PLoS ONE: Fokus på 16p13.3 Locus i Colon Cancer

Abstrakt

Baggrund

Med en million nye tilfælde af kolorektal cancer (CRC) diagnosticeres årligt i verden, CRC er den tredje mest almindeligt diagnosticeret kræft i den vestlige verden. Patienter med stadium I-III CRC kan kureres med kirurgi, men er i risiko for tilbagefald. Colorektal cancer er kendetegnet ved tilstedeværelsen af ​​kromosomale deletioner og gevinster. Store genomiske profilering undersøgelser har dog ikke udført i denne sygdom. Antallet af en specifik genetisk afvigelse i en tumor prøve kunne korrelere med recidiv overlevelse eller samlet overlevelse, muligvis kan føre til anvendelse som biomarkør for terapeutiske beslutninger. På dette punkt er der ikke tilstrækkelige markører til forudsigelse af tilbagefald i kolorektal cancer, som kan bruges i klinikken til at skelne mellem stadie II patienter, der vil nyde godt af adjuverende kemoterapi. For eksempel har den fordel af adjuverende kemoterapi været mest tydeligt demonstreret i fase III-sygdom med en cirka 30 procent relativ reduktion i risikoen for tilbagefald. Fordelene ved adjuverende kemoterapi i stadie II-sygdom er mindre sikker, at risikoen for tilbagefald er meget mindre i den samlede gruppe, og de specifikke patienter med risiko er svære at identificere.

Materialer og metoder

i denne undersøgelse blev arrayet-komparativ genomisk hybridisering analyse (array-CGH) anvendes til at studere høj opløsning DNA kopital ændringer i 93 tyktarmscarcinomceller prøver. Disse genomiske data blev kombineret med parametre som

KRAS

mutation status, mikrosatellit status og klinisk-patologiske karakteristika.

Resultater

Både store og små kromosomale tab og gevinster blev identificeret i vores stikprøve kohorte. Tilbagevendende gevinster blev fundet for kromosom 1q, 7, 8Q, 13 og 20, og tab meste fundet for 1p, 4, 8 p, 14, 15, 17 p, 18, 21 og 22. Dataanalyse viste, at tab af kromosom 4 er knyttet til en dårligere prognose i vores patienter serien. Ud over disse ændringer blev to interessante små regioner af overlapning identificeret, som kunne være forbundet med recidiv. Gain af 16p13.3 locus (herunder RNA

bindende protein

,

fox-1 homolog

gen,

RBFOX1

) var forbundet med en dårligere af tilbagevenden overlevelse i vores patient kohorte. På den anden side blev tab af

RBFOX1

kun fundet hos patienter uden sygdomstilbagefald. Mest interessant, ovennævnte karakteristika blev også fundet i stadie II patienter, for hvem der er en høj medicinsk behov for identifikation af nye prognostiske biomarkører.

Konklusioner

Som konklusion kopiere antal variation af den 16p13.3 locus synes at være en vigtig parameter for forudsigelse af tilbagefald i tyktarmskræft

Henvisning:. Mampaey E, Fieuw A, Van Laethem T, Ferdinande L, Claes K, Ceelen W, et al. (2015) Fokus på 16p13.3 Locus i tyktarmskræft. PLoS ONE 10 (7): e0131421. doi: 10,1371 /journal.pone.0131421

Redaktør: Jörg D. Hoheisel, Deutsches Krebsforschungszentrum, TYSKLAND

Modtaget: Februar 25, 2015; Accepteret: Juni 2, 2015; Udgivet: 29 Jul 2015

Copyright: © 2015 Mampaey et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering: Denne forskning blev støttet af tilskud fra den belgiske regering: FPS Health, Fødevarekæden sikkerhed og miljø, og GD Health Care – Cell Kræftplan (Kræftplan. – handling 29). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

