PLoS ONE: Vendbar Linkage af to forskellige småmolekyleinhibitorer af Myc Genererer en dimer inhibitor med forbedret styrke, der er aktiv i Myc Over-udtrykkende cancercellelinier

Abstrakte

Vi beskriver den vellykkede anvendelse af en ny tilgang til at generere dimere Myc inhibitorer ved at modificere og reversibelt forbinder to tidligere beskrevne små molekyler. Vi syntetiserede to rettede biblioteker af monomerer, der hver består af en ligand, en konnektor, og en bioorthogonal linker element, for at identificere den optimale dimer konfiguration, der kræves for at inhibere Myc. Vi identificerede kombinationer af monomerer, betegnet selvsamlende dimere inhibitorer, som udviste synergistisk inhibering af Myc-afhængig cellevækst. Vi bekræftede, at disse dimere inhibitorer direkte binde til Myc blokere dens interaktion med Max og påvirke transkription af MYC afhængige gener. Kontrolsystemer kombinationer, er ude af stand til at danne en dimer ikke udviser synergistiske virkninger i disse assays. Kollektivt, disse data validere vores nye tilgang til at generere mere potente og selektive hæmmere af Myc ved selv-samling fra mindre, lavere affinitet komponenter. Denne fremgangsmåde giver mulighed for at udvikle nye lægemidler mod Myc og andre udfordrende protein:. Protein interaktion (PPI) destinationsklasser

Henvisning: Wanner J, Romashko D, Werner DS, May EW, Peng Y, Schulz R, et al. (2015) Reversibel Linkage af to forskellige småmolekyleinhibitorer af Myc Genererer en dimer inhibitor med forbedret styrke, der er aktiv i Myc Over-udtrykkende kræftceller. PLoS ONE 10 (4): e0121793. doi: 10,1371 /journal.pone.0121793

Academic Redaktør: Alessandro Datti, Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, CANADA

Modtaget: 8. december 2014 Accepteret: 19 Jan 2015; Udgivet 15. april, 2015

Copyright: © 2015 Wanner et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Coferon, Inc. ydet støtte i form af lønninger til forfatterne JW, DR, DSW, EWM, YP, RS, KWF, SR, MP og ST , og LDA på tidspunktet for undersøgelsen. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling af data og analyse, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. De specifikke roller disse forfattere er formuleret i »Forfatter Bidrag ‘sektionen

Konkurrerende interesser:. JW, DR, DSW, EWM, YP, RS, KWF, SR, MP, ST og LDA er tilknyttet Coferon Inc på tidspunktet for undersøgelsen. LDA er nu tilknyttet Assembly Biosciences, Inc. MP, FB og DEB er grundlæggere og aktionærer i Coferon, Inc. JW, KWF, DSW og LDA er forfattere på en patentansøgning indgivet af Coferon Inc, der dækker molekylerne er beskrevet i dette manuskript. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer, som beskrevet online i vejledningen for forfattere.

Introduktion

Anvendelse af små molekyler som lægemidler til inhiberer cancertargets har gjort enorme fremskridt i de sidste 20 år, med mange lægemidler i rutinemæssig klinisk anvendelse i en lang række forskellige cancere. Denne tilgang har været særligt vellykket for enzymatiske mål, hvor bindingsstedet er et veldefineret, adskilt lomme i det protein, der egner sig til det rationelle design af meget kraftige inhibitorer. Men bestræbelser på at udvide brugen af ​​små molekyler til at målrette større eller uordnede arealer, der er afgørende for at regulere protein-protein interaktioner (PPI) er blevet mødt med mere begrænset succes. Prototypisk PPI-inhibitorer tendens til at være store i størrelse og har dårlig lægemiddel lignende egenskaber og så har begrænset anvendelighed i klinikken. Det er klart, så der er behov for innovative tilgange til fuldt ud at muliggøre opdagelsen af ​​lægemidler til det store antal af, hvad der generelt anses for terapeutisk relevante, men undruggable mål klasser i mange sygdomsområder.

