PLoS ONE: Udledning af en Triple Mosaic Adenovirus for Cancer Gene Therapy

Abstrakt

En sikker og effektiv kræftmedicin er nødvendig på grund af den stigende befolkning af cancerpatienter, hvis særlige sygdomme kan ikke helbredes af den aktuelt tilgængelige behandling . Adenovirale (AD) vektorer repræsenterer en lovende terapeutisk medicin til human cancerterapi. Imidlertid behov for flere forbedringer, for Ad-vektorer at være effektive cancerlægemidler, som omfatter, men er ikke begrænset til, forbedring af cellulær optagelse, forstærket cancercelledrab aktivitet, og evnen af ​​vektor visualisering og sporing når injiceret i patienter . Til dette formål har vi forsøgt at udvikle en annonce som et multifunktionelt platform inkorporerer målretning, billedbehandling, og terapeutiske motiver. I denne undersøgelse har vi undersøgt anvendeligheden af ​​denne foreslåede platform ved at generere en Ad-vektor indeholdende det poly-lysin (pK), herpes simplex virus type 1 (HSV-1) thymidinkinase (TK), og den monomere rødt fluorescerende protein ( mRFP1) som målretning, tumor celle drab, og billedbehandling motiver, hhv. Vores undersøgelse heri demonstrerer dannelsen af ​​den tredobbelte mosaik Ad vektor med pK, HSV-1 TK, og mRFP1 ved carboxyl termini af Ad mindre capsidprotein IX (pIX). Desuden blev funktionaliteter pK, HSV-1 TK, og mRFP1 proteiner på Ad-vektoren bevares som bekræftet ved tilsvarende funktionelle assays, hvilket indikerer potentialet multifunktionelle anvendelse af denne nye Ad vektor til cancer genterapi. Valideringen af ​​de tredobbelte mosaik Ad-vektorer også argumenterer for evnen af ​​pIX modifikation som en base for udvikling af multifunktionelle Ad vektorer

Henvisning:. Tang Y, Wu H, Ugai H, Matthews QL, Curiel DT ( 2009) Udledning af et Triple Mosaic Adenovirus for Cancer Gene Therapy. PLoS ONE 4 (12): e8526. doi: 10,1371 /journal.pone.0008526

Redaktør: Maciej Lesniak, The University of Chicago, USA

Modtaget: Oktober 4, 2009; Accepteret: December 7, 2009; Udgivet: December 31, 2009

Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Public Domain erklæring hvori det hedder, at når det først er i det offentlige rum, dette arbejde kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af NIH tilskud 5R01CA111569 (Dr. DT Curiel) og Juvenile Diabetes Research Foundation tilskud 1-2005-71 (Dr. H. Wu). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kræft er fortsat den næststørste dødsårsag på verdensplan, og tegnede sig for ca. 7,9 mio dødsfald (13% af alle dødsfald) i 2007 ifølge Verdenssundhedsorganisationen (WHO, “top 10 dødsårsager”) . Genterapi er en ny paradigme i behandlingen af ​​humane sygdomme ved insertion af genetisk materiale ind i den enkeltes celler til terapeutiske [1] formål. Blandt alle metoder til kræftbehandling, genterapi repræsenterer en roman molekylær foranstaltning, der har potentiale til at anti-tumor effekt med selektivitet og sikkerhed [2].

Til dato, 65,2% af alle genterapi kliniske forsøg har målrettet cancer [3]. Blandt en række cancergenterapi strategier imidlertid meget få af dem har vist en potent terapeutisk virkning i humane patienter. Ud over den kompleksitet og flertydighed af tumorigenese, andre hindringer, der kan forklare den manglende af mange cancer genterapianvendelser omfatter den lave transduktionseffektivitet af anticancermidler og den manglende evne til at transducere hele tumorcellepopulation; den ringe selektivitet og mangel på langsigtet varighed på anticancer-midler i tumorer, der medfører dårlig terapeutisk effektivitet samt sikkerhedsspørgsmål. Begrebet tumorcelle målretning adresser disse hindringer og kan repræsentere en væsentlig forbedring i udviklingen af ​​genterapi som et anti-cancer terapeutisk. Givet effektiv målretning kan denne anticancermiddel ikke blot opnå meget selektive og specifikke tumorcelle-drab, men også undgå optagelse af normale celler og efterfølgende toksicitet. En

in vivo

imaging modalitet, som giver en mulighed for at studere distribution (f.eks ophobning, spredning, fastholdelse og etc.) af anticancer-midler, kan tage fat på centrale spørgsmål, som er grundlæggende for design og test af nye anti-cancer behandlinger, især for replikative virus-baserede terapi [4] – [7]. At kombinere disse funktionaliteter, og i et forsøg på at skabe mere potente og pålidelige kræftlægemidler, vi har forsøgt at skabe et multifunktionelt adenoviral (Ad) vektor til påvisning og behandling af cancer. Denne Ad inkorporerer målretning, billedbehandling og cancer terapeutiske modaliteter.