med en million nye tilfælde af kolorektal cancer (CRC) diagnosticeres årligt i verden, CRC er den tredje mest almindeligt diagnosticeret kræft i den vestlige verden og den næststørste årsag til kræft dødsfald i både mænd og kvinder (9% af alle cancere) [1]. En af udfordringerne i CRC er at opnå et fald i dødeligheden ved gennemførelsen af ​​screeningsprogrammer, der fører til tidlig påvisning og behandling af forstadier til kræft [2]. Terapeutiske beslutninger er baseret på en mellemstation system, der beskriver tumor omfang, tilstedeværelse eller fravær af lymfeknude engagement og fjernmetastaser (TNM klassifikation) [3]. fase CRC Tidlig kan helbredes ved kirurgi alene. Fordelen ved adjuverende kemoterapi har været mest tydeligt demonstreret i fase III, hvorimod fordel i fase II-sygdom er stadig kontroversiel [3-5]. I dag stadie III patienter formentlig overbehandlet: alle patienter får kemoterapi, mens omkring halvdelen af ​​patienterne ikke oplever tilbagefald før indførelsen af ​​adjuverende behandling [6]. På den anden side, stadie II patienter sandsynligvis underbehandlet, eftersom en væsentlig del af dem vil udvikle tilbagevendende sygdom. Identifikation af højrisiko stadie II patienter, der vil få gavn af adjuverende kemoterapi er stærkt behov for, men har hidtil vist sig vanskeligt at påvise i kliniske forsøg. Brugen af ​​adjuverende behandling i stadie II patienter er baseret på en risikovurdering evaluere A.O. mikrosatellit (MS) status, lymphovascular og perineural invasion, tumor differentiering og antallet af undersøgte lymfeknuder [6].

Der er behov for identifikation af yderligere (bio) markører til forudsigelse af tilbagefald i denne undergruppe af patienterne. Dette vil forhåbentlig føre til identifikation af patienter, der kan få gavn af adjuverende kemoterapi [3].

For nylig er der gjort store fremskridt i forståelsen af ​​kolorektal tumor biologi. Den histologiske sekvens af kolorektal carcinogenese er kendetegnet ved flere forskellige genetiske og epigenetiske forandringer [7,8], såsom inaktivering

APC

mutationer i familiær adenomatøs polypose (FAP) eller tab af funktion af fejlparringsreparationsgener i arvelig ikke-polypose colorectal cancer (HNPCC) [9,10]. I 1990 Fearon

et al

. foreslog en kaskade af mutationer i forskellige gener, der anses for den klassiske eller kromosomale ustabilitet (CIN) pathway [7]. Den første begivenhed i de tidlige stadier af en kolorektal tumor er

APC

inaktivering, fulgt over tid ved yderligere mutationer af

KRAS

og

TP53

gener, samt sletninger af kromosom 18q [7,11]. De fleste af de sporadiske CRCs er kendetegnet ved de ændringer og er lokaliseret i den venstre side af kolon. Ud over dette, har to andre veje, der er involveret i ætiologien af ​​CRC blevet identificeret. Femten procent af sporadiske CRCs og 95% af HNPCC syndromer blev vist at bære ændringer i mikrosatellit instabilitet (MSI) pathway [10]. Endelig 20-30% af CRC har ændringer af den takkede pathway, ofte præsenterer sig med et CpG-ø methyleret fænotype (CIMP) og /eller methylering af

MGMT

gen [12,13]. Disse (epi) genetiske ændringer kan påvirke forløbet af sygdommen og derved resultatet af patienterne.

En anden form for genetiske ændringer stede i kolorektale tumorer er DNA kopital ændringer (CNA’er), som allerede er blevet undersøgt i tyktarmskræft, ikke desto mindre uden nogen konsensus [14-17]. På grund af den genomiske instabilitet af tumorer, disse CNAs er ofte til stede i tumorer og repræsentere potentielle nye biomarkører til forudsigelse af sygdomstilbagefald.

I denne undersøgelse blev CNAs analyseret i et stort panel af patienter med coloncancer i forskellige stadier af sygdom med det formål at vurdere, om bestemte CNAs vedrører patient resultat.