Som en metode til at løse mere udfordrende stof mål, som vi er ved at udvikle en ny teknologi til at tillade selvsamling af små molekyler i store dimere inhibitorer, først beskrevet af Barany og kolleger [1]. Den teknologiske platform muliggør levering af dimere molekyler med en stor binding fodaftryk til at hæmme biologiske mål, der ofte er udfordret traditionelle lægemidler kemi tilgange (fig. 1A). Dimererne er sammensat af to monomerer, der hver omfatter en ligand, en konnektor, og en bioorthogonal linker element. Under fysiologiske betingelser kan de monomerer hurtigt ækvilibrere til danne dimerer gennem dannelsen af ​​reversible covalente bindinger mellem linker elementer. Linkerne er designet til at være lavmolekylære dele, der let kan vedføjes målrettet ligander via egnede konnektorer. De ligander, linkere og stik kan alle modificeres til tune egenskaberne af monomererne og give en optimal gode lægemiddellignende egenskaber til at opnå den ønskede farmakokinetiske profil. De optimerede monomerer kan absorberes, fordeles til vævene, og trænge ind i cellerne. Inde i cellen, kan monomererne binde målet direkte, så målet at drive selvsamling af dimeren. Alternativt kan monomererne igen ækvilibrere inde i cellen for at danne dimeren i opløsning, og dimeren kan direkte binde og inhibere målet. Det omfang, hvori hver vej bidrager til den hæmmende virkning afhænger af de iboende tilhørsforhold af ligander til deres respektive bindingssteder på målet, stik længde, og dimeriseringen konstant af linkerne ansat. Enten sti fører til målproteinet være bundet af dimererne med en højere affinitet og større specificitet end de indgående monomerer. Den vigtigste fordel ved denne fremgangsmåde er, at den gør det muligt for den intracellulære dannelse af et stort molekyle inhibitor, velegnet til målretning af protein-protein-interaktion overflader, samtidig med at evnen til at udnytte på narkotika-lignende egenskaber af de lavmolekylære bestanddele.

A) Skematisk repræsentation af selvsamlende dimer tilgang. Individuelle monomerer (blå og grøn), sammensat af ligand, stik og en parret bioorthoganol linker leveres til cellerne, krydse plasmamembranen og reagerer til dannelse af et aktivt dimert inhibitor i cellerne. Dimer samling kan forekomme i det cellulære miljø eller på målet af interesse. B) Skematisk fremstilling af borsyren /diol-ligevægte anvendes under dannelse af dimer. Trigonal plane, neutrale specier er i ligevægt med de ladede chirale tetraedriske arter. For en given diol, i det cellulære miljø ved pH 7,4 til ligevægte er bestemt af pKa’er for de boronsyrer anvendte og af pKa’er for boronatestere dannet. Racemisering af de chirale opladet arter forekommer meget hurtigt, og det biologiske mål vil selektere for det mest foretrukne dimer. C) Oversigt over bibliotekets design: Strukturer af to forælder molekyler C01 (til venstre) og C02 (til højre) og vedhæftede positioner; konnektorer er enten alkylkæder eller PEG-enheder; R og R ‘er knyttet til stikkene via amid eller carbon bindinger; syntetiske detaljer af udvalgte bibliotekselementer findes i de supplerende eksperimentelle procedurer.

En række bioorthogonal indeksobligationer er modtagelige for denne teknologiplatform. Vi og andre har beskrevet atom-effektive arylboronsyre linkere der reversibelt kan dimeriserer med forskellige catecholerne og

cis

ky diol partnere under vandige betingelser [1, 2, 3, 4] (fig. 1B). De boronsyrer og partnerlandene dioler etablere ligevægt hurtigt, med dimeriseringsindretninger konstanter typisk i uM til mM område [5, 6]. Vigtigt er det, kan dimeriseringen konstant justeres via substituenter. For eksempel er indførelsen af ​​steriske virkninger på begge bindingskomponenten disfavors boronatester hydrolyse, skiftende monomeren-dimer ligevægt i retning dimerdannelse, hvilket resulterer i forbedrede dimeriseringsindretninger konstanter [7, 8], og kan omsættes i bedre styrker af den resulterende dimere inhibitor. Både borsyre og diol linkere kan vedhæftes ønskede ligander gennem en bred vifte af stik dele ved hjælp af letkøbte syntetiske metoder. Denne teknologi kan anvendes på enhver target, der omfatter to eller flere proximale bindingssteder, der kan lukkes, med ligander, der bærer egnede konnektorer og linkere. Typisk dimerer dissociere fra målet med langsommere off-satser, som fører til langvarig hæmning af målet.

