PLoS ONE: En magnetisk perle-Based Sensor til kvantificering af Multiple prostatakræft Biomarkers

Abstrakt

Nye biomarkør assays og opgraderede analytiske værktøjer er et presserende behov for præcist diskriminere benign prostatahypertrofi (BPH) fra prostatakræft ( Kasket). For at løse dette udækket behandlingsbehov rapporterer vi en piezeoelectric /magnetisk perle-baseret assay til kvantificering prostataspecifikt antigen (PSA; fri og total), prostatisk sur phosphatase, kulsyreanhydrase 1 (CA1), osteonectin, IL-6 opløselig receptor (IL -6sr), og spondin-2. Vi brugte sensoren til at måle disse syv proteiner i serumprøver fra 120 godartede prostatahypertrofi patienter og 100 Gleason score 6 og 7 CaP hjælp serumprøver tidligere indsamlet og opsparede. Resultaterne blev analyseret med receiver operator karakteristik analyse. Der var signifikante forskelle mellem BPH og Cap patienter i PSA, CA1 og spondin-2 analyser. Den højeste AUC diskrimination blev opnået med en spondin-2 eller fri /total PSA drift-området under kurven var 0,84 med en p-værdi under 10

-6. Nogle af disse data synes at modsige tidligere rapporter og fremhæve betydningen af ​​stikprøveudvælgelsen og ordentlig assay bygning i udviklingen af ​​biomarkør måling ordninger. Denne kugle-baserede system giver vigtige fordele i assay bygning, herunder lave omkostninger, høj kapacitet, og hurtig identifikation af et optimalt matchet antistof par

Henvisning:. Jokerst JV, Chen Z, Xu L, Nolley R, Chang E , Mitchell B, et al. (2015) En magnetisk perle-Based Sensor til kvantificering af Multiple prostatakræft biomarkører. PLoS ONE 10 (9): e0139484. doi: 10,1371 /journal.pone.0139484

Redaktør: Chandan Kumar-Sinha, University of Michigan, USA

Modtaget 22. januar 2015; Accepteret: September 13, 2015; Udgivet den 30. september, 2015

Copyright: © 2015 jokerst et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af USA National Cancer Institute Grant U01 CA152737, R25-T CA118681 og de Kanariske Foundation. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft (CaP) er den næststørste årsag til kræft død i amerikanske mænd, der endnu effektive screening og prognosticering værktøjer været undvigende på grund af ikke-specifikke assays og biomarkører [1]. Mens enzymbundet immunosorbentassay (ELISA) er den gyldne standard for måling af serum proteiner, den lider af lange assay udviklingstiden for nye biomarkører, prøvevolumener høje, og kræver mange komplicerede betjeningsskridt. ELISA kan også lider af forhøjet baggrund og ikke-specifikke interferens, fordi det bruger en ordning optisk-baserede rapportering.

For at løse dette, er blevet foreslået mange konkurrerende teknologier, herunder chemiluminescent-, microfluidic- [2], nanoteknologibaserede [3], og magnetisk-baserede [4] tilgange. Men mange af disse fremgangsmåder lider høje omkostninger, lille produktion, lange assay byggetid, og behovet for en øvet operatør. Således er en kraftfuld, men simpel assay platform med universal værktøj til en bred vifte af protein biomarkører er endnu ikke rapporteret. Især vil det biomarkør samfund være godt tjent med analytiske værktøjer til paneler af biomarkører.

Faktisk flere nyere undersøgelser har antydet, at paneler af biomarkører kan være mere effektive på tidlig identifikation af kræft og klassifikation af sygdomme aggressivitet end prostata specifikt antigen [5] eller andre enkelt punkt analyser [6, 7]. Faktisk, på grund af den dybe biologiske kompleksitet af cancer, er det logisk, at analysere for mere end én biomarkør ville være gavnligt i nøjagtigt prognosticering eller påvisning af sygdomme hos det højeste antal patienter. Disse paneler omfatter transmembrane proteiner [8], metabolitter [9], auto-antistoffer [10], ikke-kodende RNA, såsom

PCA3

[11], genfusioner herunder

TMPRSS2-ERG Salg [12], cirkulerende tumorceller [13, 14], DNA methylering mønstre [15], gen profilering [16], exosomer /prostasomes [17], og mange andre [18].