Materialer og metoder

Patienter og kliniske data

En serie af 159 primær kolon adenocarcinom resektioner var undersøgt, prospektivt indsamlet mellem 2004 og 2012 fra departementet Gastro-tarm kirurgi af Ghent University Hospital i Belgien. Patienterne blev fulgt indtil dødsdagen eller indtil kliniske data cut-off (marts 2014). Placeringen af ​​tumor i tyktarmen blev betegnet som ret for tumorer beliggende i caecum, colon ascendens og proximale halvdel af den tværgående colon. Placeringen blev betegnet som venstre, når tumoren var placeret i den distale halvdel af den tværgående colon, colon descendens og sigmoid. Analyser blev udført inden for hver tumor etape, regnet fra datoen for diagnosen for tilbagefald eller dato for sidste opfølgning for recidiv (alle trin uden trin IV) og død eller sidste opfølgning for samlet overlevelse (alle faser sammen). Når en korrelation mellem overlevelse og en vis markør blev undersøgt i løbet af alle tumor etaper sammen, blev tilbagefald patienter regnes som stadie IV patienter og for disse patienter overlevelse i denne specifikke analyse blev regnet fra datoen for diagnosticering af tilbagefald.

patienter, der blev behandlet med adjuverende kemoterapi enten modtaget 5FU ifølge ændret de Gramont (specifikt stadie II patienter) eller modificeret FOLFOX 6 (fase III patienter) i løbet af 6 måneder. Fire patienter blev behandlet i et klinisk forsøg, og kan have modtaget yderligere biologiske midler. Trin IV patienter blev behandlet med en række på hinanden følgende palliative regimer.

A skriftligt informeret samtykke til deltagelse blev opnået fra hver patient. Undersøgelsen blev godkendt af kommissionen for medicinsk etik i Ghent University Hospital (belgisk registreringsnummer: B67020096625). Kliniske data blev hentet fra de medicinske filer.

Vævsprøver

En patolog, før formalin fiksering, stikprøven både primær tumor og makroskopiske normale væv fra resektion prøver. Normalt væv blev taget så langt væk som muligt fra tumoren i de samme resektion prøve. Alle prøver var frisk frosset inden for højst 30 minutter efter kirurgisk resektion og opbevaret ved -80 ° C. En patolog scorede alle tumorprøver for tumor celle indhold på hæmatoxylin /eosin farvede kryosektioner. Endelig blev 93 af 159 tumor prøver indeholdende mindst 50% tumorceller bevares.

KRAS mutation og MSI fænotype

Alle 159 tumor prøver blev profileret for tilstedeværelsen af ​​syv somatiske

KRAS

mutationer i codon 12 og 13 (12 ALA, 12ASP, 12Val, 12CYS, 12SER, 12ARG og 13ASP) ved hjælp af TheraScreen KRAS RGQ PCR (Qiagen) på formalin-fikseret paraffin-indstøbt (FFPE) tumorvæv (analyse under ISO15189 akkreditering). Andet

RAS

mutationer blev ikke undersøgt. MS status for alle 159 tumorprøver blev analyseret ved fragmentanalyse på ABI3130xl genetiske analysator (Applied Biosystems) under anvendelse af GeneMapper software 4 (Applied Biosystems). BAT25, BAT26, D2S123, D17S250, NR21, D18S55, NR24 og NR27 er de otte undersøgte gentagne markører. Tumorer blev klassificeret som MSI når blev observeret ustabilitet på 25% af markørerne. MSI patienter kunne opdeles i to grupper, MSI-høj og MSI-lav, i forhold til antallet af afvigende markører. Men tallene var for lave til korrekt statistisk analyse. I situationer, hvor forskellen er taget, er det beskrevet i teksten.

DNA blev ekstraheret under anvendelse af DNeasy blod og væv (Qiagen) ifølge producentens instruktioner. Kvaliteten og mængden af ​​DNA-prøverne blev målt med en NanoDrop ND-1000 instrument (Thermo Scientific).

