PLoS ONE: retinoid signalering i kræft i bugspytkirtlen, Skade og Regeneration

Abstrakt

Baggrund

Aktivering af embryonale signalveje hvilende i den voksne pancreas er en funktion af kræft i bugspytkirtlen (PC). Disse opdagelser har ført til udviklingen af ​​nye inhibitorer af veje såsom Notch og hedgehog signalering, der i øjeblikket tidlige fase kliniske forsøg til behandling af flere cancertyper. Retinoid signalering er også afgørende for pancreas udvikling, og retinoid-behandling er anvendt med succes i andre maligniteter såsom leukæmi, men lidt er kendt om retinoid signalering i PC.

Metode /vigtigste resultater

Vi undersøgte rolle retinoid signalering

in vitro

in vivo

i normale bugspytkirtlen, pancreas skade, regenerering og kræft. Retinoid signalering er aktiv i lejlighedsvise celler i den voksne pancreas men er markant forøget i hele parenkym under skade og regenerering. Både kemisk inducerede og gensplejsede musemodeller for PC udviser en mangel på retinoid signalering aktivitet sammenlignet med normal pancreas. Som følge heraf, undersøgte vi Cellular Retinoid-bindende protein 1 (CRBP1), en central regulator af retinoid signalering vides at spille en rolle i udviklingen af ​​brystkræft, som et potentielt terapeutisk mål. Tab eller væsentlig nedregulering af CRBP1 var til stede i 70% af humant PC, og var tydelig i de tidligste forstadielæsioner (Panin-1a). Dog,

in vitro

gevinst og tab af funktion undersøgelser og CRBP1 knockout-mus foreslog, at tab af CRBP1 udtryk alene ikke var tilstrækkelig til at fremkalde carcinogenese eller ændre PC følsomhed over for retinoid baserede behandlingsformer.

Konklusioner /Signifikans

det kan konkluderes, retinoid signalering ser ud til at spille en rolle i pancreas regenerering og carcinogenese, men i modsætning til brystkræft, er det ikke medieres direkte af CRBP1

Henvisning:. Colvin EK, Susanto JM , Kench JG, Ong VN, Mawson A, Pinese M, et al. (2011) retinoid signalering i kræft i bugspytkirtlen, Skade og Regeneration. PLoS ONE 6 (12): e29075. doi: 10,1371 /journal.pone.0029075

Redaktør: Hidayatullah G. Munshi, Northwestern University, USA

Modtaget: 24 oktober, 2011; Accepteret: 20. november 2011; Udgivet: December 29, 2011

Copyright: © 2011 Colvin et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Cancer Institute i New South Wales (CINSW), National Health og Medical Research Council of Australia (# 427.655), The Cancer Råd New South Wales, St. Vincents Clinic Foundation, Royal Australian College of Surgeons, den australske Cancer Research Foundation, The Avner Nahmani kræft i bugspytkirtlen Foundation, og RT Hall Trust. AVB, CJS, DKC, EAM og EKC understøttes af stipendier fra CINSW (06 /RSA /1-05; 08 /RSA /1-15; 07 /CDF /1-28; 09 /CDF /2-40; 10 /CRF /1-01). RLS er en Senior Principal Fellow af NHMRC og holder Petre formanden for Breast Cancer Research. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Stigende beviser understøtter en central rolle for udviklingsmæssige signalveje som Notch [1] og Hedgehog [2], [3], [4] i bugspytkirtelkræft, med hæmmere af disse veje i øjeblikket i begyndelsen fase kliniske forsøg . Notch og pindsvin er også involveret i bugspytkirtlen skade, regenerering og reparation [5], betingelser, der vides at prædisponere til kræft. Retinoid signalering er afgørende for embryonale bugspytkirtlen dannelse [6], [7], [8], men lidt er kendt om dens potentielle rolle i kræft i bugspytkirtlen.

retinoider er naturligt forekommende eller syntetiske vitamin analoger, som har været anvendt med succes i behandlingen af ​​akut promyelocytisk leukæmi (APL) [9]. Trods succes retinoid behandling i APL, har behandlingen af ​​faste tumorer haft begrænset succes [10], [11], og nogle tegn på, at denne resistens over for retinoid-behandling kan skyldes afvigelser i retinoid signalering. Nedregulering af retinoidreceptorer er blevet rapporteret i mange cancere, såsom bryst-, lunge-, prostata- og esophageal cancer [11], og nedregulering af opstrøms komponenter involveret i retinoid metabolisme og oplagring dukker op som muligt nøgleregulatorer af carcinogenese og bidragydere til resistens over for retinoid baserede behandlingsformer.