Ad er et af de mest almindeligt anvendte virale vektorer i talrige cancer genterapi kliniske forsøg [3]. I disse undersøgelser, har anvendelsen af ​​første eller anden generation af adenovirusvektorer demonstreret terapeutisk transgen udtryk, men den overordnede kliniske effekt har været dårlig på grund af de ovennævnte begrænsninger. For at overvinde de begrænsninger, har været fokuseret mange bestræbelser på at ændre Ad capsid på individuel kræftform basis. For eksempel ændring af Ad capsidet med at målrette ligander rettet mod tumorantigener boostet Ad transduktion i tumorceller

in vitro

in vivo

[8], [9]. Andre indsats med sigte på Ad visualisering og sporing resulterede i mærkning Ad capsid med bioluminescens eller fluorescens. Denne strategi tilladt for dynamisk og direkte overvågning af den fysiske placering og replikation af virale partikler

in vivo

[4], [10], [11]. Endvidere inkorporeringen af ​​herpes simplex virus type 1 (HSV-1) thymidinkinase (TK) på Ad capsid overflade tilladt for direkte funktionel anvendelse af dette protein i selvmord genterapi og microPET imaging [12].

Vores laboratorium og andre har valideret den imødekommende rolle Ad type 5 mindre capsidprotein IX (pIX) for at indarbejde og funktionelle visning af heterologe polypeptider og proteiner, såsom poly-lysin (pK) [13], grønne og røde fluorescens proteiner (GFP og RFP) [4], [10], [11], eller HSV-1 TK [12], [14]. Vi har yderligere demonstreret muligheden for at skabe en tredobbelt mosaik annonce ved at præsentere tre forskellige heterologe epitoper på PIX locales på en enkelt annonce vektor anvende genetiske eller ikke-genetiske modifikationer [15]. I denne undersøgelse har vi undersøgt pIX at vise tre funktionelle epitoper – pK (til målretning), monomere RFP (mRFP1) (til billeddannelse), og HSV-1 TK (til terapeutisk) på en enkelt Ad-vektor i vores bestræbelser at generere multifunktionelle Ad vektorer.

Materialer og metoder

Antistoffer

pIX-specifikt antistof var en slags gave fra Dr. I. Dmitriev (Gene Therapy center, University of Alabama i Birmingham) . Kanin polyklonale anti-TK antistoffet var en slags gave fra Dr. J. M. Mathis (Gene Therapy Program, Institut for Cellulær biologi og anatomi, LSU Health Sciences). Den muse-anti-His

6 monoklonalt antistof blev købt hos Qiagen (Valencia, CA.). Ged polyklonalt anti-His

6-antistof blev købt hos Abcam (Cambridge, MA.). Anti-Flag M2 monoklonale antistof og kanin-polyklonalt anti-c-myc-antistof blev indkøbt fra Sigma (St. Louis, MO.). Kanin polyklonalt anti-RFP-antistof blev købt hos Chemicon (Temecula, CA.). Peberrodsperoxidase (HRP) -konjugeret gede anti-mus og gede-anti-kanin-sekundære antistoffer, alkalisk phosphatase (AP) -konjugeret gede-anti-muse, gede-anti-kanin sekundære antistoffer, og elektronmikroskopi (EM) grad 18 nm kolloidt guld konjugeret æsel-anti-gede-antistof blev købt hos Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. (West Grove, PA.). EM klasse 10 nm guld-konjugeret æsel anti-mus, og EM klasse 25 nm guld-konjugeret æsel anti-kanin sekundære antistoffer blev købt fra Electron Microscopy Science (EMS, Ft. Washington, PA.).

Celler

De humane embryoniske nyreceller (293), humane lunge carcinomceller (A549) og humane brystcancerceller (AU-565) blev indkøbt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA.). Alle cellelinjer blev holdt ved 37 ° C i en CO 5%

2 befugtet inkubator. AU-565 celler blev dyrket i RPMI-1640 (2 mM L-glutamin, 10 mM HEPES, 1 mM natriumpyruvat, 4,5 g /l glucose, 1,5 g /l natriumbicarbonat, 100 enheder /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin, 10% kalvefosterserum). Alle andre cellelinjer blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagle-medium-Hams F12 (50/50) medium (Sigma) indeholdende 10% føtalt kalveserum (HighClone, Logan, Utah), 2 mM L-glutamin, 100 enheder /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin.