Her har vi anvendt denne teknologi til at udvikle inhibitorer mod c-myc (benævnt Myc følgende) transskription faktor. Myc tilhører en familie af transkriptionsfaktorer, hvis andre medlemmer omfatter MycL og MitCN og disse transkriptionsfaktorer har vigtige roller i at kontrollere celleproliferation, overlevelse og differentiering [9, 10]. Myc normalt stramt reguleret, men dens udtryk niveauet kan øges betydeligt i kræft, og det menes at være en vigtig drivkraft for tumor biologi. Myc aktivitet kan dereguleres ved øget ekspression ved enten genamplifikation [11] eller gen translokation [12]. I mere begrænsede tilfælde, især i Burkitts lymfom,

Myc

genet muteret [13, 14], der kan resultere i en mere stabilt protein [15, 16]. For at fungere biologisk, Myc danner en heterodimer med partneren Max, og den resulterende dimer binder til specifikke promotor- motiver, rekrutterer transkriptionsaktivering komplekser, og i sidste ende aktiverer Myc-afhængige gener. Det er klart, at inaktivering af Myc kan føre til væsentlige antitumorvirkninger i musemodeller for cancer [17, 18]. Desuden er funktionel inaktivering af Myc i normale væv ved anvendelse af en dominant negativ form, (OmoMyc) veltolereret [19], støtter det koncept, at terapeutisk målretning denne vej kan være et middel til behandling af kræft.

Talrige direkte og indirekte metoder er blevet udviklet til at målrette Myc biologi [20]. Senest små molekyler, der inhiberer BET familien af ​​epigenetiske læser proteiner og virkninger

Myc

genekspression har vist fremragende præ-klinisk virkning i Myc-afhængige tumormodeller [21, 22, 23] og er i øjeblikket i kliniske forsøg. Adskillige grupper har også rapporteret småmolekylære inhibitorer, der binder direkte til Myc og inhiberer dens interaktion med Max [24, 25]. Disse inhibitorer, som oprindeligt blev indført ved Prochownik et al, binde med mikromolær affinitet og forstyrre Myc: Max interaktion, samt inhibere proliferation af Myc-udtrykkende tumorcellelinier. To sådanne små molekyler, 10058-F5 og 10074-G5, har vist sig at binde uafhængigt og samtidig til den forstyrrede konformation i den grundlæggende helix-loop-helix leucin-zipper (bHLHZip) domæne af Myc, og dermed hæmme dens interaktion med Max [26 , 27, 28]. Derudover har tætte analoger af 10058-F4 og 10074-G5 med lignende og forbedrede kræfter blevet beskrevet [29, 30, 31, 32, 33].

Vi har udnyttet vores teknologiplatform til at udvikle selvsamlende dimerisk inhibitorer af Myc under anvendelse af disse tidligere beskrevne små molekyler som vores startende individuelle ligander. Disse molekyler er desuden modificeret med vedhæftede stik og indeksobligationer skal lette reversible dimerdannelse. Vi viser, at vores nye inhibitorer direkte binder til Myc med forbedret affinitet over eksisterende små molekyle inhibitorer, forstyrre Myc: Max interaktion

in vitro

, og påvirke ekspressionen af ​​MYC regulerede gener i celler, hvilket resulterer i anti-proliferative effekter i Myc-udtrykkende tumorcellelinier.

Materialer og metoder

Compound Synthesis

En fuldstændig beskrivelse af syntetiske ruter for molekylerne, der er beskrevet i dette dokument, kan findes i S1 File .

Cell Culture, proliferation og Synergy analyse

K562 (CCL-243), Daudi (CCL-213), Raji (CCL-86) og MV4-11 (CCL-9591) celler blev købt direkte fra American Type Culture Collection (Manassas, VA) og rutinemæssigt dyrket under anbefalede betingelser. Vækst og proliferation blev bestemt ved anvendelse af Cell Titer 96 Aqueous One Solution (Promega, Madison, WI). Alle celler blev udpladet med 10.000 celler per brønd i vækstmedier i en klar plade med 96 brønde. Efter 3 dages behandling med forbindelsen reagens blev tilsat, og absorbansen ved 490 nm blev aflæst efter inkubation i 4 timer ved 37 ° C. En kontrolplade af forbindelse fortyndet i medier ved de samme koncentrationer blev behandlet på lignende måde, og disse værdier trækkes fra cellepladen data for at kontrollere for enhver forbindelse interferens i assayet. Synergi blev bestemt under anvendelse af Bliss uafhængighed.

