PLoS ONE: Karakterisering af Niemann-Picks Type C2 Protein Expression i flere kræftformer Brug af en Novel NPC2 monoklonalt Antibody

Abstrakt

Niemann-Picks Type C2 (NPC2) spiller en vigtig rolle i reguleringen af ​​intracellulære cholesterolhomeostase via direkte binding med fri cholesterol. Men lidt om betydningen af ​​NPC2 i kræft. I denne undersøgelse har vi udpeget af virkningen af ​​forskellige kræftformer på NPC2 udtryk. En række anti-NPC2 monoklonale antistoffer (mAb’er) med IgG2a-isotypen blev dannet og peptid screening viste, at den reaktive epitop var aminosyrerester 31-40 af det humane NPC2 protein. Specificiteten af ​​disse mAb’er blev bekræftet ved Western blotting hjælp shRNA medieret knock-down af NPC2 i humane SK-HEP1 celler. Ved immunohistokemisk farvning, er NPC2 udtrykt i normal nyre, lever, bryst, colon, lunge, esophageal, uterine cervix, pancreas og mave væv. Stærk ekspression af NPC2 blev fundet i den distale og proximale tubulus contortus af nyre og hepatocytterne af leveren. Normal esophageal, uterin cervix, pancreas, mave, bryst, colon og lungevæv farves moderat til svagt. Sammenlignet med deres normale vævsækvivalenter blev NPC2 overekspression observeret i bryst-, tyktarms- og lunge. Med hensyn til brystkræft, NPC2 opregulering er associeret med østrogen receptor (-), progesteron-receptor (-) og human epidermal vækstfaktor receptor (+). På den anden side blev NPC2 fundet at være nedreguleret i renalcellecarcinom, levercirrhose og hepatoma væv. Ved antigen-capture enzymimmunassay ELISA, er serum NPC2 øget hos patienter med cirrose og leverkræft. Ifølge Western blot data, er ændringen af ​​glykosyleret mønster af NPC2 i serum i forbindelse med skrumpelever og leverkræft. Så vidt vi ved, er dette den første omfattende immunhistokemiske og serologisk undersøgelse undersøger udtryk for NPC2 i en række forskellige menneskelige kræftformer. Disse nye monoklonale antistoffer skal hjælpe med at belyse roller NPC2 i tumor udvikling, især i lever og brystkræft

Henvisning:. Liao YJ, Lin MW, Yen CH, Lin YT, Wang CK, Huang SF, et al. (2013) Karakterisering af Niemann-Picks Type C2 Protein Expression i flere kræftformer Brug af en Novel NPC2 monoklonalt antistof. PLoS ONE 8 (10): e77586. doi: 10,1371 /journal.pone.0077586

