PLoS ONE: Gambogenic Acid Kills Lung Cancer Cells gennem Aberrant Autophagy

Abstrakte

Lungekræft er en af ​​de mest almindelige former for kræft og forårsager 1,38 millioner dødsfald om året, fra 2008 på verdensplan. Identifikation naturlige anti-lunge cancer er blevet meget vigtigt. Gambogenic syre (GNA) er en af ​​de aktive forbindelser ifølge Gamboge, en traditionel medicin, der blev anvendt som en drastisk afføringsmiddel, brækmiddel, eller vermifuge til behandling bændelorm. For nylig er stigende tegn angivet, at GNA udøver lovende antitumorvirkninger; dog den underliggende mekanisme er stadig uklar. I nærværende papir, fandt vi, at GNA kunne inducere dannelsen af ​​vakuoler, der var forbundet med autophagy i A549 og HeLa-celler. Yderligere undersøgelser afslørede, at GNA udløser initiering af autofagi baseret på resultaterne af MDC-farvning, AO-farvning, akkumulering af LC3 II, aktivering af Beclin 1 og phosphorylering af p70S6k. Men nedbrydning af P62 blev afbrudt og gratis GFP kunne ikke blive frigivet i GNA behandlede celler, der er angivet en blok i autofagi flux. Yderligere undersøgelser viste, at GNA blokerer fusion mellem autophagosomes og lysosomer ved at hæmme forsuring i lysosomer. Denne dysfunktionel autophagy spiller en pro-død rolle i GNA-behandlede celler ved at aktivere p53, Bax og spaltes caspase-3 mens faldende Bcl-2. Beclin 1 knockdown stærkt formindsket GNA-induceret celledød og virkningerne på p53, Bax, spaltet caspase-3 og Bcl-2. Lignende resultater blev opnået under anvendelse af en xenograft model. Vores resultater viser for første gang, at GNA kan forårsage afvigende autofagi at inducere celledød og kan foreslå den potentielle anvendelse af GNA som et redskab eller levedygtig lægemiddel i anticancer behandlingsformer

Henvisning:. Mei W, Dong C Hui C, Bin L, Fenggen Y, Jingjing S, et al. (2014) Gambogenic Acid Kills Lung Cancer Cells gennem Aberrant Autophagy. PLoS ONE 9 (1): e83604. doi: 10,1371 /journal.pone.0083604

Redaktør: Eric Asselin, University of Quebec på Trois-Rivieres, Canada

Modtaget: 18 juni 2013; Accepteret: 5. november 2013; Udgivet: 10. januar, 2014

Copyright: © 2014 Mei et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China, No. 81173600 (Q.-L. Li); National Natural Science Foundation of Anhui provinsen, Kina, No. 11040606M190 (Q.-L. Li) og Key Project i National Science Teknologi Pillar Program 2009ZX09103-399 (Q.-L. Li, Co-PI). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft har været en af ​​de mest almindelige typer af kræft i flere årtier og regnskaber for 15-20% af alle kræftrelaterede dødsfald globalt [1] – [2]. I 2008 blev en anslået 1,61 millioner nye tilfælde om året rapporteret på verdensplan. Lungekræft er en væsentlig dødsårsag i den udviklede verden og de mest almindelige cancer hos China [3]. Kirurgisk resektion er den primære metode til behandling af lungecancer. Imidlertid kemoterapi /strålebehandling er stadig den effektive behandling for patienter med fremskreden ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) eller småcellet lungecancer [4]. Følgelig er hidtil ukendte terapeutiske strategier og lægemidler presserende behov til behandling af lungecancer.

Autophagy er en fysiologisk selvstændig fordøjelsesprocessen som nedbryder cytoplasmatiske komponenter til at opretholde cellulær metabolisme under næringsberøvelse og /eller metabolisk stress. Under autophagy, makromolekyler, langlivede proteiner og beskadigede organeller (såsom det endoplasmatiske reticulum og mitokondrierne) er omgivet af autophagosomes. De autophagosomes derefter sammensmelte med lysosomer, hvor afsondret indhold undergår nedbrydning og genanvendelse af residente hydrolaser. Autophagy er vigtig i alle celler til fjernelse af langlivede proteiner eller beskadigede organeller. Denne evne får autofagi at være en lovende kandidat til en overlevelse mekanisme som reaktion på flere spændinger [5]. Imidlertid har flere nylige undersøgelser antydet, at autofagi fungerer også som en pro-død mekanisme forårsaget af anti-tumorterapi [6] – [9]. Faktisk er autophagic celledød betragtes som programmeret celledød type II, hvorimod apoptose er programmeret celledød type I [10]. Disse to typer af celledød er blevet beskrevet som distinkte former af celledød; imidlertid mange undersøgelser viser krydstale mellem de to typer. Fx p53, som er en potent inducer af apoptose, kan også fremkalde autofagi ved at øge ekspressionen af ​​