Konstruktion af rekombinante plasmider

Generering af shuttle plasmider. Alle forældre plasmider blev erhvervet fra kommercielle kilder eller er blevet karakteriseret tidligere: pShlpIXNhe [13], pShuttle-IX-mRFP1 [4], pShuttle-IX-flag-sr39tk [12], pShuttle-CMV og pAdEasy-1 (Stratagene, La Jolla, CA). Shuttle plasmider blev konstrueret ved hjælp af begrænsning og PCR kloning som følgende. pShldpIX = pShlpIXNhe /Bglll /Nhel /stumpe /SL (selv- ligering); PCR-produktet (pcrIXpK) indeholdende den kodende sekvens for pIX-pK-fusionsproteinet blev genereret ved anvendelse af pShlpIXNhe som en skabelon og primerne 5′-GGGGTACCGGGCGTGGTTAAGGGTG og 5′-GGGGTACCTTTATTTATGTTCTTGTCATCGTCATCCTTATAATC; pShlpIXflagpK = pShldpIX /Kpnl + pcrIXpK /KpnI. PCR-produktet (pcrH6TK) indeholdende den kodende sekvens for H6-sr39tk protein blev dannet ved hjælp pShuttle-IX-flag-sr39tk som en skabelon og primerne 5′-CTAGCTAGCCACCATCACCATCACCAT CTAGCCGGATCCGGTTC og 5′-CTAGCTAGCTCAATTAGCCTCCCCCATC; pShlpIXH6TK = pShlpIXNhe /NheI + pcrH6TK /NheI. PCR-produktet (pcrMycmRFP1) indeholdende den kodende sekvens af c-myc-mRFP1 protein blev dannet ved hjælp pShuttle-IX-mRFP1 som en skabelon og primere 5′- CTAGCTAGCGGCGG AGGGAGCGAGCAGAAACTCATCTCTGAAGAAGATCTGGGAAGCGCCTCCTCCGAGGACGTCAT og 5’CTAGCTAGCTTAGGCGCCGGTGGAGTG; pShlpIXmycmRFP1 = pShlpIXNhe /NheI + pcrMycmRFP1 /NheI. Alle kloner blev verificeret ved restriktionsspaltning og sekventering.

Frembringelse af pIX-modificerede adenovirale genomer ved homolog rekombination i

Escherichia coli

[16]. Shuttlevektorerne pShlpIXflagpK, pShlpIXH6TK, og pShlpIXmycmRFP1 blev lineariseret med Pmel restriktionsenzym og homologt rekombineret med pAdEasy-1 i elektrokompetente BJ5183-AD1 (Stratagene, La Jolla, CA). Den genererede adenovirale genom indeholder IX-pK, IX-sr39tk eller IX-mRFP1 modificeret pIX-gen i deleteret E1-området. Konstruktionerne af resulterende annonce plasmider pAdpIXflagpK, pAdpIXH6TK, og pAdpIXmycmRFP1 blev bekræftet ved restriktion fordøjelse og sekventering.

Virus Rescue, Formering og oprensning

pAdpIXflagpK, pAdpIXH6TK og pAdpIXmycmRFP1 plasmider blev lineariseret med Pacl restriktionsenzym og transficeret ind i 293-celler dyrket i 25-cm

2 kolber anvendelse af Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Cellerne blev opsamlet ved iagttoges tydelig cytopatisk effekt (CPE) efterfulgt af afbrydelse med fire fryse og tø-cykler. Lysaterne blev centrifugeret ved 3000 x g i 5 min ved 4 ° C til fjernelse cellerester. De frigivne virus i supernatanten blev efterfølgende anvendt til yderligere formering, indtil en tilstrækkelig mængde af 293-celler blev inficeret (ti 175-cm

2 kolber). Ad i inficerede celler blev oprenset i det væsentlige som tidligere [15] beskrevne. Kort fortalt blev cellerne lyseret ved fire fryse og tø-cykler og centrifugeret ved 3.800 x g i 30 minutter ved 4 ° C til fjernelse cellerester. Celleekstrakterne indeholdende vira blev fyldt på toppen af ​​en 1,33 /1,45 CsCI-tringradient og centrifugeret ved 55.000 x g i 3 timer ved 4 ° C. Det nederste bånd, indeholdende infektiøse viruspartikler, blev re-centrifugeret på en anden 1,33 /1,45 CsCI-tringradient ved 100.000 x g natten over ved 4 ° C. Den resulterende bånd af adenovira blev opsamlet og dialyseret fire gange mod 500 ml phosphatbufret saltvand (PBS) indeholdende 10% glycerol, 2 timer hver gang. De genererede annoncer blev betegnet som Ad-IX-flag-pK, Ad-IX-H6-sr39tk, og Ad-IX-myc-mRFP1. Viral partikel (VP) titre blev bestemt ved spektrofotometri ved OD260 under anvendelse af standard procedurer [17].