Redaktør: Ichiro Aoki, Yokohama City University School of Medicine, Japan

Modtaget: 30. maj 2013; Accepteret: September 4, 2013; Udgivet: 17 oktober 2013

Copyright: © 2013 Liao et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af en bevilling fra National Science Rådet for Republikken Kina (give NSC100-2325-B-010-008 og NSC102-2320-B-038-003) og Taipei Medical University (give TMU101-AE1-B29). TLCN er blevet støttet af tilskud fra National Science Rådet siden 2005 (NSC 100-2325-B- 182-006) og de nationale Health Research Institutes, Taiwan. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser: Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Niemann-Pick type C2 (NPC2) protein er en lille opløselig glycoprotein, der indeholder en nitten aminosyrer signalpeptid. Proteinet blev først karakteriseret som en vigtig sekretorisk protein i humane epididymis [1]. NPC2 spiller en vigtig rolle i reguleringen af ​​intracellulære cholesterolhomeostase via direkte binding med fri kolesterol [2]. En mangel i NPC2 resulterer i akkumulering af fri cholesterol i lysosomet [3]. Analyse af NPC2 mRNA ved Northern blotting har afsløret en enkelt transkript på 0,9 kb i alle undersøgte væv, med de højeste mRNA-niveauer i testikler, nyrer og lever [4]. Den modne humane NPC2 protein består af 132 aminosyrer og udtrykkes som forskellige isoformer; disse varierer i størrelse fra 19 til 23 kD i en vævsspecifik måde [5,6]. For nylig viste vi, at NPC2 fungerer koordineret med glycin N-methyltransferase at regulere hepatisk cholesterol homeostase og fedtlever sygdomsprogression [7]. Endvidere NPC2 er afgørende for papiller dannelse og modulerer papillær vækst [8]. NPC2 udtrykkes også i alveolære epitel type II-celler fra lungen [9]. Da NPC2 negativt regulerer ERK1 /2 mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK) phosphorylering i fibroblastceller [10], kan en forstyrrelse i NPC2 ekspression være forbundet med vigtige humane sygdomme, herunder cancer. Imidlertid har udtrykkene for NPC2 i humane cancere ikke blevet udforsket i detaljer. Derfor er vores forskningsmæssige mål var (a) at udvikle et panel af monoklonale antistoffer (mAb’er) rettet mod NPC2 protein og (b) at karakterisere deres egenskaber og mulige kliniske anvendelser. Ved anvendelse af immunhistokemisk farvning blev stærke niveauer af ekspression af NPC2 findes i den distale og proximale tubulus contortus af nyre og i hepatocytterne af leveren. Ekspressionen af ​​NPC2 fandtes at være opreguleret i humane bryst-, tyktarms- og lungecancere, mens der til gengæld var der nedregulering af NPC2 ekspression i nyre- og leverkræft. Endelig har vi endvidere demonstreret, at opreguleringen af ​​NPC2 er korreleret med status af østrogen receptor (ER), progesteron-receptor (PR) og human epidermal vækstfaktorreceptor (HER-2) ekspression. Desuden er dysregulering af sera NPC2 forbundet med levercirrose og hepatocellulært carcinom (HCC).

Materialer og metoder

Generering af monoklonale antistoffer mod NPC2

For at generere en serie af mAb’er mod NPC2, oprenset GST-NPC2 eller oprenset His-NPC2 (figur 1A) rekombinant protein (RP) blev blandet med Freunds komplette adjuvans (for den indledende immunisering) eller ukomplet Freunds adjuvans (for booster-injektioner) (Sigma Co., St. Louis, Mo., USA), og den resulterende blanding blev anvendt som et immunogen. His-NPC2 RP blev anvendt som en screening antigen til antistof opstod ved GST-NPC2 RP. Muse mAb’er blev produceret af hybridomet teknik [11]. Hybridomerne blev dispenseret i seks plader med 96 brønde og dyrkes i selekterede medium [12]. Kultursupernatanterne blev screenet ved anvendelse af et enzymimmunoassay med GST-NPC2 RP og His-NPC2 RP som antigenerne. Hybridomaceller, der har en høj optisk densitet ved enzymimmunoassay blev bekræftet ved Western blot-assay straks. Hver brønd af celler, som producerede et positivt resultat blev sub-klonet ind i en plade med 96 brønde med en celletæthed på 0,5 celle pr brønd. Resulterende enkelte kloner med et positivt resultat blev derefter inokuleret i en dosering på 2 x 10

6 ind i en BALB /c-mus, der var blevet primet med 0,5 ml ufuldstændig adjuvans (Sigma) som tidligere. Monoklonalt antistof blev oprenset fra muse asketiske fluid anvendelse af protein G plus protein A Agrose (Calbiochem, San Diego, CA, USA) og derefter koncentreret ved VIVASPIN 20 (GE Healthcare). Den isotype af hver mAb blev bestemt ved anvendelse af monoklonalt museantistof isotypebestemmelse Reagenser (Sigma).

(A) Konstruktion af ekspressionsplasmiderne af GST-NPC2 og Hans-NPC2. (B) Bacterial NPC2 fusionsproteiner blev udtrykt i BL21 celler og derefter induceret ved anvendelse af 1 mM IPTG. SDS-PAGE og Coomassie blue-farvning blev anvendt til at vise molekylvægtene for de to proteiner var ca. 43,3 kD for GST-NPC2 og 17 kD for His-NPC2. (C) Western blot-analyse ved hjælp af monoklonale antistoffer (14-8D, 5-5B, 5-4B, 4-12C, 3-6B, 2-7D, 1-5B og 1-2g) mod GST-NPC2 og His-NPC2 . (D) Western blot-analyse ved hjælp af monoklonale antistoffer mod muse epididymis.