Her beskriver vi en piezoelektrisk membran tilgang, der bruger specifikke interaktioner med magnetiske perler til at kvantificere prostatakræft biomarkører med mange fordele for assay bygning: 1) Denne tilgang er næsten matrix-fri, fordi det bruger magnetkontakt og piezo-baserede kvantificering ordninger i stedet for optik; 2) Systemet kan hurtigt ( 2 dage) identificere en matchet antistof par til immunoassay; 3) Systemet har Detektionsgrænser log ordrer lavere end ELISA grund af aviditeten af ​​den tredimensionale vulst versus plane ELISA; og 4) Systemet er stort set operatør-uafhængig.

Vi brugte dette værktøj til at oprette en prostatakræft biomarkør panel og evalueret dens anvendelighed fra prøver fra Cap patienter og patienter med benign prostatahypertrofi (BPH). Vi fokuserede på serumproteiner grund deres lette prøvetagning, etablerede rolle i identifikation og overvågning sygdom, og det store antal opsparede serumprøver rådighed til test. Vi inkluderede nyligt identificerede markører som etablerede PSA-baserede tests. Syv proteiner blev inkluderet i dette panel baseret på den aktuelle litteratur forståelse af CaP:

PSA [5] er en enzymatisk glycoprotein produceret af prostata med funktion i sperm motilitet [7]. Dette panel omfatter både frit PSA (fPSA) kompleksbundne at chaperone kulhydrat proteiner og total PSA (TPSA), som omfatter både kompleks og kompleksbundne isomerer [19, 20].

prostatasyrephosphatase (PAP) er et 100 kD glycoprotein syntetiseret i prostata, som hydrolyserer phosphatestere ved sur pH. PAP er dokumenteret i den historiske litteratur og blev anvendt før identificering af PSA at påvise og overvåge CaP [21]. Paneler udnytte PAP har vist øget specificitet, men ingen stigning i følsomhed [22].

Karboanhydrase 1 (CA1) er en metalloenzym impliceret i omdannelse af opløst CO

2 og vand i bikarbonat og er ansvarlig til pH-regulering. CA1 er for nylig blevet vist at være opreguleret i Cap patienter gennem massespektrometrisk profilering [23].

udskilt protein sure og rig på cystein (SPARC), også kendt som osteonectin eller kælder-membranprotein 40 er en 40 kD protein impliceret i migrationen af ​​prostata cancer celler [24] og metastatisk prostatacancer [25].

Interleukin-6 (IL-6) er en inflammatorisk cytokin. IL-6 og dens ligand IL-6 opløselig receptor (IL-6SR) er korreleret med aggressiv sygdom, herunder højere Gleason score, fremskredent stadium, udvikling af metastase og nedsat overlevelse [26, 27]. Cirkulerende niveauer af både IL-6 og IL-6SR menes at skyldes den primære tumor i modsætning til metastatiske aflejringer [7].

Spondin-2 (SPON2) arbejder med Wnt vej til at aktivere beta catenin og kan lette morfogenese [28]. SPON2 har vist sig at være overudtrykt i vævskulturmedium af androgen receptor positiv prostata cancercellelinier [29, 30]. SPON2 serum test blev også vist at være forhøjet hos patienter med CaP forhold til raske kontroller [31].

Denne magnetisk perle-baseret system korrelerer koncentrationen af ​​biomarkør for ændringer i akustiske frekvens en piezoelektrisk membran [32]. Det lineære dynamiske område af assayet blev indstillet til at matche den relevante koncentration af disse biomarkører i fortyndet serum [33]. Vi først identificeret matchet antistof par, og derefter karakteriseret analyserne for reproducerbarhed, analytisk sensitivitet, og matrix interferens. Vi endelig undersøgte den kliniske sensitivitet og specificitet af panelet med en retrospektiv forsøg på 240 bankforbindelser humane serumprøver. Så vidt vi ved, er dette det første eksempel på disse proteiner integreret i et enkelt panel og den mest detaljerede brug af denne perle-baserede piezoelektriske analysesystem med vigtige implikationer i CaP screening, overvågning og behandling.