Generation of Triple pIX-Modified Ad af Co-infektion

Ten 175 cm

2 kolber med 293 celler blev inficeret med ad-IX-flag-pK, ad-IX-H6-sr39tk, og ad-IX-myc-mRFP1 til en samlet MOI på 200-300 VP /celle. De inficerede celler blev indsamlet til Ad rensning som beskrevet ovenfor.

Protein Elektroforese og vestlige Blotting

5 × 10

9 VP af oprensede vira blev kogt i Laemmli prøve buffer i 5 min og separeret på 4.-15% gradient natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE). Separerede proteiner blev derefter overført til polyvinylidendifluorid (PVDF) membraner, som blev blokeret i 5% skummetmælk i Tris-bufret saltvand indeholdende 0,05% Tween-20 (TBS-T), efterfulgt af inkubation med primære antistoffer (muse-anti-Flag, 1 :1000; kanin anti-TK, 1:500; kanin anti-RFP, 1:500). Efter vask og re-blokering blev membranen inkuberet med de passende sekundære antistoffer konjugeret til peberrodsperoxidase (HRP) ved 1:1000 fortynding. HRP-signalet blev udviklet med ECL plus Western blotting påvisning systemet (GE Healthcare, Little Chalfont, UK), og derefter opdaget med BioMax MR videnskabelig billeddannende film (Kodak, Chalon-sur-Saone, Frankrig) og en medicinsk film processor SRX-101A (Konica, Tokyo, Japan).

ELISA

Fast-fase bindende enzymmaerket assays (ELISA) blev udført i det væsentlige som tidligere [18] beskrevet. Kort fortalt 10

9 VP af vira blev underkastet seriefortynding (1, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128) i 100 pi 100 mM carbonatpuffer (pH 9,5), og immobiliseres i tre eksemplarer på en 96-brønds plade (Nunc Maxisorp) ved inkubation natten over ved 4 ° C. Efter 4 vaske med TBS-T og blokering med TBS-T indeholdende 2% bovint serumalbumin (BSA), blev viraene probet med primært antistof, og derefter AP-konjugerede sekundære antistoffer i TBS-T indeholdende 0,5% BSA ved stuetemperatur i 2 timer, med omfattende vaske og blokerer i mellem.

s

nitrophenylphosphat (Sigma) blev anvendt til farveudvikling som beskrevet af producenten, og lys absorbans (405 nm) blev opnået ved en mikropladelæser (PowerWave HT 340, BioTek, Winooski, VT). Efter inkubation i 150 min ved stuetemperatur.

immunoelektronmikroskopi

immunoelektronmikroskopi blev udført i det væsentlige som beskrevet tidligere [15]. Kort fortalt blev vira klæbet til 400-mesh nikkel net understøttes med kulovertrukket Formvar film (EMS). Efter vask med 1% BSA /PBS to gange i 10 min hver, gitre blev probet med 1% BSA /PBS fortyndet primære antistoffer (1:200 M2 anti-FLAG, gede-anti-His

6, og kanin-anti-c- myc) og inkuberet ved stuetemperatur i 1 time. Efter 2 cykler af 1% BSA /PBS-vaske gitre blev inkuberet med 1:10 fortyndet sekundære antistoffer (10 nm guld-æsel-anti-muse, 18 nm guld-æsel-anti-ged, og 25 nm guld-æsel-anti-kanin) ved stuetemperatur i 45 minutter. Efter fiksering med 1% glutaraldehyd /PBS i 20 min, gitre blev underkastet negativ farvning i 2% uranylacetat i 12 sekunder og undersøgt under transmission elektron mikroskop ved 60 kV i UAB High Resolution Imaging faciliteten.