Celler og plasmider

SK-HEP1 celler, købt fra ATCC, blev dyrket i DMEM (Gibco BRL, Grand Island , NY) med 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (HyClone, Logan, UT, USA), penicillin (100 U /ml), streptomycin (100 ug /ml), ikke-essentielle aminosyrer (0,1 mM) og L-glutamin (2 mM) i en befugtet inkubator med 5% CO

2. Plasmid-DNA blev transficeret under anvendelse TurboFect ™ Reagent (Fermentas, Hanover, MD, USA). Primersekvenserne og restriktionsenzymer anvendes til fuld længde og forskellige længder af humane NPC2 gener er tidligere blevet descried af Liao, et al [7]. Plasmid, der koder shRNA for NPC2 (TRCN0000029323) blev opnået fra National RNAi Core Facility (Academia Sinica, Taiwan).

Menneskelige prøver

HCC væv slides (n = 50) og sera (n = 165) blev opnået fra Taiwan leverkræft Network (TLCN) og Taipei City Hospital. De kliniske karakteristika ved disse patienter er vist i tabel S1 og tabel S2. Sund kontrol og patienter med kronisk hepatitis infektion, fedtlever, skrumpelever og HCC var blevet ansat mellem 2008 og 2010 fra Institut for International Medicine, Taipei City Hospital, Ran-Ai Branch, Taipei, Taiwan og TLCN. I alt 33 invasive brystkræft emner blev identificeret i Kaohsiung Municipal Ta-Tung Hospital. Vi behandlede alle vævsprøver under de samme betingelser. Den Etiske Komité for Institutional Review Board of National Yang-Ming University (IRB No. 1.000.041) og Taipei Hospital Institutional Review Board City (IRB nr TCHIRB980509) godkendte de kliniske undersøgelser, og alle fag gav skriftligt informeret samtykke. Diagnose af HCC blev bekræftet ved histologisk undersøgelse. Brystet (BR721), kolon (CO803), lunge (LC1006), nyre (KD991), flere cancer (BCN721), flere sygdomme i leveren (LV1201) og skrumpelever og leverbetændelse (LV805) væv arrays blev købt fra Biomax, USA . Klinisk og patologisk information om de enkelte tumor prøver er tilgængelige og opnåedes fra arrayet producenten.

Peptide screening, Western blotting og immunhistokemisk (IHC) farvning

En ELISA-plade overtrukket med peptiderne blev anvendt til kort epitoper af forskellige anti-NPC2 mAb’er. Disse peptider (hver med en længde på 10 a.a.) omfattede komplette længde af 1-40 a.a. region af NPC2 proteinet. Til Western blotting, blev cellulære eller muse epididymis proteiner separeret ved SDS-PAGE. phospho-ERK1 /2 og ERK1 /2; phospho-p38 og p38; phospho-JNK og JNK blev indkøbt fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA). Immunoblotting signaler blev normaliseret ved anvendelse af α-tubulin eller β-actin og kvantificeres ved densitometrisk scanning. IHC påvisning af NPC2 protein blev udført under anvendelse NPC2 monoklonalt Ab (3-6B) ved en fortynding på 1: 200 [7]. Paraffinindlejrede vævssnit inkuberet med det primære antistof og påvist under anvendelse af Universal LSAB

TM2 kit (DakoCytomation) ifølge producentens instruktioner.

Antigen-capture enzymimmunassay ELISA

Kort fortalt 100 pi polyklonalt NPC2 antistof (5 ug /ml) i 0,1 M carbonatpuffer (pH 9,6) blev tilsat til hver brønd i en 96-brønds mikrotiterplade (Corning Costar, Acton, MA) og inkuberet ved 4 ° C natten over. Derefter blokering med 5% BSA i PBST (PBS buffer indeholdende 0,05% Tween) ved 37 ° C i 2 timer. Hver patients serum (100 pi ved en 1: 1 fortynding) blev tilsat til plader med 96 brønde og inkuberet ved 37 ° C i 1 time. Efter tre omfattende vask med PBST, monoklonalt NPC2 antistof (1: 1000 fortynding) blev tilsat og inkuberet ved 37 ° C i 1 time, efterfulgt af inkubation med 200 pi substrat (0,015% o-phenylendiamin-dihydrochlorid) (Sigma-Aldrich) i yderligere 30 min ved 37 ° C. Reaktioner blev standset ved tilsætning af 3N HCI; Absorbansen blev målt med et spektrofotometer ved 490 nm.

glycosidase Fordøjelse

Sixty mikrogram leverproteiner fra humane sera blev inkuberet med eller uden N-glycosidase F (PNGase F) ifølge fabrikantens instruktioner (NE Biolabs, Beverly, MA). Reaktionsprodukterne blev underkastet western blot-analyse.