Materialer og metoder

Antistoffer

med mindre andet er angivet, blev immunoreagenser funktionaliserede i vores laboratorium og valideret med enten en rekombinant eller patient-renset protein standarder. Optimale matchede par, herunder capture-antistof (c.Ab) og påvisning af antistof (d.Ab) blev fremstillet af følgende leverandører:

TPSA: The c.Ab (Meridian p /n M66280M) den d.Ab (Meridian p /n M66276M) var både muse-monoklonalt IgG

fPSA:. det c.Ab (Meridian p /n M86806M) den d.Ab (Meridian p /n M66276M) var både mus monoklonalt IgG. For både TPSA og fPSA brugte vi naturligt humant PSA forberedt i vores laboratorium, som standard [34]

PAP:. Det c.Ab (CosmoBio p /n SIM-2ZHCMP2-EX, klon Hyb-7432, beskrives nedenfor som cos2) var en mus monoklonalt, og d.Ab (CosmoBio p /n SIM-2ZHCMP1-EX, der er beskrevet nedenfor som COS1) var en mus monoklonalt. Rekombinant protein standard (Fitzgerald p /n 30C-CP1016x) valideret assayet. Andre antistoffer evaluerede omfatter et monoklonalt muse-IgG1 klon 690.017 fra R p /n 33-5500 (On1-1)) var en mus monoklonalt, og d.Ab (R p /n AF941) var et mål polyklonalt. Rekombinant protein standard (R p /n H00000759-M21) blev en kanin affinitetsrenset polyklonale og den d.Ab (Abnova; p /n H00000759-D01P) var monoklonalt muse-anti-CA1, IgG2b Kappa. Rekombinant protein standard (Abnova p /n H00000759-P01) valideret assayet

IL6-sr:. The c.Ab (R se S1 Video). Dette system består af en bænk top analysator og disponibel reagenskassette stand til at analysere 288 prøver og standarder pr løb. Analysatoren har indlejret væskehåndtering, bortskaffelse af affald, og data håndtering kapaciteter [33, 35]. Signal er rapporteret i relative enheder via indlejret software og er proportional med antallet af perler er immobiliseret på membranen og dermed analytkoncentration. Hardware kontrol og dataanalyse blev udført med Bioscale kommerciel software (Vibe-version 0.7.3).

Dette system består af en engangs 8-kanals patron tilsluttet fluide håndtering robotter og en elektrisk styret magnet. Prøver og standarder blev fremstillet ved 1: 10-1: 1000 fortynding faktor og udpladet i plader med 96 brønde sammen med perler og fluorescerende antistof. Prøverne blev fremstillet ved at blande 80 pi prøve eller standard med 20 pi perler overtrukket med c.Ab (900.000 perler /ml) og 20 pi fluoresceinmærket d.Ab (1200 ng /ml). Disse reagenser danner et immunkompleks sandwich i nærvær af biomarkør antigen (Fig 1A).

A. Den c.Ab. er kovalent bundet til en magnetisk perle, der inkuberes med prøven og fluorescein-mærket d.Ab. Denne prøve indføres i en flow-celle udjævnet med en piezoelektrisk membran coatet med et anti-fluorescein-antistof. En elektromagnet over membranen styres med indlejret software. B. Ved magnetisk forstyrrelse, alle perler (sorte cirkler) bevæge sig mod membranen (Bi), og perler med en udfyldt immunkompleks (sorte cirkler belagt med røde prikker) binder til anti-fluorescein antistof (Bii). Efter feltet er fjernet og flow genoprettet, forbliver kun perler med en udfyldt immunkompleks bundet (BIII). Disse perler ændrer svingning af membranen (repræsenteret som orangefarvet sinusformet kurve), der tolkes som signal i arbitrære enheder [36]. Se S1 Video. I B, det blå linie mærket Pos refererer til perler i nærvær af antigen, og den stiplede røde linje mærket Neg refererer til perler i fravær af antigen.

