PLoS ONE: Cirkulerende MikroRNA’er som ikke-invasive Biomarkører for tidlig påvisning af ikke-småcellet lungekræft

Abstrakt

Baggrund

Påvisning af lungekræft på et tidligt stadium af følsomme screeningstest kunne være en vigtig strategi til at forbedre prognosen. Vores mål var at identificere et panel af cirkulerende microRNA i plasma, der vil bidrage til tidlig påvisning af lungekræft.

Materiale og metoder

Plasma prøver fra 100 tidligt tidspunkt (I til IIIA) ikke- småcellet lungecancer (NSCLC) patienter og 100 ikke-kræft kontroller blev screenet for 754 cirkulerende microRNA via QRT-PCR, ved hjælp af TaqMan MicroRNA Arrays. Logistisk regression med en lasso straffespark blev anvendt til at vælge et panel af microRNA, der diskriminerer mellem cases og kontroller. Intern validering af diskrimination model blev foretaget ved at beregne bootstrap optimisme-korrigeret AUC for den valgte model.

Resultater

Vi identificerede et panel af 24 microRNA med optimal ydeevne klassificering. Kombinationen af ​​disse 24 microRNA’er alene kunne skelne lungekræfttilfælde fra kontroller ikke-kræft med et AUC på 0,92 (95% CI: 0,87-0,95). Denne klassificering forbedret til en AUC på 0,94 (95% CI: 0,90-0,97) efter tilsætning af køn, alder og rygning status til modellen. Intern validering af modellen tyder på, at den diskriminerende effekt af panelet vil være høj, når den anvendes til uafhængige prøver med et korrigeret AUC på 0,78 for 24-miRNA-panelet alene.

Konklusion

Vores 24 -microRNA prædiktor forbedrer lungekræft forudsigelse ud over det kendte risikofaktorer

Citation:. Wozniak MB, Scelo G, Muller DC, Mukeria A, Zaridze D, Brennan P (2015) cirkulerende MikroRNA’er som Non-Invasive Biomarkører for tidlig påvisning af ikke-småcellet lungekræft. PLoS ONE 10 (5): e0125026. doi: 10,1371 /journal.pone.0125026

Academic Redaktør: Jörg D. Hoheisel, Deutsches Krebsforschungszentrum, TYSKLAND

Modtaget: 16 oktober, 2014 Accepteret: 19 Marts 2015; Udgivet: 12. maj 2015

Copyright: © 2015 Wozniak et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: The TaqMan menneskelige MicroRNA Array eksperimenter er MIAME kompatibel og er blevet deponeret på NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) database (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) under tiltrædelsen GSE64591

Finansiering:. det forfattere modtog ingen specifik finansiering til dette arbejde

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er den hyppigste årsag til kræft dødsfald på verdensplan. I 2012 blev der 1,82 millioner nye tilfælde, og 1.59 millioner dødsfald på grund af lungekræft optaget, udgjorde 13% af alle kræfttilfælde og 19% af alle kræftdødsfald henholdsvis [1]. Ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) tegner sig for ca. 80-85% af alle tilfælde lungekræft og omfatter primært to histologiske typer: adenocarcinom (AC) og pladecellekræft (SCC). På trods af fremskridt i terapi, en samlet 5-års overlevelse på kun 16% [2] er mest på grund af sent på diagnosetidspunktet. Påvisning af lungekræft på et tidligt stadium af følsomme screeningstest kunne være en vigtig strategi til forbedring af lungekræft prognose.

The National Lung Screening Trial (NLST) ved hjælp af lav-dosis spiralformet computertomografi (LDCT) i høj- risiko individer viser, at der kan opnås en reduktion på 20% i lungekræft dødelighed og en reduktion i dødelighed [3] 6,7%. Ikke desto mindre er høje falsk-positive satser NLST [4], omkostninger og potentielle skader fra stråling understreger behovet for enklere, non-invasive og mere tilgængelige metoder til effektiv afsløring tidlig kræft som komplementære biomarkører.