Array komparativ genomisk hybridisering

Kopier nummer ændringer blev undersøgt ved oligo-baserede matrix-CGH på tumorprøver, hvor mindst 50% af tumorcellerne. Prøver med mindre tumor kunne justere resultaterne celler. Prøverne blev profileret på en brugerdefineret SurePrint G3 Menneskelig CGH Microarray, 4x180K (G4125A, Agilent Technologies). DNA’et i tyktarmen tumorprøver blev mærket med det fluorescerende farvestof Cy3 (Perkin Elmer) og den samme mængde af kommercielt tilgængelige henvisning mandlige og kvindelige genomisk DNA (kreatech) blev mærket med Cy5 (Perkin Elmer). Yderligere behandling blev udført ifølge producentens instruktioner (Agilent Technologies). Fluorescensintensiteter blev målt under anvendelse af et Agilent scanner (G2505C, Agilent Technologies). Data blev udvundet ved hjælp af Feature Extraction v10.1.1.1 software program (Agilent Technologies) og behandles yderligere med arrayCGHbase [18]. De afskæringsværdier for vundet og tabt segmenter var 0,33 og -0,33 hhv. Afvigelser, der var til stede i mere end 10 tilfælde i et separat afskærmet klinisk genetik kohorte på 1000 prøver blev betragtet som mulige forfatningsmæssige kopi nummer varianter (normal kopi nummer ombygninger) og blev udelukket fra yderligere analyse. Alle rapporterede resultater blev manuelt valideret.

Statistik Salg

Den statistiske miljø R (version 2.12.1) blev anvendt til at udføre hierarkiske klynge og Heatmap analyse og til at konstruere grafen viser genomet brede frekvenser af alle amplifikationer, gevinster og tab i alle prøverne. Alle andre statistiske analyser blev udført i SPSS Statistics (version 21). (*) P 0,05, (**) p 0,01 og (***) p 0,001 blev betragtet som statistisk signifikant i to-grenede prøver. Da alle data normalt fordelte, blev ANOVA anvendt til at sammenligne populationer og Pearson korrelation blev anvendt til sammenhængen mellem variabler. Overlevelse blev udført med Kaplan-Meier-metoden og log rank test. Cox regressionsanalyse blev anvendt til beregning hazard ratio.

Resultater

Kliniske karakteristika

De kliniske data er sammenfattet i S1 tabel. Alle tumorerne i denne undersøgelse var primære kolon adenocarcinomer, som var ubehandlede på tidspunktet for resektion. Patienterne var overvejende fra kaukasisk etnicitet.

Med hensyn til køn forening, klassifikation sygdom, stedet af den primære tumor, scene, differentiering, perineurale og lymphovascular invasion, dette sæt af 159 tumorer ligner de fleste andre rapporterede patientkohorter af sporadisk CRC (S1 tabel).

De tumorer blev ligeligt fordelt mellem mænd og kvinder (57,9% vs 42,1%). Den mucinøs variant af adenocarcinom blev diagnosticeret i 20,1% af tumorer. Alle patienter blev iscenesat ved hjælp AJCC-7 retningslinjer [19] de. Patienterne blev ligeligt fordelt over de fire faser, med lidt flere patienter i trin II (36,5%). Halvdelen af ​​patienterne (49,7%) modtog adjuvans (31,2%) eller palliativ (18,5%) kemoterapi. Ved slutningen af ​​follow-up, 105 patienter (66%) var stadig i live (S1 tabel). Blandt de 159 patienter, der indgår i denne undersøgelse, 68 (52,7%) havde en øget carcinoembryonisk antigen (CEA) niveau på tidspunktet for diagnosen. De havde en dårligere prognose end dem med et niveau under 3,4 ng /pl. Både metastatisk eller lokalt recidiv og 2-års samlet overlevelse (OS) var signifikant bedre for patienter med et lavt CEA niveau ved diagnose (R = 0,260, ** P = 0,003 for tilbagefald overlevelse (RFS), R = 0,271, * * P = 0,002 for 2-års OS) (S1 File).

KRAS mutation status og MS status og deres sammenhænge med de klinisk-patologiske data

Som vist i S1 tabel,

KRAS Salg -mutations blev påvist i 51 patienter (33,1%). Otte af disse mutationer blev placeret i codon 13 (pGly13Asp) fik alle andre ligger i codon 12 i

KRAS

gen. Blandt de 159 patienter testet for MSI, 87,9% af coloncancere viste mikrosatellit stabilitet (MSS), to patienter (1,3%) var MSI-lav og 16 patienter (10,7%) var MSI-høj (S1 tabel).

i vores patientgruppe, observerede vi en signifikant sammenhæng mellem

KRAS

mutation og MS status (R = -0,198, * P = 0,017).

KRAS

mutationsfrekvens var højere i MSS patienter end i MSI patienter (S2 tabel).