Cell binding inhiberingsassay

bindingsinhibering assay blev udført i det væsentlige som tidligere [13] beskrevne. AU-565-celler blev frigjort fra kolberne ved hjælp Versene, vasket en gang med PBS, og pelleteret og resuspenderet til 0,5 x 10

7 celler /ml i bindingsbuffer (DMEM /F12 med 1% BSA). 100 pi cell portioner blev overført til hver 5 ml reagensglas, og blev tilsat 50 pi af en inhibitor (opløselig CAR (ar), heparin, eller PBS). Efter 30 min rystning ved 4 ° C blev virus ved en infektionsmultiplicitet (MOI) på 500 VP /celle i 50 pi bindingspuffer tilsat til hvert rør, og de blev rystet ved 4 ° C i 1,5 timer. Cellerne blev vasket en gang med 4 ml bindingsbuffer, og deres samlede DNA blev ekstraheret og underkastet kvantitativ real-time PCR (TaqMan) til at måle Ad5 E4 kopital. Totalt DNA i hver prøve blev kvantificeret ved OD260.

Cell Killing Assav

celledræbende assay blev udført i det væsentlige som beskrevet tidligere [12]. De lungecarcinoma A549-celler blev podet på en plade med 96 brønde med en tæthed på 10.000 celler /brønd en dag før Ad infektion. Ad-vektorer, der bærer pIX-TK-fusionsproteiner ved forskellige MOI blev derefter anvendt til at inficere A549-celler. Efter 2 timer eller 12 timers inkubation prodruget, ganciclovir (GCV) (GYTOVENE-IV, Roche Laboratories, Nutley, NJ), blev tilsat til cellerne i en slutkoncentration på 1 mM. Efter 24 eller 48 timers inkubation blev levedygtigheden af ​​A549-celler vurderet ved anvendelse CellTiter 96® AQ

ueous ikke-radioaktivt celleproliferationsassay (Promega, Madison, WI) og en mikropladelæser (PowerWave HT 340, BioTek, Winooski , VT) i overensstemmelse med de Fabrikker ‘instruktion.

Statistisk analyse

Statistisk analyse blev udført ved hjælp af to-tailed uparrede Student s

t

-tests mellem grupper.

P

værdier. 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Generering af en Triple pIX-Modified Ad af Co-infektion

For at generere den tredobbelte pIX-modificerede Ad bærer poly-lysin (pK), HSV-1-thymidinkinase mutant (HSV-1 sr39tk), og monomert rødt fluorescerende protein (mRFP1) ved co-infektion, blev tre parentale vira genereret først: Ad- IX-Flag-pK, Ad-IX-H6-TK, og Ad-IX-myc-mRFP1. Disse tre vira udtrykker pIX-pK, pIX-TK, eller pIX-mRFP1 fusionsprotein med Flag, His

6, eller c-myc tag, (fig. 1A). Medmindre andet er angivet, alle vira, der anvendes i undersøgelsen er replikations-inkompetent (E1 /E3-deleteret), og transkriptionen af ​​modificerede pIX gener i hver parental virus blev drevet af den endogene pIX-promotoren. Desuden pIX-modificerede annoncer kun udtrykke pIX fusionsproteinet da de native pIX gener er blevet erstattet med de modificerede pIX-generne. De tre parentale vira blev anvendt til at co-inficere 293-celler, der understøtter ad replikation til at generere den tredobbelte pIX-modificerede virus. Da de tre forskellige pIX fusionsproteiner blev alle udtrykt og kunne samles til hver viral partikel de resulterende virioner forventes at indeholde en blanding af tre typer af pIX-fusionsproteiner (fig. 1b). De genererede og CsCI-oprensede Ad afkom (udpeget som coAdpIXPTM # 1) havde en normal udbytte i forhold til enkelte pIX-modificerede Annoncer i vores laboratorium (data ikke vist). Inkorporeringen af ​​pIX-fusionsproteiner blev analyseret ved Western blotting med anti-Flag, anti-RFP, og anti-TK-antistoffer. Påvisningen af ​​pIX fusion proteinbånd med forventede molekylmasser bekræftede, at tre pIX-fusionsproteiner (dvs. pIX-PK, pIX-TK, og pIX-mRFP1) var indeholdt i de virale partikler af oprenset viral pool (Fig. 1C).