dram

, en direkte p53 målgen [11]. Beclin 1 /ATG 6 er en del af en Type III PI3 kinase kompleks, der er nødvendig for dannelsen af ​​de autophagic vesikler. Interferens med Beclin 1 kan forebygge fremkaldelse af autofagi. Forstyrrelse af samspillet mellem BH3 domæne Beclin 1 og Bcl-2 fører til øget autofagi [12] – [13].

Gambogenic syre (GNA, C38H46O8, MW 631,32) (figur 1A) er en af ​​de vigtigste aktive komponenter i Gamboge, en harpiks udsondres fra Garcinia hanburyi træ [14]. Gamboge er en traditionel medicin, der blev anvendt som en drastisk afføringsmiddel, brækmiddel, og vermifuge til behandling bændelorm. Gamboge har været anvendt i behandlingen af ​​cancer, herunder brystcancer, lungecancer, lymfe sarkom og carcinom cutaneum [15], på en klinik i Kina og har vist spændende virkninger [16]. For nylig er akkumulerende beviser vist, at den vigtigste aktive bestanddel GNA har et bredere spektrum af antitumorvirkninger og lavere toksicitet [17] – [19]. De molekylære og biokemiske virkninger af GNA omfatter induktion af apoptose i forskellige cancercellelinier og dyremodeller for carcinogenese [20] – [24]. Yu et al. har fundet, at GNA kan forårsage GSK3b-afhængig G1 standsning i lungecancerceller og foreslog, at GNA kan inducere celledød via autofagi snarere end apoptose [25]. Men de molekylære mekanismer bag virkningerne af GNA fortsat uklare. De nuværende undersøgelser viser den molekylære mekanisme og rolle autophagy i GNA-induceret tumor celledød.

A, Den kemiske struktur af GNA. B, GNA inhiberer vækst og inhiberer celledød i cancerceller. A549 og HeLa-celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af GNA for de angivne tidsperioder, og celleproliferation blev analyseret ved MTT-assayet. C, ubehandlede celler (kontrol) eller celler behandlet med 3 uM GNA i 24 timer var direkte observeret under et fasekontrastmikroskop (venstre) og celle vakuolisering blev kvantificeret (til højre); blev observeret mindst 600 celler. Betyder ± SEM, n = 3.

Materialer og metoder

Mus blev opretholdt i en SPF-frit miljø. Alle eksperimenter dyr blev godkendt af dyrevelfærd rådgivende udvalg Universitet for Videnskab og Teknologi i Kina (Permit Nummer: 2010-11). blev taget passende foranstaltninger til at minimere smerte og ubehag i overensstemmelse med gældende regler.

1. Reagenser og antistoffer

Gambogenic syre (GNA) (figur 1A), isoleret fra Gamboge, blev leveret af Prof. Xiaoshan Wang laboratorium. Den GNA renheden var 99%, hvilket blev bestemt ved HPLC-DAD. MTT, monodansylcadaverin (MDC), propidiumiodid (PI), Annexin V, acridinorange og Hoechst 33342 blev indkøbt fra Sigma. Rapamycin og trehalose var venlige gaver fra Prof. Guanghui Wang. MitoTracker Rød, LYSOTRACKER Rød og LysoSensor Green DND-189 blev opnået fra Invitrogen. LC3 antistoffer blev indkøbt fra Novus (NB100-2220), P62-antistoffer var fra Biomol (PW9860), p70S6k (1494-1), p-p70S6k (3204-1) og p-p38 (1229-1) antistoffer var fra Epitomics. GAPDH antistof blev købt fra CHEMICON (MAB374). GFP (sc-9996), caspase-3 (sc-7148), p53 (sc-6243), Bax (sc-7480), Beclin 1 (sc-11427), og Bcl-2 (sc-7382) antistoffer blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology. Reagenserne blev opløst i phosphatbufret saltvand (PBS), undtagen GNA og rapamycin, der blev fremstillet i DMSO.

