PLoS ONE: Phyllanthus spp. Inducerer Selektiv væksthæmning af PC-3 og MEWO humane cancerceller gennem Modulation af Cell Cycle og induktion af apoptose

Abstrakt

Baggrund

Phyllanthus

er en traditionel medicinsk plante, som er blevet anvendt i behandlingen af ​​mange sygdomme, herunder hepatitis og diabetes. Hovedformålet med det foreliggende arbejde var at undersøge de potentielle cytotoksiske virkninger af vandige og methanoliske ekstrakter af fire

Phyllanthus

arter (

P.amarus, P.niruri, P.urinaria

og

P.watsonii

) mod huden melanom og prostata kræftceller.

Metode /vigtigste resultater

Phyllanthus

plante synes at besidde cytotoksiske egenskaber med halv-maksimal hæmmende koncentration (IC

50) værdier på 150-300 ug /ml for vandige ekstrakt og 50-150 ug /ml for methanolisk ekstrakt, der blev bestemt under anvendelse af MTS reduktion assay. Til sammenligning har de planteekstrakter ingen signifikant cytotoksicitet på normal human hud (CCD-1127Sk) og prostata (RWPE-1) celler. Ekstrakterne syntes at virke ved at forårsage dannelsen af ​​en klar “stige” fragmentering af apoptotisk DNA på agarosegel, vises TUNEL-positive celler med en højde af caspase-3 og -7 aktiviteter. Den lactatdehydrogenase (LDH) niveau var lavere end 15% i

Phyllanthus

behandlede-cancerceller. Disse indikerer, at

Phyllanthus

ekstrakter har evnen til at inducere apoptose med minimale nekrotiske virkninger. Desuden cellecyklus analyse viste, at

Phyllanthus

inducerede en Go /G1-fasen anholdelse på PC-3 celler og en S-fase anholdelse på MEWO celler, og disse blev ledsaget af ophobning af celler i Sub-G1 ( apoptose) fase. De cytotoksiske egenskaber kan skyldes tilstedeværelsen af ​​polyphenolforbindelser såsom ellagitanniner, gallotannins, flavonoider og phenoliske syrer findes både i vand og methanol ekstrakt af planterne.

Konklusioner /Signifikans

Phyllanthus

plante udøver sin væksthæmning effekt på en selektiv måde mod kræftceller gennem modulering af cellecyklus og induktion af apoptose via caspaser aktivering i melanom og prostata kræftceller. Derfor

Phyllanthus

kan købes for udviklingen af ​​en potent apoptose-inducerende anticancermiddel

Henvisning:. Tang YQ, Jaganath IB, Sekaran SD (2010)

Phyllanthus

spp. Inducerer Selektiv væksthæmning af PC-3 og MEWO humane cancerceller gennem Modulation af Cell Cycle og induktion af apoptose. PLoS ONE 5 (9): e12644. doi: 10,1371 /journal.pone.0012644

Redaktør: Niyaz Ahmed, University of Hyderabad, Indien

Modtaget: Juni 25, 2010; Accepteret: August 17, 2010; Udgivet: 8 September, 2010

Copyright: © 2010 Tang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev finansieret af Postgraduate Research Grant, University Malaya (UM PS183 /2009b) (www.um.edu.my) og malaysiske Agricultural and Research Development Institute (MARDI) (53-02-03-1002) (www.mardi.gov .min). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kræft er et navn givet til en gruppe af sygdomme, der opstår fra ukontrollerede vækst, spredning af en unormal celle og kan resultere i dødsfald. Det er ekstremt svært at behandle på grund af flere forskellige klasser af tumorer, der udviser forskellige reaktioner på behandlingen, og ikke alle anticancer midler effektivt giver en positiv reaktion i hver [1] tilfælde. Nogle er blevet rapporteret at udvise toksicitet over for normale celler, ledsaget af uønskede virkninger såsom opkastning, kvalme og alopeci. Således har ineffektive anticancermidler medført høje dødelighed hos cancerpatienter [2]. Melanom er en form for hudkræft, der opstår fra melanocytter, et pigment-producerende garvning celle. Melanom incidens og dens dødelighed er høj i fair-flået befolkninger i alle dele af verden, herunder Australien, USA og Storbritannien [3] – [4]. Prostatakræft er den næststørste årsag til kræftdødsfald efter lungekræft på verdensplan [3]. I øjeblikket er der ingen effektive behandlinger for både melanom og prostatakræft, og som sådan intens forskning er nødvendig for at opnå nye anticancer agenter for disse kræftformer.

