, NY, USA) under anvendelse af 5 x 10∧4 celler per brønd og transficeret 24 timer senere. Transfektion blanding blev fremstillet som følger: 1) 2 pi Lipofectamine 2000 (Invitrogen /Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) blev blandet med 125 pi Opti-MEM (Gibco /Life Technologies, Carlsbad, CA, USA), og 2) 50 pmol microRNA efterligner eller inhibitorer (Ambion /Life Technologies, Foster City, Californien, USA, tabel S5) blev blandet med 125 pi Opti-MEM. Efter 10 minutters inkubation ved stuetemperatur opløsningerne blev kombineret, inkuberet i yderligere 10 minutter og tilsat til brøndene. Efter 6 timer transfektionsforsøg blandinger blev erstattet med fuld medium. Efter 24 timer blev cellerne høstet til RNA-isolering.

I luciferase reporter assays, HeLa blev valgt på grund af lav endogen ekspression af microRNA (fig S1). Cellerne blev podet på plader med 12 brønde (Corning, NY, USA) under anvendelse af 5 x 10∧4 celler per brønd og transficeret 24 timer senere. Transfektion blanding blev fremstillet som følger: 1) 4 pi PEI 1 pg /pl (polyethylenimin, Polysciences, Warrington, PA, USA) blev blandet med 125 pi Opti-Mem, og 2) 1 ug pGL3-luc-3’UTR-THRB plasmid (Jazdzewski et al., 2011) blev blandet med 125 pi Opti-Mem. For reference plasmid, blev følgende blandinger fremstillet: 1) 2 pi PEI med 62,5 pi Opti-Mem, og 2) 100 ng pRL-TK-plasmidet (Promega, Madison, WI, USA) med 62,5 pi Opti-Mem. Efter 20 minutters inkubation ved stuetemperatur opløsningerne blev kombineret, inkuberet i yderligere 20 minutter og tilsat til dyrkningsbrønde indeholdende 700 pi medium uden FBS. Efter 6 timer blev mediet erstattet med transfektions- blandinger indeholdende microRNA mimics- fremstillet som beskrevet ovenfor. Oplysninger om microRNA efterligner og inhibitorer er givet i tabel S5. Efter 6 timer blev transfektions blander erstattet med fuld medium; celler blev lyseret efter 24 timer og analyseret i Dual Luciferase Reporter Assay (Promega, Madison, WI, USA) ved hjælp af Synergy 2 luminometer (BioTek, Winooski, VT, USA).

Resultater

Den Angivelse af

THRB

og

DNMT1

er ændret i Renal Cancer

Real-time PCR-analyse udført på ccRCC og parret ikke-tumorform kontrolprøver afslørede væsentlige ændringer i

THRB

mRNA-ekspression (figur 1). Udtrykket af

THRB

blev reduceret med 56% (p 0,0001) i tumor sammenlignet med kontrolprøver. Dette fald udtryk blev fundet i 32 ud af 35 (91,4%) analyserede parrede prøver.

A.

THRB

og

DNMT1

mRNA-ekspression i vævsprøver: ikke-tumorform kontroller (C, n = 35) og parrede ccRCC prøver (T, n = 35). Dataene er vist som procent af kontrol (C). Real-time PCR for hver prøve blev udført i triplikater. Statistisk analyse blev udført ved anvendelse af Wilcoxons matchede par test. **** P 0,0001. B. udtryk for

THRB

og

DNMT1

mRNA i cellelinjer: HK2: proksimal tubulær cellelinie afledt fra normal nyre, UOK171: ccRCC cellelinie afledt IV etape tumor, spontant udødeliggjort. Graferne viser resultaterne af fem uafhængige biologiske eksperimenter, målt i tre eksemplarer. Statistisk analyse blev udført under anvendelse af t-test. ** P. 0,01

Real-time PCR-analyse udført på cDNA fra nyre cellelinjer bekræftet nedsat udtryk for

THRB

i nyrekræft.

THRB

ekspression var 63% (p = 0,0036) lavere i ccRCC UOK171 cellelinje sammenlignet med ikke-kræft HK2 celler (figur 1).

Tidligere undersøgelser analysere ekspressionen af ​​DNA methyltransferase 1 (DNMT1) i nyrekræft bragt modstridende resultater [43] – [45]. Derfor besluttede vi at analysere

DNMT1

udtryk i vores undersøgelse. DNMT1 mRNA-niveauer blev forøget i 22 ud af 35 analyserede ccRCC prøver sammenlignet med parrede kontroller (figur 1). Den gennemsnitlige DNMT1 ekspression i tumorvæv blev øget med 38% sammenlignet med parrede kontrol vævsprøver (p = 0,0098). I cellelinjer, blev DNMT1 udtryk steg med 27% i UOK171 sammenlignet med ikke-tumorform HK2 cellelinje (p = 0,0059).