MikroRNA’er (miRNA) er en gruppe af små (~ 22-nucleotider lange) ikke-kodende, enkeltstrengede RNA’er, der regulerer genekspression post-transkriptionelt. Afvigelser i miRNA ekspressionsniveauerne er blevet fundet i forbindelse med onkogenese og tumormetastaser [5], herunder NSCLC. Mere end 2500 humane miRNA sekvenser betegnes for øjeblikket [6]. Flere undersøgelser har vist, at serum og plasma miRNA (kaldet cirkulerende miRNA) til stede meget lovende som nye ikke-invasive biomarkører til tidlig diagnose af forskellige kræftformer på grund af deres lette adgang og langtidsstabilitet [7,8]. I lungekræft har flere miRNA udtryk profiler blevet identificeret med bemærkelsesværdigt høje prædiktive værdier, herunder en 34-miRNA diagnostiske signatur med et AUC på 0,89 [9], en 10-miRNA-panel med en AUC på 0,97 i serum samt 16-miRNA nøgletal som en underskrift af risiko (AUC: 0,85) og diagnose (AUC: 0,88) [10,11] i plasmaprøver fra NSCLC patienter

Tidligere undersøgelser har vist betydelige uoverensstemmelser selv om disse var baseret på begrænsede stikprøvestørrelser. eller anvendes kandidat miRNA tilgange. Derudover et niveau af kontrovers eksisterer i, at miRNA identificeret i blodet blot angive ændringer i blodlegemer sekundært til en generelt dårlige sundhedstilstand og er ikke specifikke for tilstedeværelsen af ​​kræft i et målorgan. Selvom måling af miRNA-ekspression i plasma eller serum er blevet postuleret som en lovende tilgang i at diagnosticere lungekræft, konceptet kræver yderligere undersøgelser at vise sin potentielle anvendelse som en klinisk anvendelse. Der er ingen stærke beviser, om serum eller plasma er overlegen for miRNA evaluering imidlertid nylige rapporter antyder, at plasma kan den foretrukne prøve valg givet at RNA frigives under koagulationsprocessen kan ændre sammensætningen af ​​cirkulerende miRNA i serumprøver [12 ].

Her præsenterer vi et genom-dækkende miRNA udtryk skærm i plasmaprøver fra 100 NSCLC tilfælde og 100 kontroller, hvor vi bestemt et miRNA signatur med en høj diagnostisk værdi, der blev identificeret gennem strenge statistiske metoder.

Resultater

studiepopulation

De karakteristiske træk ved 200 undersøgelsens deltagere, herunder 65 patienter med lunge SCC, 35 patienter med lunge AC og 100 kontroller er vist i tabel 1. Der var en forskel i køn (flere mænd blandt de sager), alder ved interview (sager var i gennemsnit 1,5 år ældre end kontroller), rygning status (15% flere rygere blandt tilfælde) og alkoholindtagelse status (sager inkluderet 12% mere tidligere alkohol forbrugere). Lungekræftpatienter var af en tidlig IA-IIIA scenen. Den gennemsnitlige follow-up tid var 2,48 år. I løbet af denne opfølgningsperiode, 64 af de 100 sager, døde og 36 stadig var i live ved at censurere.

Micro-RNA profiler i plasma

For at vurdere, om bestemte miRNA signaturer kan påvises i plasmaprøver fra patienter med tidlige stadier af NSCLC, vi udførte en high-throughput skærm af 754 miRNA bruger TaqMan Menneskelige microRNA array. I gennemsnit blev der påvist 235 og 115 miRNA på kort A og Card B henholdsvis (til stede i mindst 80 ud af 200 prøver i enten tilfælde eller kontroller) (figur 1). De miRNA udtryk profiler i plasma var fraktil normaliseret og af forskellig udtryk analyser mellem NSCLC prøver og kontroller. Af 350 fundne miRNA i plasma blev fundet 61 miRNA at være signifikant forskelligt udtrykt mellem lungekræfttilfælde og kontroller (35 på Card A, 26 på Card B), herunder 33 opreguleres og 28 nedreguleret miRNA (p-værdi 0,05). Disse omfattede 21 miRNA differentielt udtrykt med betydelig justerede p-værdi korrigeret for multiple test (Tabel 2). På trods af den betydelige forskellen udtryk, overvåget hierarkisk klyngedannelse analyse viste, at dette sæt af 61 miRNA ikke var i stand til klart at skelne mellem lungekræft tilfælde og kontroller (S1 Fig).