Op til 100 pi af denne blanding var nødvendig for magnetisk sortering og analyse. Denne blanding blev inkuberet under omrystning i 4 timer. Opløsningen i hver kolonne af pladen (alle 8 brønde) blev derefter automatisk pipetteret i individuelle strømningskanaler i 8-kanals patron. Efter at opløsningen blev fyldt i kammeret, blev et magnetfelt anvendt og alle perler blev draget af anti-fluorescein-IgG-overtrukket piezo membran foran det magnetiske felt. Flow og fortyndingsfaktorer blev indstillet således, at antallet af immobiliserede perler var mellem 2000-3000.

Da disse perler kommer i kontakt med denne piezo membran er oscillationsfrekvensen ændret og registreres (Fig 1B). Magnetfeltet blev opretholdt for at tillade interaktion mellem perler med komplette immunkomplekser og membranen-fluorescein tag på d.Ab lettet binding af immunkomplekset til et anti-fluorescein IgG på piezo membran. Feltet blev derefter afbrudt, og strømningen genoptages for at fjerne ikke-specifikt bundne perler. Ændringen i piezo frekvens blev derefter registreret som et mål for antallet af bundne perler og dermed antigen koncentration, der fuldender immunokomplekset (Fig 1B).

Prøver

krænges serumprøver var blevet indsamlet i løbet af 20 år med informeret samtykke fra Urologisk afdeling på Stanford University. Vi anvendte serum fordi det har koagulationsfaktorer fjernet, der kan producere ikke-specifikt signal og baggrund i plasma proteinanalyse. Diagnosen blev bekræftet med 10- eller 12-core biopsier på tidspunktet for prøvetagningen. Den interne Review Board of Stanford University godkendt denne undersøgelse og udformningen af ​​informeret samtykke. Alle deltagere forudsat skriftligt informeret samtykke på tidspunktet for prøvetagning, og deltager samtykkeerklæringer blev kurateret sammen med prøverne på Stanford Department of Urology. Disse prøver blev optøet, de-identificeret, fortyndet i PBS, og alikvoteret til afprøvning. Vi studerede 240 prøver udvalgt tilfældigt fra en bank på ~ 2.200 eksemplarer kurateret på Stanford Radiologi. Gennemsnitsalderen for de BPH kontroller var 65,9 ± 9,2 (30-87), og den gennemsnitlige alder for hætten patienterne var 62,6 ± 6,4 (46-77); var der en statistisk signifikant forskel alder mellem de to grupper (p = 0,002). Vi har medtaget disse oplysninger i teksten. Der var 120 BPH prøver og 100 tilfælde af bekræftet prostatacancer valgt; alle prøver havde PSA-værdier mellem 2-20 ng /mL. Af hætten prøverne, 32 var Gleason score 6 og 68 var Gleason score 7. Som kontrol, var der også 20 prøver fra mænd med CaP opsamlet efter radikal prostatektomi. Fortyndingsfaktorer blev optimeret empirisk at give en spike genvinding af 100% ± 10%. Poolet normal kvindelig serum blev købt fra Atlanta Biologicals.

Data Fortolkning og statistik

Signal enheder af de ubekendte blev konverteret til koncentration enheder ved hjælp af et standard S-formet kurve med Bioscale software (Vibe-version 0.7.3 ). Den afsløring rækkevidde blev defineret som de kalibreringspunkter, der kunne skelnes fra deres næste nærmeste kalibreringspunkter. Referenceområder blev taget fra kliniske retningslinjer eller litteraturen afhængigt af status af biomarkører. Vi gjorde en 2-tailed Students t-test for at sammenligne resultaterne af BPH og Cap prøver i Excel 2010. AUC og ROC kurver og tilhørende statistikker blev forberedt med GraphPad Prism 6.04.