har Den høje dødelighed hos kræftpatienter fået mange forskere til at kilde til potentiel naturlig-produkt baseret terapeutiske forbindelser [2]. Naturlægemidler planter og plante-afledte lægemidler er blevet brugt som kilde til potentielle anticancer agenter i traditionelle kulturer over hele verden og bliver stadig mere populære i moderne [5] samfundet. De potentielle naturprodukt-afledte anticancermidler er kendt for at have forskellige bioaktive forbindelser såsom roscovitine fra rød radise og flavopiridol fra

Amoora rohituka

, et tropisk træ, der har vist enorme virkninger ved behandling af cancere [6] – [8].

plante af slægten

Phyllanthus

tilhører familien

Euphorbiaceae

og er blevet rapporteret at have farmakologiske virkninger såsom antiviral aktivitet mod hepatitis B og beslægtede hepatitis virus [9] – [12], anti-bakteriel aktivitet [13], [14], anti-hepatotoksiske eller lever-beskyttende aktivitet [15] – [19] samt anti-tumor og anti-kræftfremkaldende egenskaber [16 ], [20]. Derudover har det også udviste hypoglykæmi egenskaber [21], [22]. Selvom plante slægten

Phyllanthus

har vist sig at være gavnligt for sundheden, men dens effektivitet mod kræft er ikke fuldt belyst.

En af udfordringerne i kræftbehandling er, at kræft besidder den evne til at unddrage apoptose (eller programmet celledød), som fører til dens ineffektivitet som et cytotoksisk lægemiddel at dræbe kræftceller. Den apoptotiske proces er en vigtig celledød mekanisme som respons på cytotoksisk behandling og dens induktion er et særdeles ønskværdigt tilstand for et anticancermiddel [23]. Celle cyklus er en proces, der fungerer som en nøgle til at kontrollere væksten og proliferation af en celle. Afbrydelsen af ​​cellecyklusprocessen vil forårsage en ubalance mellem celleproliferation og celledød (apoptose), der efterfølges af udviklingen af ​​kræft. Således kunne cellecyklus tjene som mål for anticancermiddel at standse ukontrolleret proliferation af cancerceller og iværksætte dem at undergå apoptose [24]. De cytotoksiske virkninger af

Phyllanthus

ekstrakter (vandige og methanol) på væksthæmning mod huden melanom og prostata kræftceller i deres cellecyklus kan delvist forklare deres tilstand af aktivitet. Formålet med denne undersøgelse var at bestemme den cytotoksiske effekt af

Phyllanthus

ekstrakter om spredning af hud og prostata cancer celler og også for at undersøge forholdet mellem disse antiproliferative effekter med sandsynlig apoptose og cellecyklus modulation.

Resultater

cytotoksisk aktivitet af vandige og methanoliske ekstrakter af

Phyllanthus

arter

i denne undersøgelse har vi undersøgt de cytotoksiske virkninger af rå vandige og methanoliske ekstrakter af fire forskellige

Phyllanthus

arter,

P.amarus, P.niruri, P, urinaria

og

P.watsonii

på to humane kræftformer (MEWO og PC-3) såvel som normale (CCD-1127Sk og RWPE-1) cellelinier. De cytotoksiske egenskaber af

Phyllanthus

ekstrakter blev bestemt under anvendelse af MTS [3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl] -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulfophenyl) -2H -tetrazoliuminner salt) reduktion assay. Princippet bag dette assay er baseret på reduktionen evne af et opløseligt tetrazoliumsalt, ved mitokondrie dehydrogenaseenzym af levedygtige celler, til et farvet opløseligt formazan produkt, der kan måles spektrofotometrisk. Den halvmaksimal inhiberende koncentration (IC

50) værdi blev bestemt ud fra den beregnede dosis-respons-kurve og er opstillet som en parameter for cytotoksicitet.