Prediction modeller

for at vælge et panel af miRNA diskriminerer mellem cases og kontroller, blev en logistisk regressionsmodel med lasso straf monteret. Denne analyse identificerede et panel af 24 plasma miRNA med en optimal ydelse klassificering (S2 og S3 Fig). Tabel 3 viser den komplette liste over udvalgte miRNA i panelet. Multipel logistisk regressionsanalyse viste, at kombinationen af ​​de 24 miRNA alene kunne skelne lungekræfttilfælde fra kontroller med meget høj AUC på 0,92 (95% CI: 0,87 til 0,95). I den logistiske model herunder 24-miRNA panel og korrigeret for de vigtigste lungekræft risikofaktorer, nemlig køn, alder ved interview og rygning status, klassificeringen forbedret til en AUC på 0,94 (95% CI: 0,90-0,97) (figur 2) . Forbedringen i omfanget af diskrimination tilskrives den 24-miRNA panelet er væsentlig sammenlignet med de vigtigste lungekræft risikofaktorer alene. AUC for den fulde logistiske modeller med og uden 24-miRNA-panel var 0,94 (95% CI: 0,90-0,97) og 0,72 (95% CI: 0,65 til 0,78), henholdsvis (figur 3). Den prædiktive værdi var af samme størrelsesorden (AUC: 0,95; 95% CI: 0,91-0,98) ved udskiftning af kategoriske rygning status variabel ved den kontinuerlige pack-års variabel. Især, selv om der er afledt fra begge histologiske typer, den 24-miRNA panel udført lige godt i både ACs (AUC: 0,94) og SCC (AUC: 0,96). Tilsvarende prædiktor udført godt for kræft i alle faser (IA-IIIA), med en AUC på 0,96 for trin I (IA og IB; n = 49) patienter, 0,98 for fase II (trin IIA og IIB, n = 21) patienter og 0,97 for fase IIIA (n = 30) patienter (data ikke vist). Vejviser

Intern validering af den valgte 24-miRNA panel model (dvs. validering tegner sig for variabilitet grundet parameterestimering) ved hjælp af bootstrap optimisme korrigeret AUC foreslår, at diskriminerende kraft af panelet vil være høj, når den anvendes til uafhængige prøver (korrigerede AUC på 0,86 for 24-miRNA panel alene, 0,87 for modellen herunder køn, alder og rygning status og 0,89 for modellen med pakke-års variabel). Den bootstrap optimisme korrigeret AUC, som tog hensyn til hele miRNA klassificeringen udvælgelsesprocessen (straffet Lasso logistisk regression) var 0,78.

Diskussion

Trods omfattende fremskridt i billedbehandling og kombinerede behandlingsmodaliteter, 5- års overlevelse for lungekræft er forbedret kun marginalt i de seneste årtier [2]. En ikke-invasiv, biomarkør-drevet lagdeling af tidlige fase lungekræft kunne derfor supplere LDCT screening og forbedre behandlingen ledelse. Vi har udviklet et panel på 24 plasma miRNA i stand til at diskriminere tidlige fase NSCLC sager fra kontroller med en høj AUC på 0,92 efter screening 754 miRNA i 100 NSCLC patienter og 100 ikke-kræft individer. Dette sæt af miRNA blev identificeret gennem meget strenge statistiske metoder. Så vidt vi ved dette er også en af ​​de største forundersøgelser af miRNA i plasma. Tests som disse demonstrere flere fordele ved klinisk brug, herunder ingen krav om invasiv prøvetagning ( “flydende biopsi”), lave omkostninger sammenlignet med billeddannelsesteknikker, ukomplicerede laboratorieprocedurer, og medtagelse af et panel af biomarkører stedet for et enkelt miRNA.