2. Celledyrkning

Den menneskelige lunge adenocarcinom cellelinje A549 blev købt fra Cell Bank of Shanghai Institute of Cell Biology. Den humane epitelcarcinom cellelinie HeLa og etablerede GFP-LC3 /HeLa-celler blev leveret af Prof. Guanghui Wang [26]. Til etablering af en stabil cellelinie, der udtrykker EGFP-kondenseret LC3 blev Hela-celler transficeret med EGFP-LC3, og individuelle kloner stabilt udtrykker GFP-LC3 blev udvalgt under anvendelse af 0,2 mg /ml G418. En moderat ekspressionsklon resistente over for G418 blev udvalgt til yderligere forsøg. SPC-A-1, blev H460, GIC-82 og 16-HBE leveret af Prof. Guang-Biao Zhou [25]. Cellerne blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM) (Sigma) indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS) (Invitrogen), 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin ved 37 ° C under 5% CO

2.

3. Cellelevedygtighed Assay

MTT-assayet.

Celler blev udpladet i 96-brønds plader ved en densitet på 1 x 10

4-celler i 100 pi medium per brønd ved 24 timer før eksperiment. Derefter blev cellerne derefter inkuberet med forskellige koncentrationer af GNA ved 37 ° C i det indikerede tidsrum. MTT-opløsning blev tilsat til dyrkningsmediet (500 ug /ml slutkoncentration) ved 4 h før afslutningen af ​​behandlingen. Reaktionen blev standset ved tilsætning af 10% syrnede SDS (100 pi) til hver brønd. Absorbansværdien (A) ved 490 nm blev målt under anvendelse af en automatiseret mikropladelæser (Bio-Tek ELX 800uv, Bio-Tek Instrument Inc, Winooski, VT, USA). Cellernes levedygtighed blev udtrykt som (Asample – Ablank) /(aBetjeningspanel – Ablank) × 100%, hvor A er absorbansen. For cellerne behandlet med reagenser, blev vehikelbehandlede celler anvendes som kontrol. Råemnet repræsenterede MTT tilsat til mediet.

PI eller Annexin V /PI flowcytometri assay.

Celler blev behandlet med de angivne koncentrationer af GNA i 24 timer, høstet ved trypsinisering, derefter vasket to gange med PBS, inkuberet med PI alene eller sammen med annexin V-fluoresceinisothiocyanat i 10 min væk fra lys og evalueres ved hjælp af flowcytometri (Becton Dickinson, USA). Procentdelen af ​​døde celler blev bestemt på grundlag af plasma membranpermeabilitet til PI den.

Trypan blåfarvning assay.

Celler (2 × 10

5 celler per brønd) blev podet i 24 Tja fladbundede plader. Efter dyrkning i 24 timer blev 3 pM GNA tilsat til de angivne tidsperioder. Cellerne blev derefter frigjort fra substratet ved trypsinisering og farvet med Trypan blå opløsning (0,4% i PBS). Antallet af døde celler blev talt på et hæmocytometer under et lysmikroskop (Olympus, Japan). Mindst 400 celler blev talt for hver prøve, og eksperimentet blev gentaget tre gange.

4. Autophagic markør farvning

GFP-LC3 /HeLa-celler, der var blevet behandlet med 3 uM GNA for de angivne tidsperioder blev inkuberet med 10 pM monodansylcadaverin eller 75 nM LYSOTRACKER Red i 15 minutter. Efter vask to gange med PBS blev cellerne undersøgt ved fluorescensmikroskopi (Olympus, Japan).

5. Kvantificering af sure vesikulære organeller med acridinorange

Efter behandling med de angivne reagenser blev cellerne farvet med acridinorange ved en slutkoncentration på 1 ug /ml i 15 min væk fra lys og derefter observeret under et fluorescensmikroskop eller høstet ved trypsinisering og analyseret ved flowcytometri.

6. Transmissionselektronmikroskopi

Celler blev høstet ved trypsinisering og tumorvæv blev reseceret, derefter vasket to gange med PBS og fikseret med 2% paraformaldehyd /2% glutaraldehyd i 0,1 M phosphatpuffer (pH 7,4), efterfulgt af 1% OSO

4. Efter dehydrering, blev tynde snit farvet med uranylacetat og bly citrat til observation under et JEOL TEM-100SX (JEOL, Japan).