Vi fandt en signifikant sammenhæng mellem MS status med lymphovascular invasion (R = -0,181, * P = 0,038) og stedet for den primære tumor (R = -0,291, *** P 0,001). Vi fandt MSI i mindst én patient i alle faser, men mest i de tidlige faser (to MSI patienter i fase I, syv i fase II og et MSI patient både i fase III og IV) (tabel 1). En signifikant korrelation blev fundet mellem MS status og tumor klassifikation (R = 0,173, * P = 0,034) (S2 tabel). Det betyder, at patienter med MSI har normalt en lille tumor placeret i højre colon, i denne kohorte oftest trin II mucinøs adenocarcinom uden lymphovascular invasion. De kolorektale tumorer med MSI meste er

KRAS

vildtype (S2 File).

En udvidet tabel over patientkarakteristika kan findes i S1 og S2 Tables.

DNA-kopi nummer ændringer

efter scoring af alle tumorprøver, 93 prøver med mindst 50% af tumorcellerne blev bevaret for matrix-CGH-analyse. Halvfems ud af disse 93 coloncarcinomer viste genomiske ændringer (Fig 1). Patienter med forhøjet CEA niveau havde flere CNAs end patienter med normal CEA niveau diagnose (* P = 0,023) (Figur A i S3 File). CNA’er i vores patient kohorte var mindre rigelige i MSI patienter end i MSS patienter, som bedømt ved 180K matrix-CGH (* P = 0,016) (figur B i S3 File). Alle MSI patienterne havde mindre end ti ændringer, mens det gennemsnitlige antal ændringer for den overordnede patient kohorte er 12.98 (± 0,982). Når vi kiggede for ændringer i de forskellige tumor stadier, fandt vi et større antal ændringer til MSI patient i fase IV, mens der i de øvrige tumor etaper, MSI patienter havde færre CNAs forhold til MSS patienter (** P = 0,003) (Figur C i S3 File). Clustering analyse identificeret ingen statistisk signifikant sammenhæng mellem klynge grupper (baseret på en eller flere specifikke ændring) og enhver klinisk parameter i vores database (S1 Fig).

Gevinster er repræsenteret i blå, tab i rødt.

antallet af CNA’erne blev delt i tre grupper efter udførelse en ROC-kurve (data ikke vist). Der blev etableret to cut-off points; den første ved 12 CNAs og den anden ved 20 CNA’er. På den måde, vi delte de tyktarmskarcinomer i tre grupper: tumorer med mindre end 12 ændringer, tumorer med mere end 20 ændringer og en mellemliggende gruppe af tumorer med 12 Til 20 ændringer

Survival analyse, beregnet efter. antallet af ændringer, afslørede en kortere 2-års OS for patienter med mere end 20 ændringer i alle tumor faser sammen (** P = 0,004) (fig 2A). Hos patienter med et stadie IV tumor, forskellen var bemærkelsesværdigt større (Fig 2B): overlevelse af patienter betyder med mere end 20 ændringer var halvdelen af ​​patienter med mindre end 20 ændringer (* P = 0,015). Uventet, i tumor fase I og II, dårligere prognose blev fundet i patientgruppen med mindre end 12 ændringer (* P = 0,019) (fig 2C og 2D).

(A) For alle faser, ** P = 0,004; (B) til fase IV, * P = 0,015; (C) i fase I, * P = 0019 og (D) for fase II, * P = 0019. I overlevelse kurven tre grupper kan skelnes; gruppen med mindre end tolv ændringer (blå), gruppen med tolv untill tyve ændringer (grøn) og gruppen med mere end tyve ændringer (rød).

Der er også en sammenhæng mellem differentiering karakteren af ​​tumor og antallet af ændringer. Patienter, som har godt differentierede tumorer, havde mindre end 12 CNAs, samlet og for hvert trin for sig. Patienter med dårligt differentierede tumorer og med tumorer, der kan befordre over 20 CNAs, havde en dårligere 2-års OS og især når vi kun sammenligne stadie IV patienter (** P = 0,006 og ** P = 0,010 henholdsvis) (S2 Fig).