til dato har flere undersøgelser rapporteret miRNA profiler i plasma og serum udviklet til diagnosticering af NSCLCs [9-11,13-16]. Trods meget lovende resultater disse undersøgelser har vist en forholdsvis lille overlap mellem identificerede miRNA underskrifter, og var baseret på begrænsede stikprøvestørrelser /puljer af prøver, som ikke giver mulighed for vurdering af bidrag fra en enkelt patient til den genetiske pulje, eller anvendes en kandidat miRNA tilgang til opdagelsen af ​​miRNA-panelet. Variationen i præ-analytiske faktorer, såsom procedurer for prøveforberedelse, og forskellige normalisering strategier gør sammenligning mellem undersøgelser vanskelig. Også forskellene i miRNA-profiler mellem serum og plasma [14] kan forklare nogle af de manglende korrelation af miRNA udtryk niveauer mellem tidligere undersøgelser. Endelig kunne de beskrevne underskrifter afvige på grund af den iboende mangfoldighed af miRNA mål og deres potentielle redundans. I betragtning af, at vores undersøgelse evaluerede det højeste antal miRNA profiler, var vi i stand til at vurdere den prædiktive værdi af tidligere konstaterede miRNA underskrifter i vores data. Interessant, trods lille overlap af miRNA mellem prædiktorer, forskellige population af patienter, prøve behandling, ekstraktionsprotokoller og normalisering procedurer, der anvendes i forhold til tidligere undersøgelser [9,10,13], en relativt høj prædiktiv værdi (AUC: fra 0,68 til 0,78) af disse miRNA paneler blev observeret i vores undersøgelse (S1-S4 Borde, S4 Fig), hvilket understreger potentialet af cirkulerende miRNA som biomarkører for påvisning lungekræft. I vores data, blev den bedste forskelsbehandling mellem NSCLC sager og kontroller fundet for 34-miRNA signatur rapporteret af Bianchi og kolleger [9] viser en AUC på 0,78 (95% CI: 0,72 til 0,84). Lavere prædiktiv værdi blev observeret ved brug af underskrift risiko (udviklet i præ-diagnostiske prøver) og diagnosticering (udviklet i case-kontrol-studie) beskrevet af Boeri og kolleger [10], og nylig valideret af den samme gruppe [11] viser en AUC på 0,71 (95% CI: 0,65-0,78) og AUC på 0,70 (95% CI: 0,63-0,76), hhv. Endelig den 10-miRNA panel defineret af Chen og kolleger gav en AUC på 0,68 (95% CI: 0,61-0,74). Når de er monteret ved hjælp af vores data [13]

Tidligere rapporter rejst det spørgsmål, om miRNA fundet i omløb stammer fra tumorer. I teorien kan miRNA i plasma eller serum kommer fra tumoren eller fra inflammatoriske værtsresponser. I mangel af miRNA data fra tumorvæv i vores sæt prøver sammenlignet vi et panel af 24 miRNA i vores forudsigelse til differentielt udtrykt miRNA fra AC og SCC af lungen opnået via analyse af Cancer Genome Atlas (TCGA) miRNA sekventering data ( https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/). Tolv af miRNA inkluderet i vores prædiktor blev også ændret i TCGA data i enten histologi. Men retningen af ​​foreningen var konsistent kun for lad-7c og miR-218. Dette antyder, at en prædiktiv rolle plasma miRNA er uafhængig af væv i overensstemmelse med tidligere fund af Boeri og kolleger [10].

Nylige undersøgelser har også foreslået, at betydelige variationer i overflod af microRNA biomarkører rapporteret i litteraturen måske være et resultat af optagelsen af ​​hæmolyseres prøver [17-19]. For at minimere effekten af ​​hæmolyse, de anvendte prøver i vores undersøgelse fulgte standardiserede protokoller og blev behandlet inden for 2 timer fra tidspunktet for blodprøvetagning. Desuden blev et QC trin gennemføres for at vurdere potentialet hæmolyse ved evaluering af ekspressionsniveauer af 10 tidligere rapporterede hæmolyse-relateret miRNA, herunder MIR-451, miRNA MIR-16, MIR-15b, MIR-486-3p, MIR-532- 3p, miR-886-5p, miR-636, miR-1255B, RNU48 og miR-92a [17,19] blandt alle miRNA detekteret i vores undersøgelse. Vi har ikke observere væsentlige forskelle i hæmolyse-relaterede miRNA mellem lungekræft tilfælde og kontrol i vores serie med undtagelse af miR-15b (p-værdi = 0,024) (S5 tabel). Men ændringer af MIR-15b er tidligere blevet rapporteret i tumorvæv [20,21] og MIR-15b er blevet foreslået som et serum biomarkør for detektion af NSCLC [22]. Desuden er ingen af ​​de hæmolyse-relaterede miRNA var til stede i vores 24-miRNA prædiktor