(A) konstruktioner af modificerede pIX gener i genomer af tre forældre virus: Ad-IX-Flag-pK, Ad-IX-H6-TK, og Ad-IX-myc-mRFP1. Modificerede pIX gener (tagged med Flag, Hans

6, og c-myc, henholdsvis), blev drevet af native pIX promotor. (B) Strukturel diagram af triple pIX-modificerede Ad (coAdpIXPTM # 1), der genereres ved co-infektion strategi. pK, TK og mRFP1 peptider /proteiner blev indarbejdet i C terminalerne af pIX. (C) Western blotting-analyse af Ad vektor indeholdende tredobbelte pIX modifikationer. 5 × 10

9 VPS af CsCI-oprenset kontrol Ad5 (bane 1) og tredobbelt pIX-modificeret coAdpIXPTM # 1 (bane 2) blev underkastet SDS-PAGE. De separerede proteiner blev farvet med Gelcode Blå (Pierce, Rockford, IL.) For at detektere de samlede virale proteiner (venstre panel) eller probet med anti-Flag, anti-RFP, eller anti-TK-antistof (højre panel).

Surface Visning af modificerede pixs i Ad Partikler

for at teste, om de polypeptider /proteiner indarbejdet i C-terminalen af ​​pIX blev præsenteret på den virale overflade og tilgængelige for antistoffer, vi udførte enzymkoblede immunadsorptionsteknikker (ELISA’er). I ELISA eksperimentet, anti-FLAG, anti-His

6, og anti-c-myc antistoffer blev anvendt til at detektere de tre typer modificerede pixs. Styringen Ad5 indeholder vildtype pIX blev ikke genkendt af nogen af ​​disse antistoffer. De coAdpIXPTM # 1 virus blev anerkendt af anti-Flag, og anti-c-myc antistoffer (fig. 2). Imidlertid kunne virus ikke blive genkendt af enten anti-His

6-antistof (fig. 2) eller anti-TK-antistof (data ikke vist). Dette resultat tyder på, at pK og mRFP1 blev indarbejdet i triple pIX-modificerede Ad-vektorer. Den ubetydelige binding af anti-His

6 eller anti-TK-antistof på virus indikerer, at TK var enten ikke effektivt overfladeeksponerede på de virale capsider eller tilgængeligheden af ​​disse to antistoffer til TK-proteiner i en sådan konfiguration var utilstrækkelig til at være påvist i ELISA.

ELISA-analyse af Ad vektor, der indeholder tredobbelt pIX modifikationer. 10

9 VPS af CsCI-oprenset Ad5 (negativ kontrol) eller coAdpIXPTM # 1 blev udsat for en seriel fortynding (1, 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1 /64, 1/128) og immobiliseret på en ELISA-plade. Viraene blev probet med anti-Flag (1:2000), anti-His

6 (1:1000), og anti-c-myc antistoffer (1:1000), efterfulgt af inkubation med alkalisk phosphatase-konjugeret sekundære antistoffer (1:1000). Efter farveudvikling blev lysabsorbans målt og afbildet på Y-aksen mod de virale koncentrationer. Hvert punkt repræsenterer middelværdien og standardafvigelsen (SD) af tredobbelte bestemmelser. Nogle fejlsøjler stående for SD er mindre end deres symboler.

mosaicisme af Triple pIX-Modified Ad

Western blotting og ELISA-analyse af de rensede virale partikler viste, at tre typer pIX fusionsproteiner blev indarbejdet i Ad partikler produceret ved co-infektion (fig. 1). For at undersøge, om en enkelt Ad viruspartikel kunne vise alle tre typer af funktionelle proteiner, udførte vi immunoguld elektronmikroskopi til direkte visualisere pIX-modificerede Ad-partikler. Anti-Flag, anti-His

6 og anti-c-myc antistoffer blev anvendt til påvisning af pIX-pK, pIX-TK og pIX-mRFP1 proteiner i de virale partikler henholdsvis, efterfulgt af tre tilsvarende sekundære antistoffer konjugeret med 10 , 18, og 25 nm guldpartikler hhv. Som vist i figur 3, blev ingen guldpartikler bundet til kontrol Ad5 viser vildtype pIX, medens Ad viruspartikler indeholdende en enkelt pIX fusionsprotein (Ad-IX-Flag-pK, Ad-IX-H6-TK, og Ad -IX-myc-mRFP1) blev farvet ved tilsvarende guldpartikler. De tredobbelte modificerede coAdpIXPTM # 1 virus blev anerkendt af anti-Flag, anti-His

6 og anti-c-myc antistoffer og mærket med 10, 18 og 25 nm guldpartikler. Resultaterne viste, at tre typer pIX-fusionsproteiner kunne sameksistere på en enkelt viruspartikel og blev eksponeret på den virale overflade.