Tabel 1 viser sammenligningen af ​​IC

50 værdier for både rå vandige og methanoliske ekstrakter af de fire

Phyllanthus

arter på både human cancer (MEWO og PC-3) og normal (CCD-1127Sk og RWPE-1) cellelinjer. Resultatet afslører tilstedeværelsen af ​​cytotoksiske virkninger af

Phyllanthus

arter på både hud melanom og prostata kræftceller, hvor de respektive IC

50 værdier på

Phyllanthus

ekstrakter blev bestemt. Til sammenligning har planten ikke vist signifikante cytotoksiske virkninger på normale humane celler, mens de standard anticancer narkotika (5’Fluorouracil og doxorubicin) viste stærkere cytotoksisk effekt end de

Phyllanthus

ekstrakter, men udviser toksicitet på normal celler (tabel 1). Blandt de fire

Phyllanthus

plantearter,

P.urinaria

viste stærkest cytotoksisk effekt, efterfulgt af

P.watsonii, P.niruri

P.amarus

. Derudover IC

50 værdier af methanolekstrakter af

Phyllanthus

arter var mærkbart lavere end de vandige ekstrakter på begge cancerceller indikerer, at methanol ekstrakt er mere cytotoksisk end vandige ekstrakt.

Identifikation af polyfenoler i

Phyllanthus

arter

Methanol og vandopløselige ekstrakter opnået fra forskellige arter af

Phyllanthus

blev udsat for analyse ved HPLC (High Performance Liquid Chromatography) koblet med fotodiodearray (PDA) og MS-MS detektion muliggør identifikation af polyphenolforbindelser (tabel 2). Tolv vigtigste forbindelser blev identificeret på basis af deres retentionstider, UV-spektre, og forælder massespektre og sekundære fragmenteringsmønstre. De fundne forbindelser var gallussyre, galloylglucopyronside, digalloylglucopyronside, trigalloylglucopyronside, tetragalloylglucopyronoside, corilagen, geraniin, rutin, quercetin glucosid, quercetin diglucosid, quercetin rhamnosid, og caffeolquinic syre.

DNA-fragmentering

en af ​​de biokemiske kendetegn i den apoptotiske proces er dannelsen af ​​nuklear DNA-fragmentering, der viser tilstedeværelsen af ​​typiske stigen DNA-fragmenter på 180 – 200 basepar og multipla heraf på en agarosegel. Derimod vil tilfældig spaltning af DNA i nekrotiske celler producerer et diffust udstrygning ved elektroforese af DNA. Derfor blev DNA gelelektroforese metode anvendes til at bestemme den mulige tilstand af celledød forårsaget af

Phyllanthus

ekstrakter. Figur 1A viser tilstedeværelsen af ​​DNA-fragmenter fremstillet ved behandling af MEWO celler med

Phyllanthus

ekstrakter og et tilsvarende mønster sås med standard lægemiddel (5’Fluorouracil) som positiv kontrol. Ingen stige-dannelse blev observeret i ubehandlede celler. Disse fænomener blev også observeret i PC-3-cellelinjen for begge ekstrakter som vist i figur 1B. Således indikerer dette, at begge ekstrakter af

Phyllanthus

var i stand til at inducere apoptose eller programmeret celledød på MEWO og PC-3 celler som reaktion på de cytotoksiske virkninger af

Phyllanthus

.

Lane 1 -4: vandig og Lane 6-9: methanol ekstrakter til

P.amarus, P.niruri, P.urinaria

P.watsonii

, i den rækkefølge. Bane 5 og 10: 1 kb DNA-markør, bane 11: standard lægemiddel, hvor A) 5’Fluorouracil for MEWO og B) doxorubicin til PC-3-celler. Bane 12:. Ubehandlede celler

TUNEL assay og Apoptotisk Index

TUNEL (terminal deoxynukleotidyltransferase dUTP nick ende mærkning) analysen er en teknik til at muliggøre detektion af apoptotiske celler ved mærkning af fri udgangen af ​​apoptotisk DNA med en markør, der kan visualiseres under lysmikroskop. Som vist i figur 2 blev apoptotiske celler observeret som brunfarvet celler i

Phyllanthus

ekstraherer-behandlede MEWO (figur 2A, pilespids) og PC-3 (figur 2B, pilespids) kræftceller, deres udseende var ens til apoptotiske celler, der var til stede i de positive kontroller, apoptotiske-inducer anticancerlægemiddel (5’Fluorouracil og doxorubicin), mens levedygtige celler blev farvet blå. Denne yderligere bekræfter, at