Resultater

Identifikation af Matchet pair

Vi havde først at identificere en optimal antistof par, og det følgende afsnit beskriver denne tilgang med PAP som eksempel-resultater for andre analyser er vist i tabel 1. figur 2 viser repræsentative data for, hvordan dette blev opnået for PAP biomarkør med en såkaldt “skakbræt-assay”. Her blev fire forskellige PAP antistoffer, såvel som en isotypekontrol anvendes som både c.Ab og d.Ab. Alle fire antistoffer og en isotype kontrol blev anvendt ved antigen koncentrationer på 0 og 1 ng /ml. Fig 2A plotter signal forskellen mellem disse to koncentrationer. For PAP den højeste signal var med COS1 d.Ab og cos2 c.Ab med et signal på 0,65 A.U. (Fig 2A). Inverterende ordren, dvs. cos2 d.Ab og COS1 c.Ab havde en værdi på 0,43 A.U. Parret fra R 0,01 A.U. Således blev COS1 og cos2 anvendes i resten af ​​forsøgene.

A) Optimale antistofpar blev identificeret med et “skakbræt” assay, der evaluerede forskellige antistofpar samt isotypekontroller. Metrisk afbildet her er signalet forskel mellem den negative kontrol og 1 ng /ml rekombinant PAP. De forskellige antistoffer er defineret i afsnittet Materialer og fremgangsmåder. B) En fuld kalibreringskurve illustrerer forskellige følsomheder af forskellige antistof-par til PAP. Par 1: cos2 c.Ab .; COS1 d.Ab. Par 2: RDPo c.Ab .; RDMo. d.Ab. De røde Fejlsøjlerne repræsenterer standardafvigelsen af ​​mindst tre gentagne målinger. C) Reproducerbarhed fra dag til dag, er 8%. D) Den piezo tilgang viser 3 log ordrer forbedring i analytisk sensitivitet versus direkte ELISA, når der anvendes identiske antistof par (COS1 /cos2).

Den bedst matchede par med deraf følgende dynamiske område, henvises range, og fortyndingsfaktorer er vist for de 7 biomarkør assays samt repræsentative intra-assay variation værdier.

selvfølgelig ændre antistofpar ændrer følsomheden af ​​kurven. Fig 2B illustrerer, at ved at ændre c.Ab til RDPo og d.Ab til RDMo, følsomhedsområde ændret fra 0,01-1,0 ng /ml til 1 til 100 ng /mL. Endelig har vi sammenlignede responskurver af PAP via vulsten-baseret system med ELISA, der anvender samme COS1 /cos2 par (Fig 2D). Vi viser en 3-log orden forbedring i analytisk sensitivitet hjælp perlen tilgang, der fremhæver den forbedrede analytiske sensitivitet grund aviditet af perlen versus plane ELISA substrat.

Mængden af ​​c.Ab og d. Ab per assay blev også undersøgt (S1 fig). Fabrikanten anbefales en vulst arbejder koncentration på 150.000 perler /ml og 200 ng /mL d.Ab. Vi testede d.Ab værdier på 100 og 400 ng /ml samt 10,000-300,000 perler /ml, men fandt ikke nogen forbedring i dosisafhængig kurve fra 10,0 til 0,015 ng /ml. Ved 1 ng /ml rekombinant standard PAP, blev den højeste signal opnået med 10.000 perler /ml og 100 ng /ml d.Ab. Men disse forhold resulterede også i højere baggrund signal ved lavere koncentrationer (S1 Fig). Således 150.000 perler /ml og 200 ng /mL d.Ab blev anvendt til alle efterfølgende assays.

