PLoS ONE: Kvantitativ proteomiske Analysen afslører, at Anti-Cancer Virkninger af selen protein 1 In Vivo er forbundet med metaboliske veje

Abstrakt

Tidligere undersøgelser har vist tumor-undertrykkende rolle af selen-bindende protein 1 (SBP1), men de underliggende mekanismer er uklare. I denne undersøgelse fandt vi, at induktion af SBP1 viste signifikant inhibering af colorektal vækst cancercelle og metastase i mus. Vi yderligere anvendte isobare tags for relativ og absolut kvantificering (iTRAQ) for at identificere proteiner, der var involveret i SBP1-medierede anti-cancer effekter i tumorvæv. Vi identificerede 132 differentielt udtrykte proteiner, blandt dem var 53 proteiner opreguleres og 79 proteiner blev nedreguleret. Vigtigt er det, mange af de differentielt ændrede proteiner var associeret med lipid /glucosemetabolisme, hvilket også var knyttet til Glycolysis, MAPK, Wnt, NF-kB, hak og epitel-mesenchymal overgang (EMT) signalveje. Disse resultater har afsløret en ny mekanisme, SBP1-medieret kræft hæmning er gennem at ændre lipid /glucose metaboliske signalveje

Henvisning:. Ying Q, Ansŏng E, Diamond AM, Lu Z, Yang W, Bie X (2015 ) Kvantitativ proteomiske Analysen afslører, at Anti-Cancer Virkninger af selen protein en

In Vivo

er forbundet med metaboliske processer. PLoS ONE 10 (5): e0126285. doi: 10,1371 /journal.pone.0126285

Academic Redaktør: Chih-Hsin Tang, Kina Medical University, TAIWAN

Modtaget: Januar 13, 2015; Accepteret: 31 Marts 2015; Udgivet: May 14, 2015

Copyright: © 2015 Ying et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet delvist af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (tilskud # 91.229.115 og 81.272.251), et tilskud til Innovative Team of Science og teknologi, Henan-provinsen, Kina

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Den menneskelige selen-bindende protein 1 (SBP1, SELENBP1) tilhører klassen af ​​selen-holdige proteiner, hvor selen er tæt forbundet med peptidet i stedet for inkorporeret co-translationelt som en aminosyre selenocystein (Sec) i en anden klasse af selen-holdigt protein-glutathionperoxidase 1 (GPx1). Det humane SBP1 genet koder for et 472 aminosyre protein, som har en molvægt på 56 kDa. Det udtrykkes i en række celler og væv (lever, hjerte, lunge og nyre) og placeret i kernen og /eller cytoplasma afhængigt celletype, differentiering, og miljømæssig signalering [1-4]. Nedsat SBP1 er fundet i de fleste af humane cancere herunder leverkræft, prostatacancer, brystcancer, lungecancer og colorektal cancer [5]. Denne reduktion af SBP1 er forbundet med dårlige kliniske resultater. Men biologiske funktioner SBP1 i humane kræftformer er fortsat uklare.

Det er blevet rapporteret, at SBP1 er et mål for hypoxi-inducerbare faktor-1 α (HIF1α) at ​​reagere på reaktive ilt arter (ROS) [3] . SBP1 kunne også negativt regulere glutathionperoxidase 1 (GPx1) aktivitet uden at ændre proteinekspression gennem en fysisk protein interaktion [6]. von Hippel-Lindau-proteinet (pVHL) – interagerende afubiquitinerende enzym 1 (VDU1) blev for nylig fundet som et andet protein partner SBP1, der var involveret i ubiquitination- og deubiquitination-medieret protein nedbrydningsveje [7]. Alt dette arbejde tyder på, at SBP1 kan interagere med andre proteiner gennem forskellige signalveje.

For at få en mere omfattende forståelse af SBP1 funktioner på kræft, vi ansat en proteomisk metode, isobare tags for relativ og absolut kvantificering (iTRAQ) . iTRAQ er i øjeblikket en af ​​de mest robuste teknikker, som kvantificerer proteiner på basis af peptid mærkning. I modsætning til gel-baserede proteomisk metode, iTRAQ udstiller meget bedre følsomhed og muliggør identifikation og nøjagtig kvantificering af proteiner fra flere prøver inden for brede dynamiske intervaller af protein overflod [8].

For at eliminere mulige bivirkninger af transfektion, vi etableret en stabil SBP1 inducerbar cellelinie ved anvendelse af en Tet-on inducerbar genekspression system, der gør SBP1 ekspression særdeles styrbar og når et meget højt induktion niveau i celler. blev observeret Tumor hæmning rolle SBP1

in vivo

. De differentielt udtrykte proteiner i SBP1-induceret muse xenotransplantattumorer blev analyseret ved iTRAQ og ændringerne af nogle identificerede proteiner blev valideret ved immunoblotting. Vores resultater viste en roman anti-cancer mekanisme SBP1

in vivo

, der var knyttet til lipid /glukosemetabolismen og forbundet med MAPK /Wnt, NF-kB, hak og EMT signalveje.

Materialer og metoder

Etik Statement

Denne undersøgelse blev godkendt af Xinxiang Medical University Animal Care og brug Udvalg. Alle operation blev udført under pentobarbital anæstesi og blev gjort alle bestræbelser på at minimere lidelse.