Cellular retinoid Bindende protein 1 (CRBP1) spiller en stor rolle i retinoid signalering og nedregulering af CRBP1 udtryk forekommer i bryst [12], prostata [13], gastrisk [14] og i æggestokkene [15] cancere. Tab af CRBP1 ekspression i brystepitel fører til tab af differentiering og tumorprogression ved at interferere med retinoid opbevaring og dens metabolisme til den aktive metabolit, retinsyre, der producerer en lokaliseret retinoid-mangel [16], med ændret retinoid reaktionsevne [17] og cellulær transformation .

kræft i bugspytkirtlen (PC) er den fjerde hyppigste årsag til kræft død i vestlige samfund med en samlet 5-års overlevelse på mindre end 5% [18]. Fremskridt inden neoadjuverende og adjuverende kemoterapeutiske regimer har resulteret i en vis forbedring i resultaterne, men pankreatektomi er stadig den mest effektive behandling modalitet til PC, og tilbyder den eneste muligheder for helbredelse. Kun 20% af patienterne stede med lokaliseret, ikke-metastatisk sygdom som er egnet til resektion [19]. De, der gennemgår resektion og modtage adjuverende behandling har en median overlevelse på 12-22 måneder, og en overlevelse på 20-25% [20] 5-årig periode. Eksisterende systemiske behandlinger er kun beskedent effektive og den mediane overlevelse for patienter med metastatisk sygdom er fortsat 6 måneder. Derfor er der et stort behov for at udvikle nye terapeutiske strategier for kræft i bugspytkirtlen.

Her identificerer vi en potentiel rolle for retinoid signalering i bugspytkirtelkræft og pancreas regenerering og som en konsekvens kan udgøre en målrettes mekanisme for udviklingen af ​​hidtil ukendte terapeutiske strategier. Tab af CRBP1, en vigtig regulator af retinoid signalering og vigtigt i brystkræft, selv om hyppige i PC, i modsætning til brystkræft ikke i sig selv var tilstrækkelig til at fremkalde transformation.

Metoder

Etik Statement

Etisk godkendelse til dyreforsøg blev opnået fra Garvan Institute Animal Ethics Committee (Godkendelsesnumre 09/53, 07/10). Multicenter etisk godkendelse blev opnået fra Human Research etiske komitéer fra University undervisning hospitaler: Westmead Hospital, Concord Hospital, Royal Prince Alfred Hospital og St. Vincents Hospital Campus i Sydney til erhvervelse af frisk og arkivering væv og registrering af klinisk-patologiske data for patienter med diagnosticering af pancreascancer. Informeret skriftligt samtykke blev opnået fra alle patienter.

RARE-LacZ mus

RARE-LacZ mus indeholder en LacZ transgen styres af en retinsyre respons element (RARE). Celler med aktiv RA signalering pletten positive for β-galactosidase (β-gal). Ubehandlede dyr (n = 8) blev aflivet efter 10-12 ugers alderen og deres bugspytkirtel høstet for β-gal farvning.

Murine Pancreatitis Model

A caerulein-induceret model af kronisk betændelse i bugspytkirtlen var brugte ligner tidligere modeller [21]. Mus (n = 16) blev behandlet med gentagne intra-peritoneale injektioner af caerulein (MP Biomedicals, Solon, OH) fem gange om dagen, to gange om ugen i 10 uger. I denne model komplet acinært celle regenerering er rapporteret at forekomme ved 6 uger efter ophør af caerulein behandling. mus blev derfor aflivet 0, 2, 4 og 6 uger efter ophør af caerulein injektioner og deres bugspytkirtel høstet for at undersøge RA signalering på forskellige tidspunkter i løbet af tilbagebetalingsperioden.

Murine Bugspytkirtelkræft Modeller

RARE-LacZ-mus (n = 10) 10 uger gamle, blev behandlet med 7,12-dimethylbenzanthracen (DMBA; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) som tidligere beskrevet [22]. Musene blev aflivet, da de demonstrerede tegn på sygdom eller 9 måneder efter DMBA behandling og væv indsamles til β-gal farvning.