Vores undersøgelse har flere bemærkelsesværdige styrker, herunder:. Omhyggelig udvælgelse af patienter med alle tilgængelige kliniske data, standardiserede og ensartet behandling af blodprøver inden for 2 timer fra blodprøvetagning, ultracentrifugeringstrin efter defreezing at fjerne cryoprecipitates og cellerester, stor stikprøvestørrelse, stort antal miRNA analyseret og meget stringent statistisk vurdering af miRNA prædiktor. Kendte prædiktorer for lungekræft blev tvunget til modeller i studiet uanset statistisk signifikans lige teste tilsat inkremental af vores 24-miRNA panel (figur 3).

En begrænsning er, at på grund af hvert enkelt kontrol design af vores undersøgelse blev blodprøver opsamlet på tidspunktet for diagnosen. For delvist imødegå denne begrænsning gjorde vi begrænse vores analyse til tidlig fase NSCLC. Også vores undersøgelse mangler en ekstern validering serie. For at løse dette problem, vi udførte interne validering ved hjælp af en bootstrapping metode, som indikerede, at den prædiktive værdi af panelet vil forblive høj, når den anvendes til en uafhængig serie af prøver.

Den lille størrelse af modne miRNA og deres sekvens homologi til forløber miRNA kræver følsomme metoder til kvantitativ analyse. Vi brugte den nuværende metode “gold standard” for måling af cirkulerende miRNA. TaqMan miRNA Cards bruge en target-specifik, stængel-loop revers transkription primer til at løse den udfordring, den korte længde [23]. Trods den høje nøjagtighed og specificitet af QRT-PCR-teknik, kan hver miRNA udtryk niveau målt være påvirket af både systematiske eksperimentelle skævhed og tekniske variationer, herunder forskelle i prøve indkøb, stabilisering, RNA ekstraktion, og prøve forskelle. Som et resultat, data normalisering er kritisk for at minimere “støj” og opnå biologisk meningsfulde data og udvikle miRNA-baserede biomarkører. I mangel af stabilt udtrykte endogene cirkulerende miRNA til at fungere som normalisering kontrol, og at kontrollere følsomheden af ​​vores resultater flere normalisering strategier blev afprøvet i vores undersøgelse, herunder fraktil normalisering, rang normalisering, geometriske betyder normalisering, normalisering endogen U6snRNA kontrol og til ATH-mIR-159a spike-i exogen kontrol. Baseret på sonderende dataanalyse plots, ustabilitet af endogen kontrol, forskel i overflod af spike-in vs prøve miRNA, besluttede vi at fraktil normalisering blev valgt til analysen. Desuden at reducere confounding fra teknisk variation såsom plade-til-plade variation og variation som følge af oprensning, vi distribuerede prøver således, at diagnostiske variabler var afbalanceret med hensyn til dagen for analyse eller plade nummer og randomiseret inden for hver dag og plade.

sammenfattende vores undersøgelse viser, at 24-miRNA-panelet er betydeligt og uafhængigt forbundet med lungekræft følgende analyse af en flydende biopsi og føjer til lungekræft forudsigelse ud over det bidrog med etablerede risikofaktorer. Vores undersøgelse skal derfor ses som en eksplorativ undersøgelse giver en stærk og yderst prædiktive miRNA panel identificeret gennem strenge statistiske metoder til yderligere validering i veldesignede store prospektive kohorter og screening forsøg. Hvis de nuværende resultater er valideret, forventes det at gøre vigtige bidrag til klinisk og folkesundheden praksis og kan føre til en mere effektiv screening lungekræft ved at forbedre kriterier indskrivning til at identificere dem, der vil have gavn af yderligere screening.