Disse resultater antydede, at øget

DNMT1

niveauer i ccRCC prøver kunne muligvis resultere i forhøjet CpG methylering fører til nedregulering af

THRB

udtryk.

Analyse af

THRB

CpG methylering i Renal Cancer

for at kontrollere, om faldt

THRB

ekspression kan skyldes CpG hypermethylering, UOK171 celler blev dyrket i nærvær eller fravær af DNMT1 inhibitor, 5-aza-dC. Behandling med 5-aza-dC resulterede i en statistisk signifikant (p = 0,0124), 37% stigning af

THRB

udtryk sammenlignet med kontrol, ubehandlede celler (figur 2A).

A. Virkningen af ​​5-aza-2 ‘deoxycytidin (5-aza-dC) på

THRB

mRNA-ekspression i UOK171 cellelinie. Resultaterne er vist som procent af kontrol (cellerne dyrket uden 5-aza-dC tilskud). Plottet viser resultater af tre uafhængige biologiske eksperimenter, målt i triplikater. Statistisk analyse blev udført under anvendelse af t-test. * P 0,05. B. Sekvensen af ​​

THRB

genet med promotor-regionen (GenBank Acc.no. KF669869). CpG ø, der omfatter promotoren og 1

st exon (område -873 til 355) er skygget blå. TATA-boksen fed skrift. CpG-dinukleotider er skygget grå. Små bogstaver angiver en

st exon af TR udskrift. C. repræsentant elektroforetisk analyse af MSP-PCR. U: PCR-produkter fremstillet med primere specifikke for umethylerede sekvens; M: PCR-produkter fremstillet med primere specifikke for methyleret sekvens. C: kontrolprøver, T:. Tumorprøver

For at afgøre, om restaurering af

THRB

udtryk i nyrekræft er direkte reguleret af promotor methylering,

THRB

sekvenser blev analyseret under anvendelse CpG Plot og CpG Island Searcher. Begge programmer forudsagt en CpG-rige region i promotoren og 5’UTR af

THRB

gen, der omfatter nukleotider -873 til 355 (figur 2B). Dernæst blev den forudsagte region analyseret ved anvendelse bisulfit sekventering PCR (BSP). Til dette formål DNA-prøver fra 15 par ccRCC væv og tilsvarende ikke-tumor-kontrol nyreprøver var bisulfit-konverterede og gælder sekventeret. Effektiv bisulfit omdannelse blev bekræftet i PCR-reaktioner med anvendelse af primere designet til at målrette native

THRB

promotor og ikke amplificere bisulfit-konverterede DNA. Kontrol amplifikationsreaktioner udføres på bisulfit omdannede DNA ikke producerede amplifikationsprodukt (kontrol primersekvenser er angivet i tabel S2). Denne analyse viste mangel på forskelle i mønstre for methylering mellem parrede kontrol- og tumorprøver fra den samme patient (Fig S2). For at verificere resultaterne af BSP, det bisulfit konverterede DNA var desuden analyseret med Snapshot og MSP-PCR, en meget følsom metode giver mulighed for påvisning af 0,1% denatureret alleler af en given CpG ø locus [46] (Figur 2C). Disse analyser bekræftede, at der var ingen ændringer i CpG mønstre for methylering i ccRCC prøver sammenlignet med parrede kontrolprøver. Interessant, MSP-PCR resultater antydede, at mønstre for methylering varierede mellem forskellige patienter, bliver snarere patientspecifikke end påvirket af sygdomsstatus.

Som konklusion viser disse resultater antydede, at selv om ændringerne i DNMT1 aktivitet kan bidrage til ændringer af

THRB

udtryk i cellekulturer, den forstyrrede udtryk for

THRB

i ccRCC vævsprøver er hellere ikke et resultat af afvigende, tumor-specifikke hypermethylering af genets promotor.

microRNA miR-155 og miR-425 Direkte Target

THRB

3’UTR

For at forudsige microRNA potentielt påvirke

THRB

udtryk i nyrekræft, blev udført to-trins analyse. For det første, bioinformatik analyse ved hjælp miRecords (en ressource, der kombinerer 11 bioinformatiske programmer) og Diana-mirPath forudsagde næsten 600 microRNA’er potentielt målretning

THRB

3’UTR. Men baseret på den antagelse, at lukke munden på effektivitet er den højeste for microRNA, der ligger inden for den nærmeste nærhed til hver ende af 3’UTR [47] vi specifikt fokuseret på microRNA, der overholdt denne regel. søgning Efterfølgende i PubMed tilladt for udvælgelse af microRNA, der blev rapporteret som overudtrykt i nyrekræft [18] – [21]. Brug af to-trins tilgang, fire microRNA (MIR-155, mir-425, MIR-592, og MIR-599) blev udvalgt til yderligere analyse.