LSL-Kras

G12D /+, LSL-Trp

53R172H /+ og Pdx1-Cre mus blev indhentet fra de musemodeller af menneskelig Cancer Consortium på National Cancer Institute (Frederick, MD). For at generere pancreas tumorer, hvor RA signalering aktivitet kunne vurderes RARE-LacZ mus blev krydset med LSL-Kras

G12D /+; LSL-Trp

53R172H /+; Pdx1-Cre mus for at generere LSL-Kras

G12D /+; LSL-Trp

53R172H /+; Pdx1-Cre; RARE-LacZ afkom (n = 8). Quadruple transgene mus blev overladt til alder indtil tumorer dannet på hvilket tidspunkt de blev aflivede og væv blev indsamlet til β-gal farvning.

β-galactosidase farvning

4 um pancreas sektioner blev de-voksbehandlet og rehydreres før demaskering blev opnået under anvendelse target-hentning opløsning (S2367, pH 9,0: DAKO Corporation, Carpenteria, CA) i et kogende vandbad i 20 minutter. Endogen peroxidaseaktivitet blev standset med 3% hydrogenperoxid i methanol. Snit blev inkuberet i 1 time med 1:50 anti-β-galactosidase (AB616) polyklonalt kanin-antistof (Abcam, Cambridge, UK). Et mærket polymer peberrodsperoxidase anti-kanin påvisningssystem blev anvendt ifølge producentens instruktioner (Envision + anti-kanin; DAKO Corporation, CA). 3,3′-diaminobenzidin blev anvendt som substrat. Counter-farvning blev udført med Mayers hæmatoxylin (DAKO Corporation, Carpenteria, CA).

Patient Kohorte

Vi identificerede en kohorte af 90 patienter, som gennemgik bugspytkirtlen resektion eller biopsi fra disse hospitaler. Denne kohorte repræsenterer en delmængde af en tidligere beskrevet gruppe af 348 patienter [23], [24].

CRBP1 Immunhistokemi

pancreasvæv mikro-arrays (4 um sektioner) blev de-vokset og rehydreres før demaskering blev opnået under anvendelse target-Retrieval Solution (S1699, pH 6,0: DAKO Corporation, Carpenteria, CA) i en trykkoger i 5 minutter. Endogen peroxidaseaktivitet blev standset med 3% hydrogenperoxid i methanol. Snit blev inkuberet i 1 time med 1:50 anti-CRBP1 (FL-135) polyklonalt kanin-antistof (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Et mærket polymer peberrodsperoxidase anti-kanin påvisningssystem blev anvendt ifølge producentens instruktioner (Envision + anti-kanin; DAKO Corporation, Carpenteria, CA). 3,3′-diaminobenzidin blev anvendt som substrat. Counter-farvning blev udført med Mayers hematoxylin (DAKO Corporation, Carpenteria, CA).

Op til tre særskilte prøver af pancreas blev undersøgt per patient. Farvning blev vurderet ved to separate observatører til hvert enkelt tilfælde (E.K.C. og S.A.O.). Standardisering af scoring blev opnået ved sammenligning af score mellem observatører, og ved konferencer, hvor eventuelle uoverensstemmelser blev løst ved konsensus. Scores blev givet som en procentdel af celler med positiv cytoplasmatisk farvning i den repræsentative område af vævet microarray core, og den absolutte intensitet af cytoplasmatisk farvning på en skala fra 0 til 3 (0 repræsenterer ingen farvning, 1 repræsenterer heterogen cytoplasmatisk farvning, 2 repræsenterer homogen cytoplasmatisk farvning, og 3 repræsenterer intens homogen cytoplasmatisk farvning). En positiv score for CRBP1 blev givet på grundlag af følgende kriterier:. 50% af celler med homogen cytoplasmatisk farvning, med en intensitet på 1

Overlevelse analyse blev udført ved hjælp af Kaplan-Meier analyse, med forskelle i overlevelse vurderet ved hjælp af Log-Rank test med StatView 5.0 Software (Abacus Systems, Berkeley, CA)

pancreas cellelinier

Seks bugspytkirtelkræft cellelinjer blev anvendt:. AsPC-1, BxPC -3, Capan-2, HPAC, MiaPaCa2 og PANC1 (ATCC, VA, USA). Disse cellelinier blev dyrket ifølge ATCC protokoller. Menneskelig Pancreas Duktalt Epiteliale (Æske med HDPE og HDPE-ECOR) celler blev anvendt som en normal kontrol (venligst stillet til rådighed af Ming-Sound-Tsao, Ontario Cancer Institute) og dyrkes som beskrevet tidligere [25].