Assay Karakterisering

Vi undersøgte dernæst både intra-assay (mellem brønde kørt på den samme dag samtidig) og inter-assay variance (forskellen mellem den gennemsnitlige kørsler på forskellige dage, fig 2C). For PAP, intra-assay varians varierede fra 0,05% relativ standardafvigelse [37] ved 6 ng /ml til 5,47% ved 0,02 ng /ml. Den inter-analyse varians på tre forskellige dage var 7,1% RSD. Alle andre analyser havde 7% varians for intra-assay varians og 10% for inter-assay varians. Når de foretager dag-til-dag sammenligninger var det kritisk vigtigt at kalibreringskurverne være anbragt i de 96-brønds plader på samme måde på hver efterfølgende dag. Da hver række i 96-brønds plade tager ~ 5 minutter til at analysere, ændring af placeringen af ​​perlerne muliggør længere inkubationstider, hvilket kan resultere i højere perle /immunkompleks ophobning og dermed højere signal.

Med en optimeret matchet antistof par i hånden, vi næste afdækket og korrigeret eventuelle matrix interferens igen illustrerer med PAP. Vi brugte samlet normal kvindelig serum, der skal indeholde nogen PAP. Serum ved fortyndingsfaktorer fra 1: 2-1: 256 blev fremstillet og analyseret. En anden batch af fortyndede prøver blev tilsat 0,5 ng /ml PAP. Prøverne blev analyseret og procentvise udvinding afbildet i fig 3A samt spike recovery data for SPARC spiking ved 125 ng /ml og CA1 spiking ved 10 ng /mL. Resultaterne viste, at 100% genvinding blev opnået med 16-fold fortyndingsfaktorer for disse analytter. Nedsat og øget spike recovery værdier er som følge af ikke-specifik binding af andre serumproteiner til antistofferne. De øvrige fem biomarkører blev optimeret på samme måde.

A) Procent recovery for tre repræsentative biomarkører. Matrixeffekter kan enten dæmpe signalet (CA1, PAP) eller oppuste signal (SPARC). Ideelle fortyndingsfaktorer var afhængige af følsomheden af ​​analysen og referenceområde af biomarkør (tabel 1). Sort stiplet linje angiver 100% spike opsving. B) Bland-Altman plot [38] validering modellen integriteten af ​​en delmængde (N = 35) af de kliniske prøver med høje prøvevolumener. Rød stiplet linje angiver 95% konfidensinterval.

kliniske prøver

Det første skridt var at validere prøve stabilitet. For at gøre dette, vi analyseres igen PSA værdier af en delmængde (N = 35) af de prøver, der havde store mængder af serum ved hjælp af en Beckman Access klinisk analysator (Hybritech) på Stanford University Medical Center og sammenlignede dette til de værdier, der oprindeligt målt til tidspunktet for indsamlingen. Vi skabte et Bland-Altman plot og viste, at 92% af prøverne var inden for 95% konfidensintervallet (Fig 3B). Denne validering anvendes kun de prøver, der havde tilstrækkelig volumen til både det kliniske og perle-baseret assay. Resultaterne viste, at PSA integritet blev opretholdt under opbevaring.

Næste målte vi biomarkør niveauer af alle analytter i serum fortyndet til koncentrationerne vist i tabel 1. Data for BPH, CaP og post-kirurgi CaP-prøver er vist i figur 4. den gennemsnitlige værdi fra Cap patientprøver er 1,5-, 1,6, 0.83-, 0.94-, 0,79 og 1,03 gange højere end BPH for CA1, PSA, IL6-sr, PAP, og SPARC-assays, henholdsvis. Forsøg med en signifikant forskel mellem BPH og CaP var PSA (p 0,0001), CA1 (p = 0,03), SPARC (p = 0,049), og SPON2. (P 0,10

-6)

Rå værdier med midler til BPH, CaP, og post-kirurgi (PS) prøver. Biomarkører indbefatter TPSA (A), fPSA (B), CA1 (C), PAP (D), IL6-sr (E), SPARC (F), og SPON2 (G). Vandrette linjer angiver middelværdier.