7. Immunoblotanalyse

Celler eller tumorvæv blev vasket i koldt phosphatbufret saltvand (PBS) ved 4 ° C, hvorefter proteiner blev fremstillet, separeret med 12% SDS-PAGE og overført til en polyvinylidendifluoridmembran (Millipore) . Membranen blev inkuberet i 1 time i PBS-Tween 20 (0,05%) indeholdende 5% fedtfri mælk. blev påvist primære antistoffer ved anvendelse fåre-anti-muse-IgG-HRP eller anti-kanin IgG-HRP sekundære antistoffer (Amersham Pharmacia Biotech). Proteinerne blev visualiseret ved anvendelse af et ECL påvisning (Amersham Pharmacia Biotech). Et anti-GAPDH-antistof (glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase, Chemicon). Blev anvendt til at sikre lige protein loading

For igen probe membranen med et andet primært antistof blev membranen først inkuberet med Stripping Buffer (50 mM Tris-HCI, pH 6,8, 0,1 mM β-mercaptoethanol, og 20 mM SDS) i 30 minutter ved 50 ° C, derefter underkastet Western blot-analyse efter standardprotokol.

8. RNA-interferens

Dobbelt oligonukleotider rettet mod 5′-CCACUCUGUGAGGAAUGCACAGAUA-3 ‘human Beclin 1 mRNA blev syntetiseret af Shanghai GenePharma (Shanghai, Kina), og en irrelevant oligonukleotid tjente som en negativ kontrol. Transfektionen blev udført ved anvendelse af lipofectamin 2000-reagens (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner. Kort fortalt blev siRNA og Lipofectamine 2000 (Invitrogen) blandet i Opti-MEM-medium (Invitrogen) og inkuberet i 30 minutter ved stuetemperatur for at tillade kompleksdannelse. Derefter blev cellerne vasket med Opti-MEM-medium (Invitrogen), og blandingen blev tilsat. Ved 12 timer efter transfektion blev dyrkningsmediet erstattet med frisk komplet medium. Cellerne blev høstet 72 timer efter transfektion og analyseres yderligere.

9. Xenograft musemodel

BALB /CA nøgne mus (30-40 dage gamle og vejer 18-20 g) blev inddelt i grupper, der indeholder seks mus per gruppe. A549-celler blev injiceret s.c. (2 × 10

6 celler per mus) ind i højre bagben af ​​musene. Efter at tumorerne blev fastsat (~ 50 mm

3), musene i.v. injiceret med eller uden 16 mg /kg GNA to gange om ugen i tre uger. 24 timer efter den sidste i.v. injektion blev tumorerne isoleret for transmissionselektronmikroskopi og western blotting-analyse.

10. Evaluering af pH i lysosomer

Efter behandling af A549-celler med 3 uM GNA for de angivne tidsperioder, blev cellerne inkuberet med 1 mM LysoSensor Green DND-189 i 15 min. Cellerne blev vasket to gange med PBS, derefter undersøgt ved fluorescens mikroskopi (Olympus, Japan).

Resultater

1. GNA inhiberer vækst og inducerer celledød i cancerceller

Virkningen af ​​GNA på cellevækst blev undersøgt under anvendelse af et MTT-assay i adskillige humane cancercellelinier. Vi undersøgte først virkningen af ​​GNA på cellelevedygtigheden af ​​A549 og HeLa-celler. Som vist i figur 1, GNA hæmmede vækst i A549 og HeLa-celler i en koncentrations- og tidsafhængig måde (Figur 1B). For at bekræfte virkningerne af GNA på lungecancerceller, blev MTT-assayet gentaget i flere andre lungekræft cellelinier (H460, SPA-C-1, Glc-82 og den normale bronchial epitelcelle linje 16-HBE). H460, SPA-C-1 og Glc-82 var alle følsomme over for GNA, mens 16-HBE var mindre følsom over for GNA (fig S1A). Disse resultater indikerer, at GNA effektivt kan dræbe lungecancerceller med lav toksicitet.

Interessant, når vi udførte en lys mikroskopi kinetik eksperiment, fandt vi, at GNA-behandlede celler viste en progressiv akkumulering af intracytoplasmiske vakuoler, som var identisk til dem ofte observeret i celler, der undergår autofagi (figur 1C). I mellemtiden var en øget procentdel af celler med store synlige vakuoler observeret i GNA-behandlede celler sammenlignet med kontrol-celler (Figur 1C), i overensstemmelse med en autofagi-relaterede mekanisme.