Western blotting

Proteinekstrakter blev visualiseret under anvendelse 4-12% Bis-Tris færdigstøbte geler (Invitrogen, Victoria, Australien) og overført til PVDF-membraner ifølge fabrikantens protokol. Filtrene blev blokeret med 5% skummetmælk i TBST-buffer. Anti-CRBP1 antistof (FL-135) blev anvendt ved 1:500 natten over. Membraner blev derefter inkuberet med anti-kanin-immunoglobulin G (IgG) konjugeret med peberrodsperoxidase (1:2000) (Amersham, (GE Healthcare), NSW, Australien) i 1 time ved stuetemperatur efterfulgt af forøget kemiluminescens-reagens (Perkin Elmer, Waltham , MA).

RNA-ekstraktion og cDNA-syntese

RNA fra pancreas cellelinier blev ekstraheret ved anvendelse Trizol® Reagent (Invitrogen, Victoria, Australien) ifølge producentens instruktioner. cDNA blev syntetiseret under anvendelse ABgene® Reverse-IT ™ RTase Blend (ABgene, Surrey, UK) med en blanding af oligo dT og vilkårlige hexamerer anvendelse af den første streng syntese metode. Efter denaturering af RNA ved 70 ° C, revers transkription (RT) reaktioner blev udført i en thermocycler DNA motor DYAD ™ (MJ Research, Waltham, MA) med den trinvise program på 25 ° C i 10 minutter, 35 ° C i 30 minutter, 47 ° C i 45 minutter, derefter 75 ° C i 10 minutter.

Kvantitativ realtids-PCR (QPCR)

TaqMan® genekspression-assays (Applied Biosystems, Victoria, Australien) af CRBP1 (Hs00161252_m1) blev udført ifølge producentens anvisninger. GAPDH (4326317E, TaqMan® endogen kontrol) blev anvendt som en endogen kontrol. TaqMan® qPCR reaktioner blev udført tredobbelt under anvendelse af ABI Prism 7900HT Sequence Detection System (Applied Biosystems, Victoria, Australien). Standardkurver blev inkluderet for at sikre reaktionerne blev udført i det lineære område og blev anvendt til at justere reaktionens effektivitet. Cykliseringsbetingelserne inkluderet indledende denatureringstrin ved 95 ° C i 4 minutter, efterfulgt af 95 ° C (30 sekunder) og 72 ° C (30 sekunder) i 60 cyklusser.

Knockdown af CRBP1 i Æske med HDPE-celler

To korte hårnål RNA (shRNA) -konstruktioner målretning CRBP1, siCRBP1-a og siCRBP1-B samt en kodet kontrol, siCRBP1-krypteret, (venligt tilvejebragt af Nicoletta Sacchi, Roswell Park Cancer Institute, NY) blev transficeret ind Phoenix celler under anvendelse af FuGENE transfektionsreagens (Roche, NSW, Australien). Retrovirale supernatanter blev opsamlet og anvendt til at inficere HPDE-EcoR celler. Puromycin (1 ug /ml) blev anvendt til at vælge held inficerede celler. Vellykket knockdown af CRBP1 blev bestemt ved western blot.

3D kultur af Æske med HDPE celler

HDPE-ECOR celler inficeret med shRNA blev dyrket på kammer slides belagt med vækstfaktor reduceret matrigel (BD Biosciences, San slange, CA) i keratinocyt serumfrit medium (Invitrogen, Victoria, Australien) suppleret med epidermal vækstfaktor, ekstrakt fra bovin hypofyse, 10% føtalt kalveserum og 2% matrigel i 20 dage. Medier blev ændret hver 4 dage. 3D strukturer blev genvundet ved 3, 7, 10, 15 og 20 dage ved hjælp af BD-celle recovery løsning (BD Biosciences, San Hose, CA) og protein udvundet til Western blot.