Patienter og Metoder

studiepopulation

lungekræftpatienter og kontroller blev rekrutteret gennem en IARC case-kontrol undersøgelse koordineret i Moskva fra 2006 til 2012. sager blev hændelse kræftpatienter indsamlet fra den russiske NNBlokhin Cancer Research Centre og Moscow City Clinical Oncology Dispensary betjener Moskva og de omkringliggende regioner. Kontroller blev rekrutteret fra enkeltpersoner besøger to Moskva hospitaler for lidelser relateret til lungekræft og til associerede risikofaktorer. Alle undersøgelsens deltagere forudsat skriftligt informeret samtykke og blev interviewet.

Perifert blod blev opsamlet i EDTA-rør på tidspunktet for interviewet og behandles så hurtigt som muligt (normalt inden for 2 timer). For tilfælde blev blodprøve udført før operation og eventuel adjuverende behandling. Plasmaprøver blev isoleret ved centrifugering af fuldblod ved 2000 x g i 10 minutter ved stuetemperatur. Prøver blev opbevaret ved -80 ° C. Alle prøver blev opnået i overensstemmelse med Helsinki-deklarationen retningslinjer og blev godkendt af den lokale Institutional Review Board og IARC etiske komité. I alt 100 lungekræfttilfælde og 100 kontroller blev inkluderet (tabel 1).

RNA isolering

Efter optøning blev plasmaprøver centrifugeres ved 16.000 xg i 5 minutter for at fjerne cryoprecipitates og cellerester . Totalt RNA blev isoleret fra 300 pi af plasma under anvendelse NucleoSpin miRNA Plasma kit (Macherey-Nagel, Duren, Tyskland) ifølge producentens protokol med proteinase K-fordøjelse, tilsætning af 2 ug glycogen bærer og DNAse fordøje trin. Alle prøver blev tilsat-in med 10 pmol

Arabidopsis thaliana

syntetisk miR-159a (syntetiseret af Eurofins MWG Operon, Ebersberg, Tyskland) til at styre for variationer i RNA forberedelse trin. Renset RNA blev holdt ved -80 ° C inden den anvendes til revers transkription.

Profilering af TaqMan Menneskelig microRNA array

Expression niveauer af 754 miRNA (Sanger miRBase V14) blev kvantificeret ved hjælp af TaqMan menneskelige MicroRNA Array A + B kort sæt v3.0 (Applied Biosystems, Foster City, CA) ifølge producentens instruktioner (herunder præ-amplifikation) (S1 fremgangsmåder). Kvantitative miRNA udtryk data blev erhvervet af ABI 7900HT SDS software v2.4. tærskelcyklus (Ct, cyklus, hvor der er den første påviselige betydelig stigning i fluorescens) værdier blev indstillet under anvendelse ExpressionSuite software (Applied Biosystems) på de første 60 prøver (automatisk baseline og tærskel), og disse tærskler for Ct blev anvendt til de andre serier . De TaqMan Menneskelig miRNA Array eksperimenter er MIAME kompatibel og er blevet deponeret på NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) database (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) under tiltrædelsen GSE64591.

Statistisk analyse

Beskrivende sammenligninger af undersøgelsens variabler mellem cases og kontroller brugt Chi-squared test for kategoriske data, og t-test for løbende data. Data blev analyseret i HTqPCR pakke [24] ved hjælp af R BioConductor [25]. miRNA med ubestemte Ct-værdier i mere end 120 prøver blev filtreret fra. Data blev fraktil normaliseret. Efter normaliserings- Ct-værdier med et interkvartile område (IQR) på mindre end 1,5 og endogene kontroller blev fjernet fra efterfølgende analyse, og limma analyse blev udført for at identificere differentielt reguleret miRNA mellem tilfælde og kontroller. Med limma, er en én-faktorielt lineære model monteret for hver miRNA og standard fejl (SE) er modereret ved hjælp af en empirisk Bayes modellen resulterer i modereret