2. GNA øge autophagic markører i A549 og HeLa-celler

En række forsøg blev udført for at bestemme, om autofagi induceres af GNA. Først brugte vi monodansylcadaverin (MDC), en lysosomotropiske forbindelse kendt at mærke sure endosomer, lysosomer, og autophagosomes [27]. Som vist i figur 2A viste GNA-behandlede A549-celler en markant stigning i antallet af MDC-mærkede vesikler, hvilket viser, at GNA kunne inducere dannelsen af ​​sure vesikulære organeller (AVO), som er karakteristisk for autofagi. At kvantificere disse AVOS blev acridinorange vital farvning udført og analyseret ved FACS. Vi fandt, at acridinorange-positive AVOS steg i GNA-behandlede A549-celler i forhold til kontrolceller (figur 2B, 2C); rapamycin blev anvendt som en positiv kontrol.

A, Repræsentative billeder af MDC-farvning. A549-celler blev behandlet med 3 uM GNA i 24 timer og derefter farvet med 10 pM monodansylcadaverin (MDC) og observeret under et fasekontrastmikroskop. B og C, Acridin Orange farvning. Celler blev udsat for de angivne koncentrationer af GNA i 24 timer og derefter farvet med 1 pg /ml af acridinorange (B, C) og observeret under et fasekontrastmikroskop (B) eller analyseret ved flowcytometri (C). Celler, som blev behandlet med 50 ug /ml rapamycin blev anvendt som en positiv kontrol. De viste resultater er repræsentative for mindst 2 uafhængige forsøg. D, Repræsentative elektronmikroskopiske billeder af GNA-behandlede A549-celler. Cellerne blev behandlet med 3 uM GNA for de angivne tidsperioder og analyseret ved elektronmikroskopi. Pile angiver vakuolerne kontaktes med vesikler, der var tæt fyldt med multi-lamellare strukturer.

Tilstedeværelsen af ​​autophagosomes, som udviser dobbelt-membran vesikel strukturer, anses for at være kendetegnende for autofagi. Vi undersøgte, om denne struktur er dannet i GNA-behandlede A549-celler under et elektronmikroskop (EM). Som vist i figur 2D til, vises GNA-behandlede celler øget dannelse af autophagosomes forhold til kontrolceller.

3. GNA udløser dannelsen af ​​autophagic markører i A549 og HeLa-celler

For at bekræfte GNA-medieret induktion af autophagy, vi undersøgte udtryk for autophagy markører, herunder LC3. Under autophagy, er LC3 konverteret fra den frie form (LC3-1) til en proteolytisk bearbejdet mindre formen (LC3-II). GFP-LC3 /HeLa-celler, der stabilt udtrykker GFP-LC3, blev behandlet med de angivne koncentrationer af GNA i 24 timer; disse GNA-behandlede celler udviste en dramatisk stigning i punktformig fordeling af GFP-LC3 i en koncentrationsafhængig måde, medens ubehandlede celler viste en diffus GFP-LC3 udseende. Kvantificering indikerede, at antallet af celler, der indeholdt mindst 5 GFP-LC3 pointere prikker også steget i en koncentrationsafhængig måde (figur 3A). Western blotting-analyse af GNA-behandlede A549-celler viste en bemærkelsesværdig stigning i niveauet af LC3-II i et koncentrations- og tidsafhængig måde (figur 3B). Lignende resultater blev opnået i H460, SPA-C-1 og Glc-82 lungekræft cellelinier, mens den normale lunge-cellelinje 16-HBE var mindre følsom over for GNA (fig S1B).