Kontrol eller pIX-modificerede Ad-vektorer blev påsat EM gitre, probet med guld nanopartikel konjugerede antistoffer og observeret under elektronmikroskop ved 60 KV. Muse anti-Flag, gede-anti-His

6, og kanin-anti-c-myc primære antistoffer blev anvendt til påvisning af tre typer tags på pK, HSV-1 TK, og mRFP1 hhv. 10 nm guld-æsel anti-mus, 18 nm guld-æsel-anti-ged, og 25 nm guld-æsel anti-kanin sekundære antistoffer blev anvendt til efterfølgende guld mærkning af Ad-partikler. Faste tynde pile angiver 10 nm guldpartikler, tomme pile angiver 18 nm guldpartikler og faste tykke pile angiver 25 nm guldpartikler. Skalaen bar i hvert panel repræsenterer 50 nm i længden.

Det er bemærkelsesværdigt, at selv om der er 240 eksemplarer af pIX molekyler i hver virale partikel, blev kun nogle få guld partikel-konjugerede antistoffer bundet på PIX-modificerede Ad viruspartikler. Disse data var i overensstemmelse med tidligere rapporter [15], [19], [20]. Dette skyldes sandsynligvis den relativt lave tilgængelighed af pIX fra capsid overflade [20] – [22] og rumlig hindring effekt af antistof-konjugeret guldpartikler mod hinanden under farvning. Vi valgte store guldpartikler for lettere kunne skelnes mellem tre epitoper, som har selv en højere antistof /guld-forhold og en højere rumlig hindring virkning end den for små guldpartikler som er almindeligt anvendt. Desuden anti-His

6 antistoffet ikke effektivt binder pIX-TK, som vist i figur 2. Endvidere kan den lave effektivitet af triple farvning være en anden grund af den spredte farvningsmønster vist i figur 3. Det er derfor ikke overraskende, at frekvensen af ​​tredobbelt-mærkede annoncer er lav -. kun omkring 1% viruspartikler blev farvet med alle tre typer af guldpartikler (tabel 1)

Målretning Aktivitet af Incorporated Poly-lysin på Triple pIX Mosaic Ad

Ad5 er blevet påvist at binde dets primære cellulære receptor, Coxsackie B virus og adenovirus receptor (CAR), som det indledende trin af infektion via sin fiber knop protein [23]. Poly-lysin (pK) inkorporeret i pIX locales i AdLucIXpK er blevet vist at mediere Ad interaktion med cellulære heparansulfatproteoglycaner (HSPGs), hvilket resulterer i CAR-uafhængig virus-celle-binding og transduktion [13]. Derfor, for at undersøge, om de pK peptider indarbejdet i den tredobbelte pIX mosaik Ad vektor havde lignende aktivitet målretning til HSPGs, vi udførte celle binding og inhiberingsassays med CAR-mangel (lavt niveau af CAR) AU-565 celler i nærvær eller fravær af heparin eller opløselig CAR (SCAR) protein

En anden version af den tredobbelte pIX-modificerede Ad vektor blev oprettet ved hjælp af tre tidligere karakteriserede forældrenes pIX-modificerede virus:. AdLucIXpK [13], Ad-dE1-IX- sr39tk [12], og Ad-IX-mRFP1 [4] (Flag tags var til stede i alle tre pIX fusionsproteiner). Inkorporeringen af ​​pIX-pK, pIX-TK, og pIX-mRFP1 proteiner på afledte triple mosaik Ad (betegnet coAdpIXPTM # 2) blev verificeret ved Western blotting på de oprensede vira under anvendelse af anti-Flag, anti-RFP, og anti TK antistoffer (fig 4C.)

(A) konstruktioner af modificerede pIX gener i genomer af tre forældre virus:. AdLucIXpK, Ad-dE1-IX-sr39tk, og Ad-IX-mRFP1. Modificerede pIX gener (tagged med Flag) blev drevet af native pIX promotor. (B) Strukturel diagram af triple pIX-modificerede Ad (coAdpIXPTM # 2), der genereres ved co-infektion strategi. (C) 5 × 10

9 VPS af CsCI-oprenset kontrol Ad5 (bane 1) og tredobbelt pIX-modificeret coAdpIXPTM # 2 (bane 2) blev underkastet SDS-PAGE. De separerede proteiner blev farvet med Gelcode Blå (til venstre) eller undersøgt med anti-Flag, anti-RFP, eller anti-TK-antistof. En lang eksponering af anti-Flag-blot blev inkluderet for at vise pIX-pK-protein, som er indarbejdet i Ad-partikler på et meget lavt niveau. De “*” stjerner angiver nedbrydningsprodukter af pIX-mRFP1 fusionsprotein.