Array komparativ genomisk hybridisering (array-CGH) analyse viste, at de hyppigste CNA’er i tyktarmskarcinomer var gevinster af kromosomer 1q, 7, 8Q, 13, 20 og 20Q og tab af kromosomer 1p, 4, 8P, 14 , 15, 17p, 18, 21 og 22 (figur 1). Vi fandt også tilstedeværelsen af ​​multiple isochromosomes i vores prøver for kromosom 1, 5 og 8 (henholdsvis i 5,4%, 5,4% og 7,5% af vores patienter). Tab af kromosom 4 var signifikant forbundet med en kortere RFS (betyder RFS er 241,7 uger for patienter med et tab af kromosom 4 og 433.96 uger for patienter uden kromosom 4 tab *** P 0,001) (figur 3A). Tab af kromosom 1, 3, 4 og 9 blev forbundet til en kortere 2-års OS (henholdsvis P = 0,053, ** P = 0,005, ** P = 0,002 og P = 0,069) (fig 3B og figur AC i S4 Fil ). Gevinst på kromosom 7 og 20 viste sig at være signifikant forbundet med en bedre 2-års OS (henholdsvis * P = 0,048 og * P = 0,035) (figur DE i S4-fil).

Tab af kromosom 4 er forbundet med en kortere RFS, *** P 0001 (a) og en mindre 2-års OS, ** P = 0,002 (B). Patienter uden en ændring af kromosom 4 præsenteres i grøn, dem med tab af kromosom 4 i blåt.

Kromosom 16p13.3 ændring

Locus 16p13.3 viste sig at være en tilbagevendende ændring, da det er til stede i 35% af vores patient kohorte af 93 patienter. Otte patienter viste gevinst på den distale del af dette locus og 24 patienter viste et tab med den mest tilbagevendende mindste region i overlap (SRO) fra 6,5 ​​indtil 7 Mb. Otte patienter præsenteret med en homozygot deletion. Den SRO omfatter exon 3 og 4 i

RBFOX1

gen (6-7Mb). Kopiér nummer variant profiler af det normale væv af de otte homozygote tilfælde blev vurderet til at udelukke en forfatningsmæssig kopi nummer variant. Disse resultater viste, at de homozygote deletioner ikke var konstitutionelle kopiantal varianter, men blev somatisk erhvervet ændringer (S3 Fig). Mere end 70 gener, såsom

CREBBP

,

MIR1225

,

RAB40C

RAB26

, er placeret i den distale del af 16p13.3 locus. De to sidstnævnte gener er medlemmer af

RAS

onkogen familie, som spiller en vigtig rolle i colon carcinogenese.

Generelt patienter uden 16p13.3 ændringer udviser færre CNAs (R = -0,430 , *** P 0,001). Dette gælder for alle tumor stadier (Fig 4A) og for hver tumor fase separat (data ikke vist).

(A) Forholdet mellem ændring af 16p13.3 locus og antallet af CNA i tilsvarende patient for alle tumor stadier, R = -0430 og *** P 0001. (B) Kaplan Meier overlevelse kurve, der viser en dårligere prognose for patienter med en gevinst på den 16p13.3 locus i alle tumor etaper, ** P = 0,010. Gevinster er repræsenteret i grønt, er tab i blåt og patienter uden en ændring repræsenteret i rødt.

I fase IV tumorer, blev en signifikant sammenhæng fundet mellem tilstedeværelsen af ​​16p13.3 ændring (gevinst eller tab), og tumoren i den højre colon (R = -0,384, * P = 0,036). I alle andre tumor etaper, kunne denne konklusion ikke bekræftes, selv ikke når alle trin blev behandlet samlet.

Ingen sammenhæng kunne findes mellem den 2-årige OS og tilstedeværelsen af ​​en 16p13.3 ændring (figur AD i S5 File). Men i metastatiske gruppe, en tendens var til stede (figur E i S5 File),. Patienter, der udstillede

RBFOX1

tab, viste en værre 2-års OS end patienter uden denne sletning (P = 0,393).