A, Virkninger af GNA om fordelingen af ​​GFP-LC3 punctuates. GFP-LC3 /HeLa-celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af GNA eller 50 ug /ml rapamycin i 24 timer, derefter påvises ved fluorescensmikroskopi. Procentdelen af ​​celler med mindst 5 GFP-LC3 er spredt prikker blev beregnet; blev observeret mindst 600 celler, Midler ± SEM, n = 3, ** angiver p 0,01, envejs ANOVA. B, Virkninger af GNA på LC3 protein. A549-celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af GNA i 24 timer eller 3 uM GNA for de angivne tidsperioder, derefter analyseret ved Western blotting under anvendelse af anti-LC3 antistoffer. GAPDH protein blev anvendt som indlæsning kontrol. Søjlediagrammet viser båndintensiteter af LC3-II forhold til dem for GAPDH. Middelværdi ± SEM, n = 3, * betyder p 0,05, ** p 0,01, envejs ANOVA. C, Effekter af GNA på Beclin1 protein. A549-celler blev behandlet med 3 uM GNA for de angivne tidsperioder, derefter analyseret ved Western blotting under anvendelse af anti-Beclin1 antistoffer. GAPDH protein blev anvendt som indlæsning kontrol. Søjlediagrammet viser båndintensiteter af Beclin 1 forhold til dem for GAPDH. Middelværdi ± SEM, n = 3, * betyder p 0,05, ** p 0,01, envejs ANOVA. D, Virkninger af GNA på p70S6k fosforylering. A549-celler blev behandlet med 3 uM GNA for de angivne tidsperioder, derefter analyseret ved western blotting under anvendelse af anti-p70S6k og anti-p-p70S6k antistoffer. GAPDH protein blev anvendt som indlæsning kontrol. Søjlediagrammet viser båndintensiteter af p-p70S6k forhold til dem for GAPDH. Middelværdi ± SEM, n = 3, * betyder p 0,05, ** p 0,01, envejs ANOVA

Niveauerne af Beclin 1, et ATG genprodukt, der er afgørende for autophagy [. ,,,0],28], steg tydeligt over tid i GNA-behandlede A549-celler (figur 3C). Ser /thr kinase mTOR virker som en gatekeeper i autophagy proces, og reduceret mTOR aktivitet er blevet associeret med forhøjede niveauer af autofagi. P70S6k er et substrat af mTOR og dets phosphorylering er afhængig af mTOR aktivitet. Vi fandt, at p70S6k fosforylering klart faldt over tid efter GNA behandling (figur 3D), hvilket indikerer reduceret mTOR aktivitet. Tilsammen udgør disse resultater tyder på, at GNA udløser indledning af autophagic markører i A549 og HeLa-celler.

4. GNA hæmmer fusion mellem autophagosomes og autolysosomes

Da GNA udløste initiering af autophagic markører, spekulerede vi om GNA kunne udløse autophagic flux. For at løse dette spørgsmål har vi vurderet om sket ændringer i GFP-LC3, som også er blevet anvendt til at overvåge autophagic flux. Når GFP-LC3 leveres til en lysosom den LC3 delen af ​​kimæren er følsom over for nedbrydning, hvorimod GFP-proteinet er relativt resistent over for hydrolyse. Derfor måling af niveauerne af spaltet GFP ved western blotting kan overvåge strømmen af ​​autofagi. Som vist i figur 4A, niveauet af fri GFP ændret en smule på GNA behandling, mens GFP-LC3-II klart større over tid. Meget forskellige resultater blev observeret ved behandling med trehalose (a normal autophagy inducer), som blev anvendt som en positiv kontrol. Vi yderligere overvåget niveauet af endogent p62 /SQSTM1, en autofagi-lysosom substrat, der er forbundet med autofagi-lysosomal proteinnedbrydning. Ophobningen af ​​P62 anses for at være en markør for inhibering af autofagi eller afbrydelse af autophagic nedbrydning. GNA blokeret nedbrydningen af ​​P62 i en koncentrations- og tidsafhængig måde (Figur 4B), hvilket antyder, at GNA forringer autophagic nedbrydning. Lignende resultater blev opnået i H460, SPA-C-1 og Glc-82 lungekræft cellelinier, mens den normale lunge-cellelinje 16-HBE var mindre følsom over for GNA (fig S1B).