Det blev observeret, at den positive kontrol AdLucIXpK, hvor alle pIX molekyler blev ændret af pK, udstillet så meget som to gange i celle bindende for CAR-mangelfuld AU-565 celler sammenlignet med vildtype Ad5. Den tredobbelte mosaik Ad5 (coAdpIXPTM # 2), hvor kun en del af pIX-molekyler indeholdt pK modifikation, udviste ca. 1,5-time højere cellebindingsaktivitet sammenlignet med vildtype Ad5 (fig. 5). Derudover blev mere end 90% cellebindende evne AdLucIXpK og 50% af coAdpIXPTM # 2 inhiberet af frit heparin ved en slutkoncentration på 500 ug /ml, mens det cellebindende af kontrollen Ad5 blev ikke signifikant påvirket (fig. 5). Tilsætningen af ​​200 ug /ml ar inhiberede mere end 80% cellebindende af kontrol Ad5, og samtidig have en relativt beskeden effekt på AdLucIXpK (60%) og coAdpIXPTM # 2 (25%) (fig. 5). Sammen vores data tyder på, at pK-peptider vist på coAdpIXPTM # 2 capsider kunne mediere CAR-uafhængig celle målretning gennem interaktion med cellulære heparansulfat receptorer.

AU-565 celler blev inkuberet med Ad5, AdLucIXpK eller coAdpIXPTM # 2 ved en MOI på 500 VP /celle i nærvær af 500 ug /ml heparin eller 200 ug /ml ar protein ved 4 ° C. Bundne Ad partikler blev kvantificeret ved kvantitativ realtids-PCR og normaliseret med totalt cellulært DNA. Hver søjle repræsenterer middelværdien og SD af tredobbelte bestemmelser, og stjerner angiver signifikant forskel mellem bestemte grupper.

enzymatiske aktivitet Incorporated TK på Triple pIX Mosaic Ad

HSV-1 TK protein kan være genetisk inkorporeret i Ad på pIX locales med dets native enzymatiske aktivitet bevares, som kan anvendes til cancer genterapi med prodrug ganciclovir (GCV), og kan anvendes til

in vitro

in vivo

billeddannelse når kombineret med microPET-systemet [12], [14]. For at undersøge om de pIX-TK-fusionsproteiner kunne fungere normalt, evaluerede vi TK-induceret cytotoksicitet i nærvær af GCV på en farmakologisk koncentration af MTS assay. Til evaluering af pIX-TK-fusionsproteinet direkte frigivet fra Ad-partikler efter korrekt cellulær post blev lungecarcinom A549-celler anvendes, hvor replikationen af ​​ikke-replikativ Ad og pIX-genekspression er minimale. A549 celler blev inficeret med enkelt pIX-modificerede Ad (Ad-DE1-IX-sr39tk) eller tredobbelt plX mosaik Ad (coAdpIXPTM # 2) ved forskellige MOI’er. GCV blev tilsat i inficerede celler to timer efter infektion, og celledød medieret af pIX-TK-fusionsprotein blev bedømt ved MTS-assay 24 timer derefter. Dataene antydede, at der var betydelig GCV-associerede cytotoksicitet induceret af enten Ad-DE1-IX-sr39tk eller coAdpIXPTM # 2 infektion på et højt MOI (10.000 VP /celle) (fig. 6A). ved en lavere MOI (5000 VPS /celle), viste imidlertid kun Ad-DE1-IX-sr39tk infektion, GCV-induceret betydelig cytotoksicitet. Dette indikerede, at pIX-TK-aktivitet i den tredobbelte pIX-modificerede Ad var lavere end for single pIX-TK-modificerede Ad, hvilket kan skyldes de kopi nummer forskelle i pIX-TK indarbejdet i de virale partikler.

(A) A549 celler blev inficeret med Ad5 (negativ kontrol), Ad-dE1-IX-sr39tk eller coAdpIXPTM # 2 på forskellige MOI’er. 2 timer senere, prodrug GCV blev tilføjet på celler med slutkoncentration på 1 mM. 24 timer senere blev celledræbningsaktivitet induceret af konverterede GCV medieret gennem pIX-TK evalueret af MTS-assay. Celler inficeret med virus blev normaliseret med den for ikke-inficerede celler som relativ celleoverlevelse. (B) A549 celler blev inficeret med enkelt pIX-modificerede Ad-DE1-IX-sr39tk eller coAdpIXPTM # 2 på forskellige MOI’er. 12 timer senere, GCV blev tilføjet på celler ved en slutkoncentration på 1 mM. 48 timer senere blev celledræbningsaktivitet af TK /GCV evalueret som samme som beskrevet ovenfor.