Phyllanthus

ekstrakter var i stand til at inducere apoptose på huden melanom og prostata kræftceller. Bestandene af celledød kan beregnes og udtrykkes i en matematisk måde, kendt som apoptotisk indeks. Fra figur 2C, celledøden procentdel (apoptotisk indeks) af behandlet-MEWO og PC-3-celler blev markant forøget op til 50% sammenlignet med kontrolgruppen efter 72 timers behandling med

Phyllanthus

ekstrakter. Hertil kommer, at andelen af ​​

Phyllanthus

ekstrakter inducerede apoptotiske celler var tæt på de lægemidler mod cancer (5’Fluorouracil og doxorubicin) med kun 8% forskel.

TUNEL analyse af MEWO og PC-3 kræftceller efter at være behandlet med

Phyllanthus

ekstrakter ved 100 × forstørrelse. TUNEL-positive (apoptotiske) celler var observerbare som brune farvede celler (rød pil) i

Phyllanthus

ekstrakter-behandlet A) MEWO og B) PC-3 celler og normale levedygtige celler pletten som blå farve. C) Grafen viser procentdelen af ​​apoptotiske indeks (%) af ubehandlet og behandlet (

Phyllanthus

ekstrakter og anticancer narkotika) MEWO og PC-3 cancerceller fra TUNEL analyse.

Phyllanthus

ekstrakter-induceret caspase-3/7 aktiveringer

en aktivering af caspaser (aspartat specifikke cystein protease) er en af ​​de biokemiske forandringer under apoptose. Niveauerne af caspase-3/7 induceret af

Phyllanthus

behandling blev markant forøget (3-4 folder) sammenlignet med den ubehandlede gruppe (figur 3) for begge ekstrakter af

Phyllanthus

. Niveauet af caspase-3/7 af standard narkotika, 5’Fluorouracil og doxorubicin på MEWO og PC-3-celler, var henholdsvis 6-folds forøgelse i forhold til den for kontrolgruppen og 0,5 gange højere end

Phyllanthus

ekstrakter efter 72 timers behandling. Disse viser, at apoptose induceret af

Phyllanthus

ekstrakter blev formidlet via caspaser aktivering.

Grafen viser niveauerne af caspase-3 og -7 i behandlede og ubehandlede grupper af MEWO og PC-3 celler . Barer viser middelværdien ± SE

Phyllanthus

ekstrakter-induceret minimal nekrotisk effekt

Nekrose er en anden form for celledød, der vil fremprovokere inflammatorisk reaktion af de omkringliggende celler gennem lækagen af ​​intracellulært indhold. Som vist i figur 4, procentdelen af ​​LDH produceret som et resultat af behandling med begge ekstrakter af

Phyllanthus

arter var mindre end 10% for MEWO celler og mindre end 15% for PC-3-celler, sammenlignet til den for kontrolgrupperne efter 72 timers behandling. Den nekrotisk effekt af methanol ekstrakter var mere udtalt, hvor det blev observeret at være 4% højere end den vandige ekstrakt af

Phyllanthus

arter. Dette tyder på, at de

Phyllanthus

arter besidder minimal nekrotiske virkninger og hud melanom var mindre tilbøjelige til at vise nekrotisk effekt end prostata kræftceller. I modsætning hertil LDH-niveau induceret af den positive kontrol (5’Fluorouracil og Doxorubicin) var 25% højere end de ubehandlede celler og 18% i variation med

Phyllanthus

-behandlede celler ved 72 timers behandling.

grafen viser procentdelen af ​​LDH i

Phyllanthus

Ekstrakter behandlet MEWO og PC-3 cancerceller var højere end den ubehandlede gruppe efter 72 timers behandling. Barer viser den gennemsnitlige procentdel ± SE

Phyllanthus

ekstrakter inducerer cellecyklusstop efterfulgt af apoptose

For at bestemme fasen af ​​cellecyklus, der hæmmes af

Phyllanthus

planteekstrakter, blev både MEWO og PC-3 celler behandlet på deres respektive IC

50 værdier for 24, 48, 60 og 72 timer og derefter analyseret ved flowcytometri. Kinetikken af ​​cellecyklusfordeling af behandlede og ubehandlede grupper af MEWO og PC-3-celler blev vist i figur 5 og 6, henholdsvis. Ændringer i fordelingen af ​​behandlede celler i forskellige faser af cellecyklus var observerbare ved 24 timer efter at være blevet behandlet med

Phyllanthus

ekstrakter til både cancer cellelinjer.