Endelig en signifikant sammenhæng blev vist i alle tumor etaper mellem tilstedeværelsen af en 16p13.3 ændring og RFS (fig 4B og figur a i S6 File). Når en gevinst på 16p13.3 var til stede, prognosen for disse patienter over alle tumor stadier var værre end prognosen for patienter uden en 16p13.3 ændring eller med et tab af

RBFOX1

gen (HR = 5,018 , ** P = 0,020). Når den samme analyse blev udført for hver tumor fase separat, blev et grænsetilfælde signifikant sammenhæng mellem 16p13.3 ændring og sygdom tilbagefald kun observeret i fase II-tumorer (* P = 0,022) (figur B-D i S6 File). Ingen af ​​de patienter, der havde et tab af

RBFOX1

gen, lidt fra en lokal eller metastatisk recidiv. Tværtimod patienter uden en ændring eller med en gevinst i 16p13.3 havde en højere risiko for tilbagefald. Den log-rank test for tilbagefald i stadie II tumorer viste en stærkere signifikant sammenhæng for gevinst på 16p13.3 og tidspunkt for tilbagefald (** P = 0,008), med en gennemsnitlig tid til tilbagefald af 166 uger for patienter med en gevinst på 16p13 .3 og 443 uger for patienter uden en 16p13.3 ændring (Figur E i S6 File).

diskussion

De patientkarakteristika i denne undersøgelse svarer stort set til dem rapporteret i litteraturen. Nogle tidligere rapporterede resultater kunne dog ikke valideres i denne undersøgelse, ligesom en bedre prognose for patienter med MSI-høje tumorer som beskrevet af Gryfe og medarbejdere [20]. Colon tumorer med en

KRAS

mutation er mindre tilbøjelige til at præsentere mikrosatellit ustabilitet. Sammenhængen mellem

KRAS

mutation og MS-status er allerede blevet vist i tidligere undersøgelser og komplicerer brugen af ​​denne markør i forhold til prognose [21-23].

Dette kan til dels skyldes den omstændighed, at en reel forskel af MSI tumorer i MSI-høj og MSI-low ikke kunne foretages. Associeringen af ​​MSI tumorer med histologi af mucinous adenocarcinomer, som blev beskrevet før, blev bekræftet i vores patientpopulation [24].

Vores undersøgelse spørgsmålstegn ved, om kopital ændringer kan anvendes som en prognostisk markør til forudsigelse af gentagelse af tyktarmskræft, især i fase II tumorer. Brug vifte-CGH-analyse, har vi identificeret tilbagevendende CNAs blandt patienter med colon karcinom med forskellige stadier og kliniske karakteristika. Styrkerne ved vores undersøgelse er det store antal patienter og integration af klinisk-patologiske karakteristika. En anden styrke er, at vi begrænset undersøgelsen til coloncancer, fordi det er blevet foreslået før, at den store forskel i publicerede undersøgelser skyldes det faktum, at colon og rektal tumorer blev undersøgt sammen [25]. I vores undersøgelse, 97% af colon tumorprøver besidder genomiske ændringer. Det faktum, at antallet af CNA’erne er højere i stadie II MSS tumorer i forhold til MSI tumorer er blevet foreslået før og blev valideret af Brosens et al. [14]. Nakao og kolleger gjorde også fundet en højere frekvens af kopi nummer ændringer hos patienter med MSS mod MSI-H (20% og 5%). Dette var også tilfældet for gevinster, tab, amplifikationer og sletninger adskille [26]. Også gruppen af ​​Xie fundet en lavere CNA prævalens i MSI kolorektale tumorer end i MSS tumorer [27]. Det lavere antal CNA’erne i MSI tumorer kunne være en forklaring på den bedre resultat af patienter med en MSI tumor [20]. Vores resultater bekræfter, at patienter med stadie II tumorer, og mere specifikt med pT3N0 tumorer udviser højfrekvente MSI, har en bedre prognose. Deres prognose synes at være værre, når de behandles med adjuverende kemoterapi baseret på 5-FU [28].

Gain af kromosom 13 og 20, og tab af kromosom 18 er de mest almindelige genomiske ændringer i tyktarmskræft og disse resultater var bekræftet i vores undersøgelse [29]. Desuden blev der fundet andre tilbagevendende gevinster og tab af hele-kromosomer. Avance ved 1q, 7, 8Q, 13, 20 og 20Q og tab på 1p, 4, 8 p, 14, 15, 17 p, 18, 21 og 22 var for det meste fundet. De forekomster af disse CNAs er i overensstemmelse med de indberettede data, men de blev aldrig rapporteret alle sammen i en undersøgelse [15-17,25,30,31]. Tab af kromosom 1p og forstærkning af kromosom 1q er sandsynligvis fører til dannelse af en isokromosom, som er til stede i 5% af vores patientpopulation. I litteraturen er der meget lidt information om dannelsen af ​​isochromosomes i CRC cellelinjer og endnu mindre i patientprøver [15,32]. Mere information om funktionaliteten af ​​denne isokromosom dannelse kan findes ved at forlænge patientens kohorte.