Statistiske analyser

Chi-square goodness of fit, ikke-parametrisk Wilcoxon-test eller Wilcoxon Rank Sum blev anvendt til at evaluere associationen mellem NPC2 ekspression og kliniske sygdomme. En

s

værdi på ≦ 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

Generation og karakterisering af mAbs mod NPC2

For at kunne udvikle NPC2 mAb’er der kan påvise NPC2 ekspression i forskellige cellelinier og væv, vi oprindeligt klonet en fuld NPC2 fragment og udtrykte GST-NPC2 og Hans-NPC2 fusionsproteiner i et bakterielt system, (figur 1A). Som vist i figur 1B, GST-NPC2 og Hans-NPC2 rekombinante proteiner, med størrelser på 43,3 og 17 kD, dukkede op i IPTG-inducerede bakterielle lysater. Det oprensede GST-NPC2 og Hans-NPC2 rekombinante proteiner blev anvendt som antigener under genereringen af ​​mAb’er mod NPC2. I alt blev otte mAbs (14-8D, 5-5B, 5-4B, 4-12C, 3-6B, 2-7B, 1-5B og 1-2g) til sidst genereres og fundet at reagere med GST-NPC2 og Hans-NPC2 rekombinante proteiner (figur 1C). Da NPC2 er et stort sekretorisk protein udtrykt i epididymis fluid [1], vi anvendt vores NPC2 mAb’er til påvisning NPC2 ekspression i muse epididymis anvendelse af Western blotting. Som vist i figur 1 D, blev NPC2 påvist i totale epididymis ekstrakter som proteinbånd på ca. 16 til 22 kD. Isotype bestemmelse identificeret alle mAbs som tilhørende IgG2a isotypen og deres lette kæder blev identificeret som K kæder.

For at kortlægge den reaktive område anerkendt af NPC2 mAbs, vi transficeret et separat sæt af plasmider, der udtrykker forskellige længder af NPC2 Ha (herunder fuld-længde NPC2 [1-151 aa], domæne A og B [1-80 aa], domæne B og C [40-105 aa] og domæne C og D [81-151 aa]) for 24 timer. Som vist i figur 2A, kan alle otte NPC2 mAb’er genkender fuld længde og den N-terminale halvdel (1-80 a.a.) af pNPC2-HA. Mens fragmenter indeholdende 41-105 a.a. region NPC2 og den C-terminale halvdel (81-151 a.a.), i NPC2 reagerede ikke med den NPC2 mAbs. Disse resultater tyder på, at alle de NPC2 mAb’er genkender aminosyrer 1-40 af NPC2 protein. For yderligere at kortlægge de reaktive epitoper genkendt af den NPC2 mAbs, blev en ELISA udført under anvendelse af et peptid panel bestående af fire peptider, der dækker aminosyrerne 1-40 af NPC2 protein. Vores resultater viser, at kun én peptid (aminosyrer 31-40) blev anerkendt af seks af de valgte NPC2 mAbs (14-8D, 5-4B, 3-6B, 2-7B, 1-5B og 1-2g) (figur 2B). Som vist i figur 2C, følsomheden og specificiteten af ​​NPC2 mAb’er (3-6B, 14-8D, 5-4B og 2-7B) blev derefter detekteret under anvendelse SK-HEP1 celler transficeret med eller uden shNPC2. Blandt disse NPC2 mAbs, valgte vi en NPC2 mAb (3-6B) som det bedste for den videre forskning og anvendelse i kliniske anvendelser.