Den procentdel af

Phyllanthus Salg ekstrakter-behandlede celler ved A) Sub-G1, B) Go /G1, C) S, og D) G2 /M-faser af MEWO celler ved forskellige tidsintervaller (24, 48, 60 og 72 timer) behandling . Barer viser den gennemsnitlige procentdel ± SE

Den procentdel af

Phyllanthus

ekstrakter-behandlede celler på A) Sub-G1, B) Go /G1, C) S, og D) G2 /M faser af PC-3 celler ved forskellige tidsintervaller (24, 48, 60 og 72 timer) i behandling Bars viser den gennemsnitlige procentdel ± SE

Som det fremgår af figur 5,

Phyllanthus

ekstrakter udstillet vækst anholdelse i S-fasen i MEWO celler fra 24 timer og forblev tydelig efter 72 timers behandling, og dette var ledsaget af en ophobning af celler i Sub-G1 (apoptose celler) fase for både vandige og methanoliske ekstrakter. Procentdelen af ​​apoptotiske celler var vokset i en tidsafhængig måde fra 1,8% efter 24 timer til 6,1% efter 72 timer sammenlignet med kontrolgrupperne (figur 5A). I mellemtiden blev procentdelen af ​​celler i S-fasen af ​​behandlede MEWO celler forhøjet til 15% over kontrollerne efter 72 timers behandling (figur 5C). Desuden er andelen af ​​celler på Go /G1 og G2 /M faser faldt med tiden ved behandling med

Phyllanthus

ekstrakter skyldes det faktum, at behandlede celler er blevet arresteret i S-fasen og efterfølgende akkumulerede på Sub-G1 (apoptose) fase (figur 5B og 5D). Men for at styrken af ​​

Phyllanthus

ekstraherer inducere S-fasen ikke var så stærk som standard lægemiddel (5’Fluorouracil), med en forskel på 72 timer 22,1% efter behandlingen.

for PC-3 celler,

Phyllanthus

udstillet vækst anholdelse på Go /G1 fase ved 72 timer efter behandling med en ophobning af apoptotiske celler i Sub-G1 fasen for både vandige og methanoliske ekstrakter. Procentdelen af ​​apoptotiske celler steg fra 3,4% ved 24 timer op til 7,4% ved 72 timer i løbet af de ubehandlede grupper (figur 6A). Procentdelen af ​​behandlede PC-3-celler hos Go /G1-fasen var 13,7% ved 24 timer, og dette steg til 18,8% ved 72 timer over de ubehandlede grupper (figur 6b). Men andelen af ​​behandlet-PC-3-celler ved S og G2 /M-faser faldt med tidspunktet for behandlingen (figur 6C og 6D) på grund af det faktum, at behandlede PC-3-celler blev standset ved Go /G1-fasen og efterfølgende akkumulerede på Sub-G1 faser. Mens doxorubicin viste en G2 /M fase anholdelse på PC-3 celler efter 24 timer og forblev tydelig efter 72 timers behandling.

Diskussion

Man har brugt planter i udstrakt grad til behandling af forskellige former for sygdomme siden oldtiden [7]. Naturlægemidler planter og plante-afledte lægemidler er ofte blevet brugt i traditionelle kulturer over hele verden og har vundet popularitet i det moderne samfund som naturlige alternativer til at producere nye potentielle terapeutiske forbindelser til bekæmpelse af sygdomme [5]. Tres procent af nutidens tilgængelige anticancer narkotika stammer fra naturlige produkter og deres derivater (herunder antibiotika). Dette har resulteret i større tillid til naturlige produkter som vigtige kilder til udvikling af effektive midler mod cancer [7].