For at finde, om de valgte microRNA faktisk binde 3’UTR af

THRB

, HeLa-celler blev transficeret ved hjælp af syntetiske microRNA’er og en reporter konstruere pGL3-luc-3’UTR-

THRB Hotel (figur 3). HeLa-celler blev valgt til denne analyse på grund af lav endogen udtryk for

THRB

og analyserede microRNA’er. Transfektion af celler med præ-MIR-155 eller præ-MIR-425 resulterede i 32% eller 17% reduktion af luciferaseaktivitet, når det blev sammenlignet med kontrol-miRNA efterligner (p 0,001). Der blev ikke observeret ændringer i luciferaseaktivitet i celler transficeret med præ-miR-592 eller pre-miR-599. Pre-MIR-221, der tidligere er rapporteret til at målrette

THRB

3’UTR [25] blev anvendt som positiv kontrol og bekræftet effektiviteten af ​​miRNA-medieret silencing (figur 3).

A. Virkningen af ​​microRNA efterligner på aktiviteten af ​​luciferase udtrykt fra et reporterplasmid pGL3-luc-3’UTR-THRB. HeLa-celler blev transficeret under anvendelse af reporterplasmid og respektive microRNA efterligner: pre-MIR-155, præ-MIR-425, præ-MIR-599, eller præ-MIR-221. Resultaterne er vist i procent af kontrol (Ctrl, celler transficeret med ikke-målretning præ-MIR). Plottet viser resultater af tre uafhængige biologiske eksperimenter, målt i triplikater. Den relative aktivitet af Firefly luciferase blev normaliseret til Renilla luciferaseaktivitet. Statistisk analyse blev udført under anvendelse af ANOVA efterfulgt af Dunnetts multiple sammenligningstest. *** P 0,001. B. Effekten af ​​miR-155 og miR-425 på endogene

THRB

udtryk i renale cancerceller. UOK171 celler blev transficeret anvendelse af respektive microRNA efterligner (pre-Mirs) eller inhibitorer (anti-Mirs), og

THRB

mRNA-ekspression blev analyseret under anvendelse real-time PCR. Resultaterne er vist som procent af kontrol (celler transficeret med ikke-målretning præ-MIR). Graferne viser resultater af tre uafhængige biologiske eksperimenter målt i tre eksemplarer. Statistisk analyse blev udført under anvendelse af ANOVA efterfulgt af Dunnetts multiple sammenligningstest. * P 0,05, *** p 0,001. C. Ekspressionen af ​​MIR-155 og MIR-425 i nontumorous kontroller (C, n = 35) og parret ccRCC vævsprøver (T, n = 35). Resultaterne er vist som procent af kontrol. Real-time PCR for hver prøve blev udført i triplikater. Statistisk analyse blev udført ved anvendelse af Wilcoxons matchede par test. * P 0,05, ** p 0,01

miR-155 og miR-452 Indflydelse

THRB

Expression i nyrekræft Celler

For at efterfølgende analysere. effekt af miR-155 og miR-425 på endogene

THRB

udtryk, nyrekræft-afledt UOK171 cellelinje blev transficeret ved hjælp af enten microRNA efterligner (pre-miR-155 eller pre-mir-425) eller microRNA-hæmmere ( anti-mIR-155 eller anti-mIR-425) (figur 3). Transfektion resulterede i en statistisk signifikant fald i

THRB

udtryk med 22% for pre-miR-155, p 0,05, og med 64% for pre-miR-425, s 0,001, sammenlignet med kontrol microRNA (figur 3). Transfektion af cellelinier med microRNA inhibitorer resulterede ikke i en statistisk signifikant ændring af

THRB

ekspression, selvom en tendens til øget ekspression blev set (figur 3). Denne observation kan skyldes det faktum, at niveauerne af MIR-155 og MIR-425 er højt ophøjet i UOK171 cellelinje, således trods af talrige koncentrationer testes, kan mængden af ​​microRNA inhibitorer være utilstrækkelig til effektiv blokering af microRNA aktivitet.

Disse undersøgelser antydet, at miR-155 og miR-425 direkte indflydelse

THRB

udtryk i renale cancerceller.