Statistisk analyse viste, at tab af kromosom 1, 3, 4 og 9 var forbundet med en kortere overlevelse. På den anden side er forstærkning af kromosomer 7 og 20 forbundet med en bedre 2-års OS. Desuden fandt vi en stærk signifikant sammenhæng for tabet af kromosom 4 og sygdom tilbagefald. Tidligere undersøgelser har vist, både ved karyotypebestemmelse og ved meta-analyse af CGH undersøgelser, at tab af kromosom 4 er forbundet med dårlig klinisk resultat [15,33]. Mere specifikt i stadie II patienter med tyktarmskræft, tab af kromosom 4q er allerede blevet sat i forbindelse med sygdom tilbagefald [14]. Tab af kromosom 4 synes således at være en vigtig begivenhed i ætiologien for tyktarmskræft og kunne bruges som prognostisk markør for tilbagefald i denne sygdom.

Tumor genomer ofte besidder mange subkromosomal og fokale forandringer siden af ​​ændringer af komplette kromosomer og kromosom arme [34,35]. Array-CGH data i denne undersøgelse viste en tilbagevendende ændret locus, 16p13.3, som indeholder

RBFOX1 (RNA-bindende protein

,

fox-1 homolog)

gen. Denne locus er ikke blevet rapporteret som tilbagevendende ændring med en klar rolle i resultatet i andre matrix-CGH studier med en acceptabel mængde af patienter med CRC [14-17,25,32,33]. Bare et par undersøgelser har nævnt genetiske ændringer på 16p13.3 i CRC [27,30,31]. Vore resultater bekræfter de sidstnævnte undersøgelser. I vores undersøgelse blev to SROs i dette locus forbundet med vigtige kliniske parametre. Gain af den distale 5Mb del af locus blev fundet i 9% af patienterne i denne undersøgelse. Tab af exon 3 og 4 i den

RBFOX1

gen var til stede i 26% af vores patienter, med tilstedeværelsen af ​​en homozygot sletning af

RBFOX1

i en tredjedel af dem. For at udelukke muligheden for en konstitutionel kopital variant, blev den normale væv afprøvet og fundet normal. Derfor kan det 16p13.3 ændringen blive klassificeret som en somatisk variant, kun til stede i tumorceller.

Patienter med 16p13.3 ændring viste sig at udvise flere CNAs end patienter uden en ændring af 16p13.3 locus. Dette gælder for alle tumor faser sammen samt for hver tumor fase separat. En gevinst i 16p13.3 locus var forbundet med en dårligere RFS for alle faser sammen samt for fase II tumorer særskilt, hvilket er en meget interessant opdagelse grund af den høje klinisk behov for nye prognostiske markører i trin II tyktarmskræft. I forskellige tumortyper fast, ligesom bryst-, lunge-, hepatocellulær og bugspytkirtelkræft gevinst på 16p13.3 var forbundet med sene stadie sygdom, værre overlevelse og dårlig differentiering og et sent stadium sygdom [36-39]. Forskellige gener placeret på 16p13.3 locus blev hypotese at være impliceret i dårlig prognose: i lungekræft

TSC2

blev bragt frem, i bugspytkirtelkræft

PDPK1

[37,39]. Den 16p13.3 locus bærer i alt 167 kendte protein-kodende gener som

AXIN1

,

RAB40C

RAB26

er vigtige gener i CRC. Det var allerede blevet påvist, at

AXIN1

var muteret i tyktarms- og endetarmskræft og vildtype kan inducere apoptose i kolorektal cancer celler [40].

RBFOX1

gen er også placeret i denne region. Kun få tidligere udgivelser overvejer dette gen i CRC blev fundet. Man citerer specifikt en høj forekomst i en bangladeshiske befolkning med tidlig fase CRC [41]. Korrelation med resultat blev ikke undersøgt i dette lille patientgruppe.