(A) epitop region kortlægning af de monoklonale NPC2 antistoffer. Forskellige længde pNPC2-HA herunder fuld-længde pNPC2-HA, N-terminale halvdel (1-80 a.a.), C-terminale halvdel (81-151 a.a.) og 41-105 a.a. blev transficeret ind 293T-celler og 24 timer senere blev høstet til Western blot-analyse. Bane 1, 1-2g; Land 2, 1-5B; Bane 3, 2-7B; Bane 4, 3-6B; Bane 5, mAb-HA; Bane 6, 4-12C; Bane 7, 5-4B, bane 8, 5-5B; Bane 9, 14-8D. (B) en ELISA-plade overtrukket med fire peptider, der dækker 1-40 a.a. region NPC2 protein blev anvendt til epitopkortlægning. Repræsentative resultater fra de mAb’erne (14-8D, 5-4B, 3-6B, 2-7D, 1-5B og 1-2g) er vist. (C) Den knockdown effekt af shNPC2 på SK-HEP1 celler blev detekteret ved anvendelse anti-NPC2 mAbs (3-6B, 14-8D, 5-4B og 2-7B).

Differentiel udtryk for NPC2 i humane normale og tumorvæv

for at undersøge den kliniske anvendelse af NPC2 mAb, vi detekteret udtryk for NPC2 i forskellige normale og cancer væv ved hjælp af IHC farvning. Normal esophageal, uterin cervix, pancreas, mave, bryst, colon og lungevæv viste moderat til svag intensitet NPC2 farvning (figur 3A og 3C). Som vist i figur 3B, blev stærk ekspression af NPC2 fundet i normale hepatocytter i leveren. I nyre blev NPC2 udtrykkes både i den distale og proksimale tubulus contortus, men ikke i glomerulus (figur 3B)

Forstørrelse:. 200x. (A) NPC2 var opreguleret i bryst-, tyktarms- og lunge tumor prøver. (B) NPC2 blev nedreguleret i nyre og lever tumorprøver. (C) Udtrykket af NPC2 forblev uændret i bugspytkirtlen, spiserøret, uterine cervikale og mave vævsprøve par.

Sammenligning mellem disse normale væv (N) og deres tilsvarende tumorvæv (T) blev gennemført ud, og det blev konstateret, at NPC2 var signifikant opreguleret i bryst-, tyktarms- og lungecancere (figur 3A). Blandt de 23 par af brystkræft tumor og normalt væv testet, 18 (78%) af tumorvæv viste højere NPC2 ekspressionsniveauerne end deres normale væv (

s

0,0001, tabel 1). Ud af 44 matchede ikke-småcellet lungekræft par, 30 tumor vævsprøver (68%) havde større NPC2 udtryk end deres normale modstykker (

s

= 0,02, tabel 1). I modsætning hertil NPC2 var signifikant nedreguleret i renalcellecarcinom og leverkræft (figur 3B). Blandt 33 par af nyre tumor og normalt væv, 31 (94%) tumor vævsprøver havde en meget lavere NPC2 ekspression end den tilsvarende normale vævsprøve (

s Restaurant 0,0001, tabel 1). Blandt 50 matchede levertumor væv og tumor-tilstødende væv parvis 36 tumor- vævsprøver (72%) udviste meget lavere NPC2 ekspression end deres tumor-tilstødende vævsprøve (

s

= 0,02, tabel 1). Der var imidlertid ingen forskel mellem normale og cancer vævsprøver til karcinom i spiserøret, livmoderhalsen, bugspytkirtel og mave (figur 3C). . Samlet set viser disse resultater viste, at afvigende ekspression af NPC2 er forbundet med forskellige cancere og at ændringen i ekspression kan være enten op eller ned afhængigt af vævet Salg Cancers

T N n (%)

T = N n (%)

T N n (%)

s Drømmeholdet værdi

Stigning i tumor tissuesBreast (n = 23) 18 (78%) 4 (17%) 1 (4%) 0.0001Colon (n = 38) 18 (47%) 14 (37%) 6 (16%) 0.0523Lung

# (n = 44) 30 (68%) 5 (11%) 9 (20%) 0.02Decrease i tumor tissuesKidney (n = 33) 2 (6%) 031 (94%) 0.0001Liver (n = 50) 2 (4%) 12 (24%) 36 (72%) 0,02 . tabel 1. Immunhistokemi resultater af NPC2 ekspression i human bryst-, tyktarms-, lunge-, nyre- og leverkræft parrede væv

T, tumorvæv; N, normale væv;