Stabil transfektion af MiaPaCa2 celler

Fire forskellige kloner af MiaPaCa2 celler, der udtrykker forskellige niveauer af CRBP1 (MP2

CRBP1 celler) og deres respektive kontroller blev skabt for at evaluere effekten af ​​CRBP1 ekspression på MiaPaCa2 celler. Cellerne blev oprettet ved hjælp af pcDNA ™ 6.2 /GFP plasmid (Invitrogen, Victoria, Australien) og pQCXIP plasmidet (Clontech Laboratories, Mountain, View, CA), der indeholder CRBP1 genet. Vektorerne blev transficeret under anvendelse Amaxa Nucleofector® Technology (Lonza Köln AG, Koln, Tyskland) ifølge producentens instruktioner. Cellerne transficeret med pcDNA ™ 6.2 /GFP plasmid blev yderligere sorteret for GFP-ekspression ved anvendelse af flowcytometri for at berige populationen af ​​celler, der udtrykker GFP /CRBP1. Ekspressionen af ​​CRBP1 i hver population blev bekræftet ved Western blot. Cellerne blev behandlet med 2, 5 eller 10 mM af alle-

trans

retinoinsyre (ATRA; Sigma-Aldrich, St. Louis, MA) på dag 1. Cellerne blev høstet og talt på dag 1, 2, 4 og 6 til at måle celleproliferation.

DNA-ekstraktion

1 mm væv kerner blev fjernet fra formalin-fikserede paraffin-indlejrede humant PC prøver og DNA blev ekstraheret under anvendelse af Gentra Puregene Tissue Kit (Qiagen, Valencia, CA) ifølge producentens instruktioner. DNA fra cellelinier blev ekstraheret under anvendelse af et DNA-ekstraktion kit (Stratagene, Santa Clara, CA) ifølge producentens instruktioner.

bisulfitbehandling

bisulfitbehandling blev udført under anvendelse af de tidligere beskrevne fremgangsmåder [ ,,,0],26] med mindre modifikationer. Sammenfattende blev 1 ug DNA denatureret ved behandling med 0,3 M NaOH og modificeret med 3 M natriumbisulfit i 6 timer. Modificeret DNA blev oprenset under anvendelse QIAEX II Gel Extraction Kit (Qiagen, Valencia, CA). Bisulfitbehandling blev afsluttet ved tilsætning af 5,5 ml 3 M NaOH, udfældet med ethanol og resuspenderet i 50 ml DNA Hydration Solution (Gentra Puregene Tissue Kit, Qiagen, Valencia, CA).

Methylering specifikke PCR (MSP )

DNA methyleringsmønstre i CpG øen CRBP1 i humane pancreatiske cellelinjer og humane prøver blev bestemt ved MSP ved hjælp af tidligere offentliggjorte primere [26], [27]. PCR-amplifikationer blev udført i 12,5 pi reaktionsblandinger indeholdende 1 til 5 pi bisulfitbehandlet DNA, dNTP’er (hver på 200 uM), primere (0,4 mM hver reaktion), 1,5 mM MgC

2, 0,75 enhed af AmpliTaq Gold® DNA polymerase (Applied Biosystems, Victoria, Australien), og 1 × PCR-buffer II (Applied Biosystems, Victoria, Australien). MSP blev udført under anvendelse af følgende betingelser: 95 ° C (30 sekunder), 58 ° C (30 sekunder), 72 ° C (30 sekunder) i 40 cykler. Cykliseringsbetingelserne omfattede et indledende denatureringstrin ved 95 ° C i 10 minutter og endelig forlængelse ved 72 ° C i 10 minutter. Alle PCR-produkter blev visualiseret ved hjælp af 1,5% agarosegel. MyoD primere [28] blev anvendt som en kontrol for kvaliteten af ​​bisulfit behandlede DNA. Disse primere indeholder ingen CpG-sekvenser

5-AZA og TSA behandling

MiaPaCa2 celler blev behandlet som følger:. (1) behandlet på dag 1 med 300 mM af 5-AZA-2′-deoxycytidin (5-AZA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) og høstet på dag 4; (2) behandlet på dag 1 med 100 nM Trichostatin A (TSA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) og høstet på dag 4; (3) behandlet på dag 1 og 3 med TSA og høstet på dag 4; (4) behandlet på dag 1 med 5-AZA, dag 2 og 3 med TSA og høstet på dag 4; (5) behandlet på dag 1 med 5-AZA, dag 2, 3 og 5 med TSA og høstet på dag 6. Ubehandlet MiaPaCa2 og Æske med HDPE-celler blev anvendt som kontroller. Under behandling blev mediet ændret dagligt, og cellerne blev vasket to gange med kold PBS før nukleinsyre og /eller protein ekstraktion.