Cellelyse og Western blotting

lægemiddelbehandlede celler blev vasket i PBS og lyseret i RIPA-buffer (suppleret med protease og phosphataseinhibitorer) (Sigma, St. Louis, MO) på is i 30 minutter. Totale proteinkoncentrationer blev bestemt under anvendelse af et BCA-kit (Thermo Scientific, Rockford, IL). Western blots blev udført ved at løse proteiner ved SDS-PAGE og overførsel til nitrocellulosemembraner. Membraner blev probet med antistoffer mod: c-Myc (9E10) (sc-40); HRP-konjugeret GAPDH (FL-335) (sc-25.778 HRP) (alle fra Santa Cruz Biotechnology); Max (AF4304) (R Spaltet PARP (Asp214) (D64E10) XP (5625; Cell Signaling). Proteiner blev visualiseret ved anvendelse peberrodsperoxidase-konjugeret sekundært Mus eller kanin (1: 5000) (GE Healthcare) eller ged (1: 1000) (R .. 50 uM Fig 3A og tabel 1) i overensstemmelse med en nylig rapport ved hjælp af de parentale ligander 10058-F4 og 10078-G5, som viste affiniteter 39,7 pM og 31,7 pM for henholdsvis Myc i en lignende SPR assay [35]. I modsætning hertil kombinationen af ​​E07 + N12 bundet med en Kd på 8,6 uM, en bemærkelsesværdig forbedring i forhold til individuelle monomerer. Vi observerede lignende data med E08 + N11 dimer. Især observerede vi mætning binding af kombinationerne med støkiometri af dimer bindende mindre end én, udelukker muligheden for, at forbindelsen aggregering forårsaget af dimerisering var ansvarlig for forøget binding observeret.

A) hæmmere viser mætte binding af Myc i SPR eksperimenter. Equilibrium responsenheder (RU), normaliseret til maksimal mættede værdier i de enkelte forsøg, er plottet (gennemsnit ± SEM) som en funktion af inhibitorkoncentration. B) dosisresponskurver til inhibering af Myc: Max interaktion som bestemt ved ELISA. Dataene er vist som en del af aktivitet sammenlignet med en DMSO-behandlet kontrolprøve og afbildes som en middelværdi på 2-5 eksperimenter ± SD. X-aksen betegner koncentrationen af ​​hver monomer anvendes.

For at bekræfte, at den dimere inhibitor kørte den forbedrede binding til Myc syntetiserede vi en analog af N12, der var ens i alle aspekter, bortset det mangler diolgruppen kræves til omsætning med sin boronsyre modstykke (C12, fig. 2C). C12 alene eller i kombination med E07 havde Kd-værdier 50 pM (. Figur 3A og tabel 1), hvilket støtter den konklusion, at evnen til at danne dimer var vigtigt for den forøgede binding af disse monomerer

Vi næste. spurgte, om binding af disse dimerer til Myc kan forstyrre interaktionen med dets transskriptionelle partner Max. Vi udviklede en ELISA ved hjælp renset Myc og Max protein, der tillod os at måle effekter på Myc: Max binding. ELISA-pladen blev indledningsvis overtrukket med Max protein og forbindelserne præinkuberet med Myc protein før tilsætning til Max-overtrukne plade. Efter omfattende vask blev Myc-binding til Max detekteret ved anvendelse af et anti-Myc-antistof. Vi oprindeligt testet forælder ligandmolekyler, C01 og C02, og observerede lidt hæmning med en af ​​monomerer (IC

50 30 uM) eller kombinationen (IC

50 23 uM) på Myc: Max interaktion (S1 tabel). Vi næste fokuserede på en af ​​vores identificerede dimere inhibitorer, E07 + N12 og tilsvarende observeret, at de enkelte monomerer E07 og N12 viste lidt inhibering af Myc: Max interaktion (IC

50 24 uM og 30 pM henholdsvis fig. 3B og tabel 1). I modsætning hertil kombinationen af ​​E07 + N12, doseret i et 1: 1 forhold, inhiberede Myc-binding til Max på en dosisafhængig måde (IC