#, ikke-småcellet lungekræft. CSV Hent CSV

Forholdet mellem NPC2 udtryk og status af ER, PR og HER-2

Med hensyn til brystkræft, vi yderligere indsamlet 33 invasive brystkræft emner identificeret i Kaohsiung Municipal Ta-Tung Hospital og analyserede forholdet mellem NPC2 udtryk og klinisk-patologiske karakteristika. Blandt 33 patienter, 18 (54.5%) tumor vævsprøver havde en meget højere NPC2 udtryk end den tilsvarende normale vævsprøve (

s

= 0,002, tabel 2). Patienter med NPC2 opregulering var mere tilbøjelige til at have et senere patologi fase (

s

= 0,018), ER (-) (

s

= 0,007), PR (-) (

s

= 0,005), HER-2 (+) (

s

= 0,006), ER (-) plus PR (-) (

s

= 0,011) og ER /PR (-) plus HER-2 (+) (

s

= 0,011)

Total

T . N n (%)

T = N n (%)

T N n (%)

s Drømmeholdet værdi

Total patients3318 (55%) 13 (39%) 2 (6%) 0,002 TNM stageI95 (56%) 4 (44 %) 0 0,043 II166 (38%) 8 (50%) 2 (12%) 0,233 III87 (88%) 1 (12%) 0 0,018 ERPositive209 (45%) 9 (45%) 2 (10%) 0,090 Negative139 ( 69%) 4 (31%) 0 0,007 PRPositive188 (44%) 8 (44%) 2 (11%) 0,092 Negative1510 (67%) 5 (33%) 0 0,005 HER-2 ScorePositive (3) 2012 (60%) 7 (35%) 1 (5%) 0.006 Negativ (0-2) 136 (46%) 6 (46%) 1 (8%) 0,091 CombinationER (+), PR (+) 167 (44%) 7 (44 %) 2 (12%) 0,171 ER (+), PR (-) 42 (50%) 2 (50%) 0 0.180 ER (-), PR (+) 21 (50%) 1 (50%) 0 0,317 ER (-), PR (-) 118 (73%) 3 (27%) 0 0,011 ER /PR (+), HER-2 (+) 94 (44%) 4 (44%) 1 (11%) 0,076 ER /PR (+), HER-2 (-) 136 (46%) 6 (46%) 1 (8%) 0,091 ER /PR (-), HER-2 (+) 118 (73%) 3 (27 %) 0 0,011 ER /PR (-), HER-2 (-) 000 0 N /Atable 2. NPC2 udtryk og klinisk-patologiske karakteristika brystkræftpatienter

T, tumorvæv.; N, normale væv; ER, estrogenreceptor; PR, progesteron receptor; HER-2, human epidermal vækstfaktor receptor 2; (+), Positiv; (-), Negativ. CSV Hent CSV

dysregulering af NPC2 udtryk i menneskelig skrumpelever og HCC

Da leveren er den vigtigste kilde til plasma og galde NPC2 [13], vi næste undersøgt, om serum NPC2 niveau kan bruges som en ny biomarkør for leversygdomme. Vi målte mængden af ​​serum NPC2 niveau fra 42 raske kontroller, 20 patienter med HBV kronisk infektion, 2 patienter med HCV kronisk infektion, 27 patienter med fedtlever, 28 patienter med cirrose og 46 HCC anvendelse af en ELISA (figur 4A). Niveauerne af NPC2 i grupper med raske kontrol, kronisk HBV-infektion, kronisk HCV-infektion, fedtlever, skrumpelever og HCC var 3,29 ± 1,43 ng /ml, 4,51 ± 1,88 ng /ml, 9.66 ng /ml (maksimal værdi, 15,81 og minimum værdi, 3,504), 7,49 ± 2,30 ng /ml, 15,30 ± 2,02 ng /ml og 7,26 ± 2.11 ng /ml. Som vist i figur 4A, niveauerne af NPC2 var ingen forskel mellem sunde kontrol, kronisk hepatitis (HBV og HCV) -infektion og patienter med fedtlever. Vigtigere, patienter med cirrose og HCC havde signifikant højere niveauer af NPC2 end raske kontrolpersoner. På den anden side, IHC-farvning viste, at NPC2 var signifikant nedreguleret i cirrhosis væv, mens der ikke var nogen forskel mellem normale og hepatitis væv (figur 4B og 4C).