Vi skabte ROC kurver og målte AUC for alle biomarkører bruger biopsi-bekræftet diagnose og målte værdier (figur 5). Den PAP AUC var 0,51; 95% konfidensinterval 0,43-0,58 med p 0,50. Den SPARC AUC var 0,51; 95% konfidensinterval 0,43-0,59 med p 0,50. CA1 AUC var 0,55; 95% konfidensinterval 0,47-0,63 med p = 0,17. IL-6SR AUC var 0,57; 95% konfidensinterval 0,50-0,65 med p = 0,06. Den SPON2 AUC var 0,76; 95% konfidensinterval 0,69-0,82 med p. 0,0001

A) Middelværdier med standardafvigelse for de syv biomarkører med BPH, CaP, og post-kirurgi [39] prøver. Enheder er ng /ml. Den p-værdi rapporteret her er betydningen mellem BPH og Cap prøver. AUC-værdier er også givet og rapportere forskelsbehandling mellem CaP og BPH. Lavere panel præsenterer ROC kurver for PSA, SPON2, og PSA ELLER SPON2. Den ELLER operatør øger AUC til 0,84 fra 0,80 til PSA alene.

AUC hos PSA er typisk for litteratur værdier [40-42]. I én meta-analyse under anvendelse frit og totalt PSA, den samlede i 41 undersøgelser med 19,643 deltagere var en AUC på 0,70 [41]. Desværre har andre biomarkører ikke forbedre AUC med undtagelse af SPON2. Denne markør havde en AUC-værdi på 0,76 i forhold til PSA AUC på 0,80. Da de to blev anvendt i en OR operation, AUC steg en smule 0,84. Ingen andre operationer eller andre kombinationer af biomarkører øgede AUC kurve.

Vi studerede også, om eventuelle biomarkører kunne skelne mellem Gleason 6 og Gleason 7 patienter (S1 tabel). Ingen af ​​de hidtil ukendte proteiner viste en p-værdi 0,05. Mens dette datasæt faktisk viste en meget signifikant forskel for TPSA ( 0,01), dette skyldes sandsynligvis tilstedeværelsen af ​​nogle afvigende værdier-p-værdien var 0,06, når vi bruges de oprindelige kliniske PSA-værdierne. Vi gjorde også ROC analyse for forskellige Gleason score versus BPH og noterede betydning med IL-6SR. Ved sammenligning af Gleason 7 patienter versus BPH med IL-6SR, fandt vi en AUC-værdi på 0,66; konfidensinterval 95% var 0,57-0,76 med p = 0,005. Adskillelse af Gleason score forbedrede ikke AUC-værdierne for andre biomarkører.

Diskussion

Der er mange tilgange til måling nye CaP biomarkører ud over de traditionelle ELISA. En af de grundlæggende flaskehalse i de fleste assay udvikling ordninger er identifikationen af ​​et passende matchet antistof par. Dette er måske den vigtigste fordel af vulsten tilgang anvendes i den nuværende arbejde-identifikation af et matchet antistof par sædvanligvis tager mindre end 2 dage fra syntesen af ​​reagenserne til den endelige udvælgelse af den optimale par. Dette system har god inter- og intra-assay reproducerbarhed (CV 10%) og kan hurtigt minimere matrix interferens. Andre fordele omfatter de lavere detektionsgrænser på grund af aviditet i perlen design samt lav tærskel for brugeruddannelse. Begrænsninger i systemet omfatter de relativt høje krav på grund af begrænset multiplexing prøve volumen. For at løse dette, udvikler vi yderligere analytiske redskaber i vores laboratorier, såsom magneto-nanosensor for multiplex analyser med store dynamiske intervaller og lav prøvevolumen (40 pi) krav kritiske for værdifulde prøver [4].