Den Angivelse af miR-155 og miR-425 er forhøjet i nyrekræft og korrelerer med Nedsat Angivelse af

THRB

for at kontrollere, om tumor-specifikke ændringer af miR-155 og miR-425 kunne påvirke

THRB

udtryk i ccRCC tumorer, ekspressionen af ​​begge microRNAer blev analyseret i 25 ccRCC vævsprøver og 25 tilsvarende ikke-tumor-nyreprøver (figur 3). Ekspressionen af ​​begge microRNAer var statistisk signifikant forøget (354%, p = 0,0072 for MIR-155 og med 62%, p = 0,041 for MIR-425). Samtidig ekspression af begge Mirs var negativt korreleret med udtryk for

THRB

. Selv korrelationskoefficienten var svag (R = 0,245, p = 0,0075) i kontrolprøver, korrelationen var signifikant stærkere i tumorer (R = 0,469, p = 0,0225). Samtidigt var der også en signifikant sammenhæng mellem T /N-forhold på miRNA og

THRB

udtryk (R = 0,396, p = 0,002). Disse resultater viser, at

THRB

ekspressionsniveauerne afhænger af miR-155 og miR-425 udtryk og deregulering af Mirs er forbundet med sænket

THRB

niveauer i ccRCC (figur S3).

diskussion

i denne undersøgelse ved hjælp af tre forskellige metoder, viste vi, at i de analyserede prøver af nyrekræft afvigende

THRB

udtryk skyldes ikke tumor-specifikke ændringer i DNA-methylering af

THRB

promoter region. Snarere udtryk for

THRB

i ccRCC påvirkes af microRNA, miR-155 og MIR-425, der direkte binder til

THRB

3’UTR, som foreslået af den observation, at forhøjede udtryk for disse microRNA i ccRCC ledsages af nedregulering af

THRB

.

Hypermethylering af

THRB

promotor blev rapporteret i flere neoplasmer, herunder bryst, skjoldbruskkirtel og lungekræft og leukæmi [25 ] – [30]. Interessant, viste undersøgelserne, at methylering satser

THRB

var meget variabel blandt patienter, da hypermethyleret

THRB

blev påvist i 25-80% af analyserede tumorer. Endvidere blev kun halvdelen af ​​de undersøgelser af

THRB

methylering udført på både tumor og parret ikke-tumorform kontrol væv. Iwasaki et al. undersøgt 116 ikke-småcellet lungekræft, herunder 6 prøver, for hvilke parret tilstødende kontrol væv blev analyseret. Ud af de 116 tumorprøver, 54 afslørede hypermethylering af

THRB

. Når 6 parret tumor versus kontrolprøver blev sammenlignet,

THRB

blev methyleret i alle tumorer og umethyleret i alle ikke-tumorform kontrolprøver. I to andre undersøgelser analyserer brystkræft tumorer og cellelinjer [25], [29] hypermethyleret

THRB

blev påvist i 80% -100% af tumorer og C.A. 37% af parrede prøver. Desuden er graden af ​​og mønsteret for methylering varierede mellem prøverne afledt fra forskellige patienter. Lignende interindividuel variation blev også observeret i et studie udført på skjoldbruskkirtlen tumorer [30], hvor parrede normale vævsprøver ikke var til rådighed, og derfor ikke er analyseret. Vores undersøgelse viste også, at

THRB

methylering betydeligt varierede mellem vævsprøver stammer fra forskellige patienter. Disse resultater tyder på, at mangel på parrede ikke-tumorform kontrolprøver kan føre til en bias og resultere i klassificering af en patient-specifikke variationer i

THRB

methylering som specifikke for kræft væv ændringer.

Selvom

THRB

udtryk synes ikke at være påvirket af DNA methylering i vores nyrekræft prøver, behandling af UOK171 cellelinje med 5-aza-2 ‘deoxycytidin resulterede i øget ekspression af

THRB

gen. Dette antyder, at

THRB

udtryk kan indirekte påvirket af DNMT1 aktivitet. Ifølge tidligere undersøgelser, kan DNA-methylering indirekte påvirker transkription af et målgen i flere mekanismer [48], herunder genregulering af en reaktiveret transskriptionsfaktor eller signaltransduktionsvej som påvirkes af DNA-methylering. Hvilke af disse mekanismer kan påvirke

THRB

udtryk i nyrekræft er i øjeblikket ukendt. Desuden kan vi ikke udelukke, at i andre ccRCC patienter og i de øvrige ccRCC-afledte cellelinjer,

THRB

promotor methylering kan påvirke

THRB

udtryk. Dette forhåbentlig vil blive kontrolleret af fremtidige undersøgelser om ccRCC.

En anden epigenetiske mekanisme, der påvirker ekspressionen af ​​målgener er microRNA-afhængig regulering af udtryk [49]. Et enkelt gen kan målrettes af flere microRNA og enkeltværelser microRNA kan regulere talrige målgener. Følgelig deregulering af miRNA udtryk, der er forbundet med talrige cancere fører til en alvorlig forstyrrelse af den cellulære proteom og transkriptom. I denne undersøgelse identificerede vi to microRNA hvis direkte binding med

THRB

3’UTR blev bekræftet i luciferaseanalyse udført i HeLa-cellelinje, der anvendes på grund af relativt lave ekspressionsniveauer af begge analyserede miRNA.