(A) ELISA-analyse af serum NPC2 niveauer i 42 raske kontrolpersoner, 20 patienter med kronisk HBV-infektion, 2 patienter med kronisk HCV-infektion, 27 patienter med fedtlever, 28 skrumpelever og 46 HCC patienter. (B) IHC farvning af NPC2 proteinekspression i normale, kronisk hepatitis og skrumpelever væv. (C) IHC analyser af hepatisk NPC2 ekspression i 44 normale, 21 kronisk hepatitis og 60 cirrhosis vævsprøver (*,

s Restaurant 0,05, Mann-Whitney U-test). (D) Humane sera (60 ug) blev inkuberet med peptid N-glycosidase F (PNGase F) og underkastet Western blot analyse. (E) Western blot-analyse af serum NPC2 ekspression i 14 raske kontroller, 7 fedtlever, 4 cirrose og 4 HCC patienter. Hver linje blev indlæst 100 ug protein.

Da N-glykosylering er vigtig for den korrekte målretning og funktion af NPC2 [14], vi næste brugte PNGase F fordøjelsen at bekræfte, om serum NPC2 protein heterogenitet skyldes til post-translationel glycosylering modifikation. Efter PNGase F behandling blev NPC2 visualiseret som et enkelt immunoreaktivt bånd (figur 4D). Til yderligere undersøgt, om glycosyleret form af NPC2 er forbundet med leverkræft progression, blev serumprøver underkastet western blotting-analyse. Glycosyleret og spirende NPC2 blev udtrykt i et forhold på 1: 1 i normalt humant sera (figur 4E). Interessant, selv om vi ikke finde nogen forskel i serum NPC2 udtryk mellem sunde og fedtlever patienter, glykosyleret NPC2 udtryk var den største form både skrumpelever og HCC patienter (Figur 4E). Disse data tydede på, at de beløb og de ændringer i glykosyleret mønster af NPC2 er forbundet med skrumpelever og HCC udvikling.

Effekter af NPC2 på MAPK signalering

For at identificere den NPC2-afhængig mekanisme, vi understregede om status for MAPK signalering. Som vist i figur 5, vedvarende phosphorylering af ERK1 /2 er blevet observeret i NPC2 knockdown celler. Men p38 og JNK ikke aktiveres i NPC2 knockdown celler.

Total og phosphoryleret ERK1 /2, p38, JNK blev detekteret ved Western blotting fra SK-HEP1 celler. Knockdown af NPC2 resulterer i aktivering af ERK1 /2.

Diskussion

NPC2 proteinet binder med fri kolesterol og styrer intracellulære cholesterolhomeostase [2]. Mutation af NPC2 genet resulterer i kolesterol akkumulering i den sene endosomale /lysosomale rum i cellen [6]. Imidlertid er roller NPC2 ekspression i humane cancere ikke fuldt forstået uanset dets kendte rolle i kolesterol binding. I denne undersøgelse har vi genereret og karakteriseret en række NPC2 mAb’er og derefter vurderet deres immunoreaktivitet ved hjælp af flere tumor vævsarrays. Fra epitop kortdata, fandt vi, at NPC2 mAbs målrettede aminosyrerester 31-40 af det humane NPC2 protein (figur 2B). Da aminosyreresterne 31-40 er højt konserveret blandt forskellige mammale orthologer [2], bør disse NPC2 mAbs være hjælpsomt når de udfører forskning i rollen som NPC2 i en lang række pattedyrarter i fremtiden. Følsomheden og specificiteten af ​​NPC2 mAbs blev evalueret ved knock-down af NPC2 protein i SK-HEP1 celler (Figur 2C).

IHC farvning viste, at NPC2 udtryk blev øget i bryst-, tyktarms- og lungekræft (figur 3A). Da der observeres stærke udtryk for NPC2 i human intraduktal bryst papilloma, kolon polypper, lunge papillær carcinom og æggestokkene fimbria [8,15], kan NPC2 protein bidrage til papiller dannelse. Epidemiologiske studier har vist, at HER-2 subtype [HER-2 (+), ER (-), og PR (-)] og tredobbelt negativ [HER-2 (-), ER (-), og PR (-)] havde den værste overlevelse, dårlig prognose og højere locoregional gentagelse [16-19]. Vores undersøgelse viste, at NPC2 overekspression er associeret med HER-2 undertype (tabel 2), hvilket tyder på, at NPC2 opregulering kan være en gunstig prognose prædiktor for brystkræft.