A, Virkning af GNA på fluxen af ​​autofagi. GFP-LC3 /HeLa-celler blev dyrket i fravær (kontrol) eller nærvær af 3 uM GNA for de angivne tidsperioder, og niveauet af spaltet GFP blev analyseret ved western blotting under anvendelse af et anti-GFP-antistof; 100 mM trehalose blev anvendt som en positiv kontrol. GAPDH protein blev anvendt som indlæsning kontrol. Søjlediagrammet viser bandets intensiteter af GFP-LC3-II eller spaltet GFP i forhold til de af GAPDH. Middelværdi ± SEM, n = 3, * betyder p 0,05, ** p 0,01, envejs ANOVA. B, dosis- og tidsafhængige virkninger af GNA på P62 nedbrydning. A549-celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af GNA i 24 timer eller 3 pM GNA for de angivne tidsperioder, og p62 proteinniveauer blev analyseret ved western blotting. GAPDH protein blev anvendt som indlæsning kontrol. Søjlediagrammet viser båndintensiteter af P62 forhold til dem for GAPDH. Middelværdi ± SEM, n = 3, ** p 0,01, envejs ANOVA. C, Hæmning af fusion mellem autophagosomes og lysosomer ved behandling med GNA. GFP-LC3 /Hela-celler blev behandlet med 3 uM GNA for de angivne tidsrum og efterfølgende farvet med 75 nM LYSOTRACKER Red (LTR) i 15 min. Repræsentative fluorescens mikroskopi billeder vises. D, Inhibering af lysosom forsuring efter behandling med GNA. A549-celler blev behandlet med 3 uM GNA for de angivne tidsrum eller 500 uM bafilomycin A1 i 8 timer og efterfølgende farvet med 1 mM LysoSensor Green DND-189 i 15 min. Repræsentative fluorescens mikroskopi billeder vises.

Tilsammen disse resultater tyder på, at GNA kan forstyrre nedbrydningen af ​​autophagy på et sent tidspunkt.

Vi næste spørgsmålstegn som proces er påvirket af GNA. Vi undersøgte virkningen af ​​GNA på colokalisering af autophagosomes og lysosomer. Som vist i figur 4C, mange små, intenst farvede GFP-LC3 dots (autophagosomes) og LYSOTRACKER Red (LTR) -stained prikker (lysosomer) blev colocalized inden for 6 timer efter GNA behandling. Imidlertid var dette colokalisering afbrudt efter 12 og 24 timer efter GNA behandling; de små, intenst farvede GPF-LC3 prikker syntes at akkumulere og blev store, intenst farvede regioner, som foreslået, at fusion mellem autophagosomes og lysosomer blev blokeret. Tidligere undersøgelser har vist, at nogle medikamenter, såsom CQ og bafilomycin A1, kan hæve pH lysosomer at inhibere fusion med autophagosomes. Vi spørgsmålstegn ved, om GNA har lignende virkninger. Vi vurderede effekten af ​​GNA på lysosom forsuring ved farvning med LysoSensor Green DND-189, et acidotropic fluorescerende probe, der kommer i klemme, sure organeller. Bafilomycin A1 blev anvendt som en positiv kontrol. Som vist i figur 4D, blev lysosom mærkning afbrudt inden for 12 timer efter GNA behandling og var meget mere indlysende påvirket efter 24 og 36 timer (svarende til virkningerne af bafilomycin A1), hvilket indikerer inhibering af lysosom forsuring. Denne observation kan forklare GNA-medieret hæmning af fusion mellem autophagosomes og lysosomer. Skønt GNA udløser dannelsen af ​​autophagosomes, GNA blokerer også progression af autophagic proces ved at undertrykke fusion mellem autophagosomes og lysosomer, og derved hæmmer nedbrydningen af ​​indholdet.

5. Den knockdown af Beclin 1 formindsker GNA-induceret kræft celledød

De tidligere data viser, at GNA kan inducere celledød via apoptose. For at bestemme om celledøden forårsaget af GNA korrelerer med dysfunktionelle autofagi, vi yderligere ansat lille interferens RNA (siRNA) at vælte ekspressionen af ​​Beclin 1, et essentielt gen for autofagi. Transfektion af RNA-oligonukleotider mod Beclin1 (Beclin 1 siRNA) i A549-celler med succes undertrykt proteinniveauet af endogent Beclin 1 sammenlignet med celler transficeret med kontrol siRNA, hvilket indikerer, at Beclin 1 siRNA er effektiv (figur 5A). Efter 24 eller 36 timers behandling med 3 uM GNA, Beclin 1 Knockdown celler udviste signifikant mindre celledød sammenlignet med kontrolceller (figur 5B), hvilket antyder, at GNA-induceret celledød er relateret med dysfunktionelle autofagi.