50 3.3 uM) (fig 3B og tabel 1.), En 8 ganges forøgelse over mest aktive enkelte monomer. Vi observerer lignende virkninger for det dimere inhibitor E08 + N11 (tabel 1)

kontrol kombination af C12 med E07 undladt at vise aktivitet i Myc: Maks. ELISA ud over aktiviteten af ​​E07 alene (. Fig 3B) , hvilket antyder, at evnen hos E07 + N12 til at dimerisere kørte den forbedrede inhibitoriske virkning. Begrænsede effekter blev observeret med yderligere ikke-dimeriserbare kontrol kombination E08 + C11 (tabel 1)

selvsamlende dimerer selektivt hæmmer Myc: Maks. Binding til DNA

Efter at have bekræftet, at dimerer binder at myc og blokere dets binding til Max vi næste ønskede at bekræfte, at disse inhibitorer selektivt blokeret den biologiske aktivitet af myc i et cellefrit assay. Dannelsen af ​​Myc: Max heterodimeren kræves for dets evne til at binde til DNA-sekvenser og udløse transkriptionel aktivering af Myc-afhængige gener. Max har den yderligere evne til at danne homodimerer der kan binde til de samme DNA-sekvenser, men generelt undertrykke genekspression [9, 10]. Vi udførte derfor et elektroforese gelmobilitetsændring assay at bestemme, om vores inhibitorer havde selektivitet til inhibering af bindingen af ​​Myc: Max heterodimerer til DNA løbet Max: maks. Homodimerer

Inkubation af Max-protein med E-box-oligonukleotid resulterede i et DNA-bånd skift indikerer Max: Max homodimerer (. figur 4A). Tilsætning af Myc resulterede i et fald i mængden af ​​Max: Max homodimerer og fremkomsten af ​​Myc: Max heterodimerer i kompleks med DNA. Ingen af ​​de to monomerer, E07 eller N12, haft nogen mærkbar effekt på Myc: Max eller Max: Max komplekser, men E07 + N12 forårsagede en dosisafhængig fald i niveauerne af de Myc: Max kompleks. Især faldet i Myc: Max kompleks er omvendt korreleret med en stigning i niveauerne af Max: Max kompleks, hvilket tyder dimeren er specifikt blokerer Myc: Max interaktion, hvilket frigør Max til homodimerize og binde til DNA

gelmobilitetsændring assay viser virkningerne på Myc: Max DNA kompleksdannelse af det dimere inhibitor E07 + N12 (A) og den ikke-dimeriserbare kontrol kombination E07 + C12 (B). Båndene, der repræsenterer protein-DNA-kompleks eller nøgent DNA er vist på højre side af hvert panel. De angivne koncentrationer er i uM.

Som yderligere bevis på, at dannelsen af ​​den dimere inhibitor var kritisk for den inhiberende aktivitet, udførte vi lignende forsøg med ikke-dimeriserbare kontrol monomer C12 (fig. 4B) . I modsætning til E07 + N12, kombinationen af ​​E07 + C12 havde ingen virkning på bindingen af ​​Myc: Max eller Max: Max komplekser til DNA. Disse data er i overensstemmelse med virkningerne af disse forbindelser i SPR-analysen og ELISA.

Kollektivt disse cellefrie assay data viser, at de selvsamlende dimere inhibitorer identificeret i celleassays direkte kan binde til Myc og hæmme dens samspil med Max, støtte en mekanisme on target handling for disse inhibitorer. Endvidere er anvendelsen af ​​ikke-dimeriserbare kontrol monomerer bekræfter, at evnen til at danne en stor molekylvægt dimer inhibitor er nøglen til evnen til at målrette Myc-proteinet.

Selvsamling dimer er kritisk for cellulær aktivitet af Myc hæmmere

Vores cellefrie eksperimenter havde klart vist, at evnen til selv-samling af dimer var vigtigt at drive den forbedrede hæmmende effekt versus Myc protein. For at teste dette i et trådløst sammenhæng vi sammenlignet effekten på celle levedygtighed E08 + N11 dimer versus sin ikke-dimeriserbare kontrol kombination E08 + C11. Behandling af Daudi celler med E08 + N11 forårsagede en signifikant reduktion i cellelevedygtighed efter 72 timers behandling, mens E08 + C11 kombination havde ingen virkning på cellelevedygtighed (fig. 5A, venstre panel). Tidligere rapporter har indikeret, at behandling af celler med relativt høje koncentrationer ( 50 uM) af det lille molekyle Myc hæmmere 10058-F4 og 10078-G5 forårsage et fald i Myc protein niveauer [31, 35] og så vi brugt dette som en måle af virkningen af ​​de dimerer på Myc vej.