t

-Statistik for hver miRNA [26]. P-værdier på mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Vi rapporterer også justerede p-værdier korrigeret for multipel testning ved hjælp af Benjamini-Holm metode til at kontrollere for falske positive fejlprocent. Logistisk regression med en lasso straf (med straf parameter tuning udført af 20 gange krydsvalidering) blev anvendt til at vælge et panel af miRNA til at skelne mellem tilfælde og kontroller. Logistik regressionsmodeller blev brugt til at vurdere, om den 24-miRNA-panel var forbundet med lungekræft efter justering for kendte risikofaktorer for lungekræft (alder, køn og rygning status). Arealet under Receiver Operating karakteristiske kurve (AUC) blev beregnet for at vurdere diskriminerende kraft af modellen. Intern validering af den valgte model blev foretaget ved at beregne bootstrap optimisme-korrigeret AUC. Denne korrektion udgør overfitting af modellens parametre for den valgte model. Desuden blev en optimisme-korrekt AUC beregnet på baggrund af bootstrapping hele markeringen model processen. Dette er baggrunden for overfitting i både model udvælgelse og parameter estimering. Alle analyser blev udført ved hjælp af STATA V11 (STATA, College Station, TX) og R [25]. Alle præsenterede p-værdier er tosidet.

Støtte Information

S1 Fig. Hierarkisk klassifikation af 61 markante differentielt udtrykte mikroRNA (p-værdi 0,05) hos patienter med lungecancer i forhold til kontroller

NSCLC tilfælde er fremhævet med rødt

doi: 10,1371 /journal.pone.0125026.s001

(TIF)

S2 fig. Optimal lambda værdi og tværs valideret fejl plot for Lasso logistisk regressionsanalyse

doi:. 10,1371 /journal.pone.0125026.s002

(TIF)

S3 Fig. Box plots af de 24 plasma miRNA indgår i panelet i patienter og kontroller lungekræft i IARC case-kontrol undersøgelse (2006-2012).

Medianen score er den linje i midten af ​​boksen og de 25

th og 75

percentil er den nederste og øverste del af boksen. De whiskers udvides til de mest ekstreme punkt ikke længere end 1,5 gange den interkvartile område væk fra kassen. Outliers er givet som prikker

doi:. 10,1371 /journal.pone.0125026.s003

(TIF)

S4 Fig. Vurdering af den prædiktive værdi af tidligere beskrevne multi-miRNA underskrifter for en tidlig påvisning af NSCLC patienter i IARC case-kontrol undersøgelse datasæt (2006-2012)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0125026.s004

(TIF)

S1 Metoder. Supplerende metoder

doi:. 10,1371 /journal.pone.0125026.s005

(DOCX)

S1 Table. Logistisk regression forudsigelse model med microRNA panel rapporteret af Bianchi F

et al Hotel (2011) [9], vurderes i IARC case-control undersøgelse (2006-2012)

doi:. 10,1371 /journal.pone .0125026.s006 Hotel (DOCX)

S2 Table. Logistisk regression forudsigelse model med microRNA panel rapporteret af Chen X

et al Hotel (2012) [13] vurderes i IARC case-control undersøgelse (2006-2012)

doi:. 10,1371 /journal.pone .0125026.s007 Hotel (DOCX)

S3 Table. Logistisk regression forudsigelse model med 16-microRNA-forholdet underskrift risiko rapporteret af Boeri M

et al Hotel (2011) [10] vurderes i IARC case-control undersøgelse (2006-2012)

doi.: 10,1371 /journal.pone.0125026.s008

(DOCX)

S4 Table. Logistisk regression forudsigelse model med 16-microRNA-forholdet underskrift diagnose rapporteret af Boeri M

et al Hotel (2011) [10] vurderes i IARC case-control undersøgelse (2006-2012)

doi.: 10,1371 /journal.pone.0125026.s009

(DOCX)

S5 Table. Vurdering af hæmolyse-relaterede miRNA i patienter med lungecancer i forhold til kontrol i IARC case-kontrol undersøgelse (2006-2012)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0125026.s010

(DOCX)

tak

Vi vil gerne takke IARC Genetiske Services Platform for at give laboratorieudstyr. Vi står i gæld til fru Priscilia Chopard til teknisk bistand, Dr. Patrick van Uden for nyttige kommentarer til manuskriptet, og vi vil gerne takke alle de patienter for deres deltagelse. Vi er også taknemmelige for de ansatte i hospitaler, interviewere, data managers, patologi afdelinger, og primære plejecentre, der støttede denne undersøgelse. Den abstrakte blev præsenteret på 2014 årsmødet i American Association for Cancer Research.