A, RNA-oligonukleotider mod Beclin 1 (Beclin 1 siRNA) effektivt undertrykke Beclin 1 ekspression. A549-celler blev transficeret med siRNA’er mod Beclin 1 eller negativ kontrol, og proteinniveauet af Beclin1 blev analyseret ved Western blotting. GAPDH protein blev anvendt som indlæsning kontrol. Søjlediagrammet viser båndintensiteter af Beclin1 forhold til dem for GAPDH. Middelværdi ± SEM, n = 3, ** p 0,01, envejs ANOVA. B, blev A549-celler transficeret med siRNA’er mod Beclin 1 eller negativ kontrol. Cellerne blev derefter behandlet med 3 uM GNA for de angivne tidsperioder, farvet med 2 pM Hoechst 33342 og observeret under et fluorescensmikroskop; procentdelen af ​​døde celler blev kvantificeret ved trypanblå-farvning. Middelværdi ± SEM, n = 3, * betyder p 0,05, ** p 0,01, envejs ANOVA

6.. GNA inducerer ændringer i niveauerne af apoptose-relaterede proteiner

Dernæst vi undersøgte vejen, som dysfunktionel autofagi celledød sker på GNA behandling. Stigende beviser har indikeret, at cross-talk mellem autofagi og apoptose især kompliceres af det faktum, at disse processer deler mange fælles regulatoriske molekyler, såsom p53 og Bd-2 familiemedlemmer [29] – [30]. GNA forårsagede en stigning i proteinniveauer i Bax og spaltes caspase-3 og et fald i niveauerne af Bcl-2 og LC3-II over tid, hvilket antyder, at GNA behandling aktiverer Bax. Fordi Bax er et af de mest fremtrædende downstream mål af p53, vurderede vi virkningen af ​​GNA på p53. Som vist i figur 6A, GNA forårsagede en bemærkelsesværdig stigning i niveauet af p53. Fordi p38 MAPK bidrager til aktiveringen af ​​p53, monitorerede vi også niveauerne af p38. GNA forårsagede en bemærkelsesværdig stigning i niveauet af phosphoryleret p38 (figur 6A). Endvidere flowcytometri-analyse under anvendelse annexin V /propidiumiodid-farvning indikerede, at GNA behandling klart øget den del af døde celler og sene apoptotiske celler sammenlignet med NC. Konkluderer vi således at GNA kan inducere apoptose i A549-celler i det mindste delvist gennem denne vej.

A, A549-celler blev transficeret med siRNA’er mod Beclin 1 eller negativ kontrol. Cellerne blev derefter behandlet med 3 uM GNA for de angivne tidsperioder. Den relative proteinniveau blev analyseret ved Western blotting. GAPDH protein blev anvendt som indlæsning kontrol. Søjlediagrammet viser båndintensiteter af angivne protein forhold til dem for GAPDH. Middelværdi ± SEM, n = 3, * betyder p 0,05, ** p 0,01, envejs ANOVA. B, blev A549-celler transficeret med siRNA’er mod Beclin 1 eller negativ kontrol. Cellerne blev derefter behandlet med 3 uM GNA for de angivne tidsperioder, og cellerne blev farvet med annexin V /propidiumiodid og underkastet flowcytometrianalyse. Procentdelen i øverste venstre kvadrant viser andelen af ​​celler mærket med propidiumiodid (døde celler), mens andelen i øverste højre kvadrant indikerer populationen af ​​celler mærket med både annexin V og propidiumiodid (sene apoptotiske og døde celler).

7. GNA hæmmer autophagy in vivo

GNA har vist effekt i tumorer vokser i nøgne mus. Vores laboratorium har tidligere vist, at de relative tumorvolumener (RTV) i mus behandlet med 16 og 32 mg /kg GNA var 12,16 ± 7,39 og 7,65 ± 2,84, hvorimod den RTV i bærerbehandlede negative kontroller var 26,36 ± 14,10; de relative tumor vækst nøgletal (T /C,%) var 46,1% og 29,0%. For at bestemme den mekanisme, som GNA svækker tumorvækst

in vivo

, vi etableret en xenograft mus lunge tumor model. Som vist i figur 7, GNA inducerede akkumulering af autophagic vesikler (figur 7A), steg niveauerne af LC3-II (figur 7B) og blokeret p62 nedbrydning (figur 7B) i tumorer. Disse resultater tyder stærkt på, at den mekanisme, hvormed GNA handlinger

in vivo

også autofagi-relateret.

A549 celler blev injiceret subkutant (2 × 10

6 /mus) i 30-40 dage gamle BALB /CA mandlige nøgne mus. Efter etablerede tumorer havde dannet (~ 50 mm

3), musene i.v. injiceret med eller uden 16 mg /kg GNA to gange om ugen i tre uger.