Det er vigtigt, at biomarkør verifikation have lov til at fejle hurtigt, før betydelige investeringer foretages i test udvikling eller anvendelse af ædle kliniske prøver. Denne kugle-baserede ordning giver hurtig verifikation af biomarkør potentiale. Vores data viser, at mange af de protein biomarkører tidligere er rapporteret til at skelne mellem CaP og BPH patienter mislykkedes med vores specifikke patientprøver. Måske mest overraskende var CA1. I tidligere arbejde ved hjælp af 54 CaP prøver og 60 raske kontrolpersoner [23], dette protein havde en AUC-værdi på 0,64 og en AUC-værdi på 0,76, når det kombineres med PSA. En vigtig forskel er i denne undersøgelse begrænset deres prøver til patienter i den såkaldte “grå zone” af PSA test-PSA-værdier mellem 4 og 10 ng /mL. IL-6SR har også vist sig at korrelere med progression [27] og knoglemetastaser [26], og det var sandsynligt, at differentiel ekspression ville have været målt i BPH versus CaP patienter prøver, men vi bemærkede ingen signifikant forskel mellem disse to patientgrupper.

Vores arbejde med SPON2 viser, at det har nogle nytte i CaP test. Et gerne træk fra denne undersøgelse er, at niveauerne i BPH-patienter (126,5 ng /ml) var faktisk højere end CaP-patienter (73,0 ng /ml). Denne forskel var meget signifikant ved p = 10

-6. I en tidligere papir [31], SPON2 niveauer i Cap patienter (77,5 ng /ml) var højere end hos patienter med “ingen tegn på malignitet” (23,6 ng /ml). Mens forskellene i absolutte værdier er sandsynligvis kan tilskrives forskelle i standard og antistof udvælgelse, er tendensen lidt forvirrende. En mulig forklaring er i patientudvælgelse forskelle. Disse normale raske kontrolpersoner er en meget anderledes patient kohorte end BPH gruppen anvendes til sammenligning i vores undersøgelse. Faktisk er det muligt, at SPON2 niveauerne stiger i løbet af BPH over værdier ses i enten normale eller CAP fag. Det fremtidige arbejde bliver nødt til yderligere undersøgelse SPON2 niveauer i flere patient- og kontrolgrupper med høje antal patienter til bedre at forstå disse forskelle.

En anden undersøgelse foreslået, at SPON2 er kun gældende for patienter med PSA værdier under 10 ng /mL [30]. Begrænsning vores prøver til disse patienter gav en betyde BPH værdi på 119,9 ± 65,9, en middelværdi CaP værdi på 82,6 ± 50,36 (p = 0,004) og AUC af 0,72. Således begrænser vores data til disse patienter ikke forbedre AUC.

Analyse af den post-kirurgi patienter viste, at de mest dramatiske ændringer i biomarkør forekom i PSA-baserede tests. TPSA i post prostatektomerede patienter faldt 18-fold versus BPH og 30 gange for den fælles landbrugspolitik patienterne. PAP niveauer i post prostatektomerede patienter var 2 til 3 gange lavere. Andre biomarkører viste ingen signifikant (P 0,05) ændring

Konklusion

Vi rapporterer en piezoelektrisk perle-baserede sensor til at måle serum proteiner med potentiale til at skelne mellem BPH og CaP.. Denne undersøgelse bekræftede brugen af ​​PSA til at skelne mellem BPH og CaP, men AUC-værdierne var sub-optimal for befolkningen i hele screening. Vi viste også, at bruge SPON2 i tandem med PSA via en OR operation kan øge AUC 0,80-0,84. Denne fremgangsmåde har nytte for en bred vifte af cirkulerende biomarkører og fremtidige arbejde vil evaluere mere lovende biomarkører samt urin-baserede biomarkører såsom TMPRSS2:. ERG fusion

Støtte Information

S1 Fig. Optimering af Bead og d.Ab Koncentration.

Variationer i d.Ab koncentration to gange over og under det anbefalede 200 ng /mL værdi blev anvendt som supplement til stigende koncentrationer af perler (indsat). Kalibreringskurver på hvert af disse punkter viser, at svaret er stabil ± 15% på trods af disse variationer

doi:. 10,1371 /journal.pone.0139484.s001

(PDF)

S1 Table. . Biomarkør Koncentrationer som funktion af Gleason Score

PSA viste de væsentligste forskelle mellem patienter med Gleason score på 6 og 7.

doi: 10,1371 /journal.pone.0139484.s002

(PDF)

S1 Video.