I den foreliggende undersøgelse, både vandige og methanol ekstrakter af fire plantearter af

Phyllanthus

viste cytotoksiske virkninger på menneskers hud melanom (MEWO) og prostata (PC-3) cellelinjer. Variationerne i IC

50 værdier på

Phyllanthus

ekstrakter mod melanom og prostata kræftceller kan være på grund af de forskellige niveauer af bioaktive forbindelser, der findes i hver

Phyllanthus

arter såsom quercetin, gallussyre, og caffeolquinic syre, der har vist sig at besidde anticarcinogenic virkninger [16], [25] – [27]. Desuden er de opnåede data tyder på, at den methanoliske ekstrakt af

Phyllanthus

syntes at have mere udtalt cytotoksisk virkning end vandige ekstrakt med angivelse af methanol-opløselige bioaktive forbindelser indeholdt i

Phyllanthus

er sandsynligvis mere potent end de vandopløselige bioaktive stoffer i at dræbe cancerceller. Blandt de fire

Phyllanthus

anvendte arter,

P. urinaria

viste den stærkeste cytotoksiske virkning. Dette kan være forbundet til sin eksklusive indhold af trigalloylglucopyronoside og tetragalloylglucopyronosid. Interessant,

Phyllanthus

ekstrakter gav ikke anledning til væsentlige ændringer på cellens levedygtighed både normale menneskehud (CCD-1127Sk) og prostata (RWPE-1) cellelinjer. Disse resultater korrelerer med undersøgelser udført af Huang et al. hvor

Phyllanthus

planter viste selektiv drab mod kræftceller [28]. Denne selektive cytotoksiske virkning er et vigtigt kriterium, fordi de for tiden tilgængelige lægemidler målrette normale celler samt og fører til bivirkninger.

liv og død af en celle styres af cellecyklussen, som er stramt reguleret af cyclin , cyclinafhængige kinaser (CDK), CDK-inhibitorer (CDKI) og andre tumorsuppressorgener. Således vil deregulering af cellecyklussen føre til unormal proliferation af DNA-beskadigede celler og undvige af apoptose [29].

Phyllanthus

ekstrakter forstyrret cellecyklus af MEWO celler på S-fasen, hvilket indebærer, at de kunne have blandet sig med DNA-syntese, standse progression af cellecyklus ved S-fase og fører til apoptose. S-fasen anholdelse af

Phyllanthus

ekstrakter på MEWO celle kan skyldes: (1) hæmning af CDC25 enzymer [16], [30] – [32], eller (2) hæmning af DNA-topoisomerase II hvilket fører til aktivering af caspaser [16], [33]. Således påvistes høje niveauer af caspase-3 og -7 aktiviteter efter 72 timer efter behandling af

Phyllanthus

ekstrakter. Men S-fasen udvises af

Phyllanthus

ekstrakter ikke så udtalt som 5’Fluorouracil, som er et S-fase-følsom hud anticancerlægemiddel, hvilket indikerer, at

Phyllanthus

ekstraherer sandsynligvis dræbe melanomceller på andre måder foruden forstyrre cellecyklussen, såsom ændringer i melanom celle signalveje herunder FAS pathway [34]. Yderligere undersøgelser vil behandle tilstanden af ​​aktioner af

Phyllanthus

ekstrakter på melanomaceller.

Phyllanthus

ekstrakter udøvet deres vækst anholdelse på behandlet-PC-3 celler ved at akkumulere cellerne på Go /G1-fasen, hvilket indebærer, at

Phyllanthus

ekstrakter kan forstyrre proteinsyntese af PC-3 celler og dermed standse deres progression fra G1 til S-fasen i løbet af deres cellecyklus og efterfølgende indleder apoptose. Dette kan skyldes de inhibitoriske virkninger på MDM2 protein, hvilket reducerer celleproliferation og inducerer apoptose ved højden af ​​p21, Bax og pRb niveauer samt reduktion af hyperphosphoryleret Rb og E2F1 [35].

Phyllanthus

induceret apoptose i PC-3 celler kan være forbundet med forhøjelser af Bax og Fas receptor /ligand genekspression som foreslået af Huang et al. [25]. Forhøjningerne af Bax-proteinet er associeret med inddragelse af mitokondrie (intrinsic) pathway i apoptose, som indebærer reduktion af mitokondrielle membranpotentiale, cytochrom C udgivelser og efterfølgende fører til caspaser aktivering [36]. Høje niveauer af caspase-3 og -7 aktiviteter blev påvist i celler behandlet med

Phyllanthus

ekstrakter. The Go /G1-fasen anholdelse på PC-3 ved

Phyllanthus

ekstrakter kan være forbundet til sit høje indhold af polyphenolforbindelser. De 12 polyfenoler identificeret i