Resultater Salg

Retinoid signalering i normale pancreas, pancreas skade og regenerering

retinoidsyre reaktion Element (RARE-LacZ) reporter-mus, der markerer celler med aktiv retinoid signaling [29] viste, at i normale pancreas, er aktiv retinoid signalering begrænset til de langerhanske øer og sjældne enkelt eller små klynger af eksokrine celler med en acinar eller centro-acinære baseret på placering og morfologi (figur 1). Gentagen intraperitoneale injektioner af cholecystokinin analoge caerulein [30] inducerer kronisk betændelse i bugspytkirtlen i mus med morfologiske ændringer såsom tab af acinar cellemasse og en stigning i bugspytkirtlen fibrose ligner den, der ses i den menneskelige tilstand. For at undersøge retinoid signalering i fastsættelsen af ​​pancreas skade og regenerering, vi pancreatitis i RARE-LacZ-mus. Mus blev behandlet i 10 uger med intraperitoneale injektioner af caerulein, ofret efter ophør af behandling, eller lov til at komme til 2, 4 eller 6 uger. Mus aflivet umiddelbart efter den sidste injektion af caerulein (på tidspunktet for akut skade) havde signifikant mindre pancreas grund acinar celle atrofi og fibrose med dannelsen af ​​”rørformede komplekser”, en manifestation af acinære at duktalt metaplasi, associeret de tidligste morfologiske ændringer med bugspytkirtlen carcinogenese (figur 2A) [31], [32].

RA signalering aktivitet i pancreas fra RARE-LacZ mus behandlet med caerulein (E), og efterfølgende opsving i 2 uger (F) , 4 uger (G) og 6 uger (H). Øget retinoid signalering aktivitet blev observeret i en væsentlig del af acinære celler umiddelbart efter ophør af caerulein behandling (E), med retinoid-aktivitet toppede på 2 uger (F), falder i 4 uger (G) og vender tilbage til næsten normale niveauer efter 6 uger af nyttiggørelse (H).

på 2 uger efter ophør af caerulein behandling, havde eksokrine regenerering påbegyndt med en stigning i acinar cellemasse, men med resterende rørformede komplekser og en vedvarende inflammatorisk infiltrat (figur 2B ). Ved 4 og 6 uger, exokrine pancreas havde nær fuldt, men ikke fuldstændigt regenereret under lejlighedsvis acinære enheder stadig udviser forstørret LUMENA ​​og en omgivende mild inflammatorisk infiltrat (Fig 2C og 2D). β-galactosidase-farvning af pancreas fra caerulein-behandlede RARE-LacZ-mus vist øget retinoid signaleringsaktivitet i en stor del af acinære celler umiddelbart efter ophør af caerulein behandling (figur 2E). Retinoid aktivitet toppede på 2 uger og formindsket ved 4 uger med næsten normalt niveau ved 6 uger (figur 2F, G, H).

Retinoid signalering i kræft i bugspytkirtlen

For at afgøre, om retinoid signalering i bugspytkirtlen blev ændret under carcinogenese undersøgte vi retinoid signaleringsaktivitet i kemisk induceret (DMBA) [22] og gensplejsede musemodeller for pancreascancer [33]. DMBA behandlet RARE-LacZ-mus udviklede dårligt differentieret, sarcomatoid tumorer (figur 3A) med en særskilt mangel af celler, der udviste aktiv retinoid signalering trods undersøgelse af flere sektioner (figur 3B). Pancreas specifik promotor drevne Cre-rekombinase (Pdx1-Cre) inducerede ekspression af aktiverede KRAS og mutant p53 indenfor bugspytkirtlen er i øjeblikket den mest hensigtsmæssige gensplejset murin model af pancreascancer. Disse LSL-Kras

G12D /+ /LSL-Trp53

R172H /+ /Pdx1-Cre mus udvikler pancreas precursor læsioner (Panin) at fremskridt til yderst invasive og metastatiske pancreas ductal adenocarcinom ved en median på 5 måneder [33 ]. Disse mus blev krydset med RARE-LacZ reporter mus til at generere LSL-Kras

G12D /+ /LSL-Trp53

R172H /+ /Pdx1-Cre /RARE-LacZ-mus. Pankreatiske tumorer, som var overvejende moderat differentieret og indeholdt rigelige desmoplastiske stroma dannet i alle mus. Der var igen en fuldstændig mangel på retinoid signalering aktivitet i disse tumorer og prækursorer læsioner trods flere sektionering og vurdering af 2 uafhængige observatører, hvoraf den ene var en specialist i bugspytkirtlen patolog (figur 3D, E, F).