Kolesterol homøostase er vigtigt at lamellære organer af lunge alveolær type II-celler, der tjener til at producere overfladeaktivt middel. NPC2 protein er til stede i lungen alveolære type II-celler og alveolære makrofager og regulerer overfladeaktivt cholesterolindhold [9,20]. Vores resultater viste, at NPC2 forstærkes i lungeadenocarcinom væv (figur 3A). Proteomics analyse har også vist, at ekspressionen af ​​NPC2 øges i lunge adenom og pleural effusion [21,22]. Selv om det endnu ikke klart, om NPC2 spiller en rolle i lunge adenocarcinom, tilstedeværelsen af ​​NPC2 protein i pleural effusion af patienter med lunge-adenocarcinom antyder, at det kan have en anvendelse som en potentiel diagnostisk markør for lungekræft.

reduceret ekspression af NPC2 specifikt observeret i nyrer og lever tumorvæv, sammenlignet med deres normale modstykker. Da NPC2 knockdown fibroblastceller har vist en vedvarende phosphorylering af ERK1 /2 MAPK [10] kan NPC2 negativt regulere ERK1 /2 MAPK-aktivering. Faktisk var aktiveringen af ​​ERK1 /2 observeret i NPC2 knockdown SK-HEP1 celler (figur 5). Vedrørende virkningen af ​​NPC2 substitutionsterapi i NPC2 – /- mus, konstateredes det, at hepatisk makrofaginfiltration og antallet af fedt-lastet celler blev signifikant forbedret [23]. Da lipid ophobning og efterfølgende inflammation fremskynde udviklingen af ​​skrumpelever og leverkræft [24,25], kan NPC2 administration lindre leverkræft udvikling. Da leveren er den vigtigste kilde til plasma og galde NPC2 [13], kan stigningen i sera NPC2 i skrumpelever og HCC patienter relateret til de alvorlige skader af hepatocytter. I den foreliggende undersøgelse også observeret vi ændringer i glycosylerede NPC2 ekspressionsmønstre i sera fra både cirrose og HCC patienter, hvilket antyder, at sådanne ændringer kan tjene som en indikator for skrumpelever og kræft. N-glycosylering er vigtig for den korrekte målretning og funktion af NPC2 [14]. Yderligere undersøgelse er nødvendig for at afklare roller glykosyleret NPC2 bruge mere skrumpelever og HCC tilfælde.

I nyrerne, NPC2 er rigeligt express i distal og proksimal indviklede tubulus (figur 3B). Da NPC2 er opreguleret i nyrevæv fra Dahl salt-følsomme rotter givet en høj-salt kost [26], er det blevet foreslået, at NPC2 kunne regulere natrium reabsorption i nephron. Ikke desto mindre er den funktionelle relevans af NPC2 i renalcellecarcinom er fortsat uklart, og der er behov for yderligere undersøgelser for at belyse den rolle, NPC2 i nyre, både fysiologisk og patologisk.

Vores resultater viste, at vores NPC2 monoklonalt antistof har potentielt nyttige programmer i de områder af klinisk diagnose og kræft progression på tværs af flere væv.

Støtte oplysninger

tabel S1.

#, HBV eller HCV angiver sager blev inficeret med HBV og HCV virus henholdsvis

Ikke-B non-C indikerer patienter var ikke inficeret med HBV og HCV virus. *, Klassificeringen af ​​patologiske stadier blev ifølge AJCC, UICC, og Cupi

doi:. 10,1371 /journal.pone.0077586.s001

(DOC)

tabel S2.

#, HBV eller HCV angiver sager blev inficeret med HBV og HCV virus, hhv.

doi: 10,1371 /journal.pone.0077586.s002

(DOC)

Tak

Vi takker TLCN for at levere HCC vævsprøver og relaterede kliniske data. Dette netværk omfatter i øjeblikket fem store medicinske centre (National Taiwan University Hospital, Chang-Gung Memorial Hospital-Linko, Veteran General Hospital-Taichung, Chang-Gung Memorial Hospital, Kaohsiung og Veteran General Hospital, Kaohsiung).