Phyllanthus

, inddeles i fire hovedgrupper, nemlig ellagitanniner, gallotannins, flavonoider og phenol syrer med ellagitanniner er den mest rigelige gruppe af sammensatte. Ellagitanniner er også rigeligt findes i granatæble og er blevet undersøgt ganske grundigt for sin varierede terapeutiske virkninger, herunder dens kræft undertrykke egenskaber [37]. Geraniin, den vigtigste ellagitannin fandtes i alle P

hyllanthus

arter, har vist sig at bidrage til vækst anholdelser på andre cancere, herunder coloncancer [38], [39]. Men standarden lægemiddel mod prostatacancer, doxorubicin, forstyrret væksten af ​​cancerceller ved at arrestere dem på G2 /M-fasen og til sidst initiere apoptose ved en række mekanismer, såsom inhibering på topoisomeraseenzymer som set i andre undersøgelser [40], [ ,,,0],41]

aktiveringen af ​​caspase-3 og -7 aktiviteter i behandlede cancerceller under apoptose resulterer i:. (1) inaktivering af enzymet poly (ADP-ribose) polymerase eller PARP, og (2) aktivering af caspase aktiveret DNase (CAD), derefter forårsager DNA-fragmentering, som er en af ​​egenskaberne ved apoptose [42], [43]. , Elevation af disse caspaser efter

Phyllanthus Salg behandlinger muliggør således udseendet af apoptotiske DNA-fragmenter på agarosegel som blev yderligere bekræftet med tilstedeværelsen af ​​TUNEL-positive celler. Dermed de cytotoksiske virkninger af

Phyllanthus

ekstrakter på menneskehud (MEWO) og prostata (PC-3) cancercellelinier blev medieret via en apoptotisk mekanisme med aktivering af caspase-3 og -7 og dette kunne skyldes af tilstedeværelsen af ​​gallussyre fundet i

Phyllanthus

ekstrakter. Gallussyre har tidligere vist sig at inducere apoptose via caspase-3-aktivering [44].

I naturligt produkt-baseret lægemiddelforskning og -udvikling, nekrose kan opstå sammen med apoptose. Dette er blevet vist i mange anticancerlægemidler såsom cladribine, cisplatin, doxorubicin og 5’fluorouracil, som besidder både apoptotiske og nekrotiske virkninger [45], [46]. LDH er en gruppe af enzymer, der er til stede i vores krop og deres unormalt højt niveau indikerer helbredsproblemer. I celler, der LDH hovedsageligt produceres af mitochondrierne og spiller en vigtig rolle i oxidation af lactat samtidig reducere pyruvat [47]. I nekrotisk celledød, er plasmamembranintegritet tabt, og dette fører til lækage af cytoplasmatiske indhold i det ekstracellulære miljø forårsager en inflammatorisk reaktion [23]. Målinger af LDH-enzym som indikator for nekrose, viste, at

Phyllanthus

udover at have apoptotisk aktivitet, også besidder minimal kapacitet til at inducere nekrotisk celledød på både MEWO og PC-3-celler. Tilsammen viser resultaterne, at

Phyllanthus

plante besidder dual-evne celledød, måske på grund af den rå karakter af

Phyllanthus

ekstrakter, hvor alle potentielle bioaktive stoffer blandes sammen og kan handle individuelt eller i synergi og dermed bidrage til denne dobbelte-evne celledød “effekter.

Disse bioaktive stoffer menes at besidde cytotoksicitet mod kræftceller gennem sin evne til at forstyrre cellevækst af kræft og iværksætte dem til undergå apoptotisk celledød. Selvom de detaljerede eller underliggende mekanismer af selektivitet

Phyllanthus

planten mod hud og prostata kræftceller er stadig uklart, har vores resultater viste, at

Phyllanthus

plante udøver sin væksthæmning mod kræftceller gennem modulation af cellecyklus og induktion af apoptose via caspaser aktivering. Yderligere oprensninger af

Phyllanthus

ekstrakter og undersøgelser af apoptose pathway er nødvendig for at afsløre den nøjagtige virkningsmekanisme

Phyllanthus

anlæg for sin anti-cancer egenskaber.