i tumorer fra DMBA behandlet RARE-LacZ mus blev der observeret en tydelig mangel af celler, der udviser aktiv retinoid signalering (B). I LSL-KrasG12D /+; LSL-Trp53R172H /+; Pdx1-Cre, RARE-LacZ pancreas tumorer og prækursorer læsioner, der var også en fuldstændig mangel på retinoid signalering aktivitet (D og F henholdsvis)

Tab af CRBP1 udtryk er en fælles og tidlig begivenhed i bugspytkirtelkræft

Cellular retinoid Bindende Protein 1 (CRBP1), er en vigtig regulator af retinoid signalering menes at spille en væsentlig rolle i bryst carcinogenese [16], [34]. Indledende bemærkninger identificeret også nedregulering af CRBP1 transkriptniveauer i PC [35] og Panin [36]. Som følge heraf, undersøgte vi tab af CRBP1 som en mulig årsag til formindsket retinoid signalering i PC, og en rolle i pancreas carcinogenese.

I en kohorte af 90 patienter, immunohistokemi viste signifikant nedregulering af CRBP1 proteinekspression i 70 %, med fuldstændig tab af ekspression i 50% af disse (35% af det samlede, figur 4A, B, C, D). Tab eller nedregulering af CRBP1 udtryk forekom tidligt i PC udvikling og var til stede i 100% af Panin-1A og 1B læsioner af patienter, som havde afvigende udtryk inden for deres kræft (figur 4E, F). Tab af CRBP1 ekspression forekom også i 50% af tidlige forstadielæsioner (PanIN1A og 1b), der er forbundet med kronisk pancreatitis, en kendt risikofaktor for PC. Hverken tab eller nedregulering af udtryk var forbundet med patientens udfald (Log-Rank

P

= 0,3539, Figur S1). Hertil kommer, 4 af de 6 PC cellelinjer demonstrerede tab eller nedregulering af CRBP1 udtryk (figur 5A og B).

(C) CRBP1 methylering status i PC-cellelinjer og (D) restaurering af CRBP1 udtryk med kombinationsbehandling af MiaPaCa2 celler med 5-Aza og TSA. (E) CRBP1 knockdown i stabilt transficerede HDPE-EcoR celler. (F) Æske med HDPE celler dyrket i 3D demonstrerer ingen ændring i morfologi mellem siCRBP1 celler og scrambled kontrol.

Tab af CRBP1 udtryk er forbundet med reversibel promoter hypermethylering

Methylering specifik PCR (MSP ) og bisulfit genomisk sekventering (BSG) identificerede CRBP1 promotor hypermethylering i 27,3% af 33 humane PC prøver mangler CRBP1 ekspression i modsætning til 5 af 5 matchede normale bugspytkirtel prøver som ikke blev methylerede. CRBP1 promotor hypermethylering blev detekteret i MiaPaCa2 celler (figur 5C), og behandling med demethyleringsmiddel 5-AZA alene eller i kombination med HDAC-inhibitor TSA, induceret ekspression af CRBP1 mRNA (figur 5D). Evnen til at vende CRBP1 tavshed farmakologisk præsenterede den potentielle mulighed for at bruge retinoider og HDAC-hæmmere som kombinationsbehandlinger til terapeutisk målrette CRBP1.

nedregulering af CRBP1 udtryk i cellelinjer og musemodeller

For at vurdere rolle CRBP1 nedregulering i pancreas carcinogenese, immortaliseret human pancreas Ductal Epitelceller der udtrykker muse ecotrope retrovirale receptor (HDPE-EcoR) blev retroviralt transduceret med to shRNA konstruktioner målretning CRBP1 samt en kodet kontrol. Celler blev derefter dyrket i 3D kultur for 20 dage. Western blot demonstrerede 50% knockdown af CRBP1 ekspression (figur 5E), men der var ingen mærkbar forskel i morfologi sammenlignet med kontroller (figur 5F). Desuden pancreas fra 12 måneder gamle CRBP1 knockout-mus [37] (venligst stillet til rådighed af Prof. Pierre Chambon) viste ingen tydelige morfologiske forskelle i forhold til at styre mus (data ikke vist).

CRBP1 overekspression i MiaPaCa2 celler

for at undersøge effekten af ​​restaurering af CRBP1 udtryk blev MiaPaCa2 celler, som normalt ikke udtrykker CRBP1 stabilt transficeret til at generere flere kloner der udtrykker forskellige niveauer af CRBP1 (lav, medium, høj og meget høj) med ingen effekt på spredning satser i forhold til den tomme vektor kontrol (Figur S2A) og ændrede ikke følsomhed over for retinoid-behandling, når de behandles med All-trans retinoinsyre (ATRA) (figur S2B og S2C).

diskussion

den nye rolle dysreguleret embryonale signalveje som Notch og Hedgehog [4] er at give mulighed for udvikling af nye terapeutiske strategier for kræft i bugspytkirtlen. Retinoid signalering er uundværlig for normal fosterudvikling, herunder dannelsen af ​​de spirende bugspytkirtlen [6], [7], [8]. Vore data viser, at signalering aktivitet i normal pancreas er begrænset til pancreas-øer og sjældne celler i exokrin pankreas, hvoraf mange lignede centro-acinære celler, de formodede stamceller i bugspytkirtlen. En nylig undersøgelse identificeret, at celler i pancreas, der udtrykker RA-syntetiserende enzym, aldehyddehydrogenase 1 (ALDH1), er centroacinar celler, der udviser stamceller egenskaber [38]. Dette mønster af aktivitet svarer til den ekspression af transkriptionsfaktoren Pdx1 som menes også at markere exokrine progenitor eller “stamceller” celler. Funktionelle udlæsninger af

in vivo

retinoid signaleringsaktivitet hjælp reporter mus i vores undersøgelse tyder på, at augmented signalering spiller en rolle i pancreas regenerering efter skade. Aktiv signalering, normalt begrænset til bestemte celletyper bliver udbredt indtil differentiering af nye eksokrine acini er færdig. Behandling af mus med gentagne doser af caerulein resulterer i en dramatisk stigning i ALDH1-positive celler, som antages at repræsentere øget retinoid signalering [38], hvilket yderligere understøtter vores resultater.

Dereguleret retinoid signalering er blevet identificeret i mange kræftformer [11], og selv om tidligere undersøgelser har identificeret afvigende ekspression af komponenter af retinoid signalering samt efterfølgende mål i PC [35], [39], [40], [41], [42], [43], lidt var kendt om retinoid signalering aktivitet. Vurdering af retinoid signalering reporter aktivitet i både kemisk induceret pancreascancer, og i gensplejsede modeller i vores undersøgelse udviste manglende retinoid signalering. Baseret på disse observationer, vi hypotese, at en mangel på retinsyre signalering kan hindre normal differentiering som reaktion på kræftfremkaldende stimuli og bidrage til bugspytkirtlen carcinogenese, og at genoprettelse af retinoid signalering kan tilvejebringe et nyt terapeutisk mulighed.

Som derfor undersøgte vi rollen som CRBP1, en vigtig del af retinoid signalering, og menes at spille en vigtig rolle i bryst carcinogenese [16], [34]. Vi identificerede tab eller nedregulering af CRBP1 ekspression (som potentielt vil give tab af retinoid signaleringsaktivitet) i 70% af pancreascancer prøver, med en høj andel grund promotor methylering. Tab eller nedregulering af CRBP1 ekspression var til stede i de tidligste forstadielæsioner af PC, både i forbindelse med PC og i kronisk pancreatitis, en risikofaktor for udvikling af PC. Men knockdown af CRBP1 udtryk i udødeliggjort pancreas duktale epitelceller fremprovokere transformation. Ligeledes gjorde CRBP1 knockout-mus ikke demonstrere en pancreas fænotype på over 12 måneder. Desuden har genindførelse af CRBP1 i PC celler, der mangler CRBP1 ikke ændre ufølsomhed til retinoid terapi. Vigtigt er det, de seneste data tyder på, at pancreas stjemeformige celler kan spille en central rolle i retinoid signalering og modstandsdygtighed over for retinoid-behandling

in vivo

[44]. Dette skal tages i betragtning, især da de data, der præsenteres her fokuseret på pancreas epitel komponent.

I resumé, pancreas skade inducerer retinoid signalering aktivitet inden bugspytkirtlen, som er udbredt i løbet af skade og regenerering og potentielt spiller en vigtig rolle i denne proces.