Materialer og Metoder

planteekstrakter og Standard Drugs

Vandig og methanoliske ekstrakter af fire

Phyllanthus

arter (

P.amarus, P.niruri, P.urinaria, og p .watsonii

) blev leveret af Dr. Indu Bala, Bioteknologisk Center, MARDI. Frisk høstede plante prøver blev vasket, tørret i stuetemperatur og derefter frysetørret. For det vandige ekstrakt blev tørret plante prøve gennemvædet med ultrarent vand, mens absolut methanol blev anvendt til den methanoliske ekstrakt præparat. Prøverne blev derefter homogeniseret med ekstraktionsbuffer, og supernatanten opsamlet efter tre runder af ekstraktion. Doxorubicin og 5’Fluorouracil var faste lægemidler, der anvendes som positive kontroller i dette studie. Begge testede prøver; planteekstrakter og faste lægemidler blev opbevaret ved -20 ° C.

Højtryksvæskekromatografi kombineret med elektronspray ionisering (ESI) og massespektrometri (LC-MS MS) analyse

I vand ekstraheret prøver, 2 ml supernatant blev tørret i en vakuum-koncentrator (koncentrator 5301 Eppendorf, Tyskland) og genopløst i 20 mg /ml med 30% methanol, før det underkastes for LC-MS-MS-analyse. For de prøver ekstraheret med methanol, blev total supernatant inddampet under anvendelse rotationsfordamper (Rotavapor RII, BUCHI, Schweiz) og genopløst igen med 20% methanol. Prøver blev derefter separeret med fastfaseekstraktion (SPE) søjle (LiChrolut RP-18 1000 mg /6 ml, Merck Tyskland) med mobil fase af 60% methanol og 70% methanol. Alle elueres blev koncentreret til 0,5 ml, derefter fortyndet 8 gange med 40% methanol, før det underkastes for LC-MS-MS-analyse.

Prøver blev separeret ved anvendelse af HPLC-system bestående af en HPLC binær pumpe, en autosampler injektor rum og diodearraydetektor (DAD) (1200 series, Agilent Technologies, Tyskland). Separationer blev udført under anvendelse af en omvendt fase C-18, 150 mm x 4,6 mm i.d, 5 um partikelstørrelse Thermo Hypersil GOLD søjle (Thermo Scientific, UK). Separation blev udviklet under anvendelse af en mobil fase af 0,1% myresyre i vand (opløsningsmiddel A) og 0,1% myresyre i acetonitril (opløsningsmiddel B) med en gradient indstilling af opløsningsmiddel B: 5% (5 min), 5-90% (60 min), 5% (4 min) ved strømningshastighed på 1 ml /min. Injektionen volumen blev sat til 20 pi og fund var begge ved 280 nm og 360 nm. For massespektrometrianalyse, 3200 QTrap LC /MS /MS-system (Appiled Bioscience – MDS Sciex) blev anvendt med jernkilden og spænding blev opretholdt ved 500 ° C og -4,5 kV for negative ionisering henholdsvis. Nitrogen generator blev sat til at operere ved 60 psi gardin gasstrøm, 90 psi kilde gasstrøm og 60 psi udstødningsgasstrømmen. To typer af scanning tilstande blev valgt: forbedre massespektrometer (EMS) og forbedre ion produkt (EPI) for en fuld scanning massespektre spænder fra

m /z

100-1200

Cell kultur.

Skin melanom MEWO (HTB-65) celle, prostatacancer PC-3 (CRL-1435) celler, normal human hud CCD-1127Sk (CRL-2565) og prostata RWPE-1 (CRL-11609) celle linjer blev fremskaffet fra American Type Culture Collection (ATCC). De fire cellelinjer blev dyrket med forskellige medier, EMEM (Eagles minimale essentielle medium) for MEWO celler, RPMI-1640 (Roswell Park Memorial Institute) for PC-3-celler, og keratinocyt-vækstmedium, CC-4455 (Lonza, USA) i RWPE-1-celler og DMEM (Dulbeccos modificerede Eagle-medium) for CCD-1127Sk celler. Vækstmedium blev tilsat 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (FBS, Gibco). Celler blev holdt i befugtet luft med 5% CO

2 ved 37 ° C. Celler blev høstet under anvendelse af 0,25% trypsin (Hyclone), når de når 70-80% konfluens i dyrkningskolber. Celler, der undergår eksponentiel vækst blev anvendt i alle eksperimenterne.

cytotoksicitet screening

Celler blev podet ved optimal celledensitet i sterile plader med 96 brønde og inkuberet natten over til fastgørelse.