Cell kultur

HCT116 human koloncarcinomcellelinie blev opnået fra ATCC (American Type Culture Collection, USA) og opretholdt i McCoys 5a medium (Mediatech, Manassas, VA). GP2-293 cellelinje blev erhvervet fra Clontech (Mountain View, CA) og opretholdt i DMEM-medium (Life Technologies, Carlsbad, CA). Alle medier blev suppleret med 10% FBS, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. Alle celler blev dyrket ved 37 ° C med 5% CO

2 i en fugtig inkubator (Thermo Fisher Scientific).

Plasmidkonstruktion

For at generere retroviral ekspressionsplasmid pRetroX-Tight-Pur -SBP1, human SBP1 cDNA blev forstærket og subklonedes i pRetroX-Tight-Pur vektor (Clontech, Mountain View, CA) ved hjælp af Notl og EcoRI restriktionssteder. Følgende primere blev anvendt: forward 5′- ATAGCGGCCGCTACAGCATGGCTACGAAAT-3 ‘og revers 5′-ACGAATTCGCTCAAATCCA GATGTCAGAGC-3’. To plasmider pRetroX-Tet-On Advanced (Tet på aktivator vektor) og pVSV-G (Packaging vektor) blev købt fra Clontech (Mountain View, CA).

retrovirus emballage

emballage celler GP2-293 blev dyrket i 25cm

2 kolber og transficeret ved hjælp af Lipofectamine 2000 (Life Technologies) med 6 ug pVSV-G og enten 2 ug pRetroX-Tight-Pur-SBP1 eller 2 ug pRetroX-Tight-On Avanceret. Otteogfyrre timer efter transfektion blev virusholdige supernatant opsamlet og nedfrosset ved -20 ° C. HCT116-TetSBP1 blev genereret ved at inficere HCT116 celler med virus indeholdende både pRetroX-Tight-Pur-SBP1 og pRetroX-Tight-On Avanceret. Enkelt koloni blev udtaget efter selektion med 400 ug /ml G418 (Sigma) og 1 pg /ml puromycin (Sigma). HCT116-loven blev genereret ved at inficere HCT116 celler med virus indeholdende pRetroX-Tight-On Avanceret. Enkelt koloni blev udtaget efter selektion med 400 ug /ml G418 (Sigma).

Immunoblotting analyse

HCT116-TetSBP1 og HCT116-ACT-celler blev behandlet med 1 pg /ml doxycyclin (Sigma) i 72 timer før analyse. Høstede celler blev lyseret i 1 x Cell Lysis Buffer (Cell Signaling, Danvers, MA) indeholdende 1 mM PMSF (Cell Signaling). Blokerede cellelysat fra hver cellelinje blev kogt med NuPAGE LDS prøvebuffer (Life Technologies) og 10x reduktionsmiddel (Life Technologies) i 5 minutter før den blev fyldt på en 4-12% gradient Bis-Tris denaturerende polyacrylamidgel (Life Technologies). Efter prøven separation ved elektroforese blev proteiner overført til en Immobilon-FL membran (Millipore) via elektroblotting. Primære antistoffer og fortyndinger herunder SBP1 ved 1: 1000 (mus, MBL International, Woburn, MA), β-actin ved 1: 10000 (mus, Sigma), DKK1 ved 1: 1000 (kanin, Proteintech, Chicago, IL), ANXA4 ved 1: 1000 (kanin, Proteintech, Chicago, IL), PPIA ved 1: 1000 (kanin, Proteintech, Chicago, IL), FABP4 ved 1: 1000 (kanin, Proteintech, Chicago, IL), UGDH ved 1: 1000 ( kanin, Proteintech, Chicago, IL), ALDH2 ved 1: 1000 (kanin, Proteintech, Chicago, IL), p21 ved 1: 1000 (kanin, Proteintech, Chicago, IL), phospho-Akt (Ser473) ved 1: 1000 ( kanin, Cell Signaling Technology, Danvers, MA), Akt ved 1: 1000 (kanin, Cell Signaling Technology, Danvers, MA), phospho-FOXO1 ved 1: 1000 (kanin, Cell Signaling Technology, Danvers, MA), phospho-JNK ved 1: 1000 (kanin, Cell Signaling Technology, Danvers, MA), JNK ved 1: 1000 (kanin, Cell Signaling Technology, Danvers, MA), Pc-Jun på 1: 1000 (kanin, Cell Signaling Technology, Danvers, MA ), phospho-cyklin D1 ved 1: 1000 (kanin, Cell Signaling Technology, Danvers, MA), cyklin D1 ved 1: 1000 (kanin, Cell Signaling Technology, Danvers, MA), phospho-p53 (Ser15) ved 1: 1000 (kanin, Cell Signaling Technology, Danvers, MA), TWIST ved 1: 1000 (kanin, Cell Signaling Technology, Danvers, MA), β-Catenin ved 1: 500 (ged, Santa Cruz, Santa Cruz, CA), og GPX1 ved 1: 1000 (mus, MBL International, Woburn, MA) blev inkuberet med membranen ved 4 ° C natten over. Den passende sekundære antistof (Beyotime Institute of Biotechnology, Kina) blev påført (1: 1000, kanin eller mus) ved stuetemperatur i 1 time. Signal blev påvist under anvendelse BeyoECL Plus (Beyotime Institute of Biotechnology, Kina).

In vivo

nøgne mus tumorgenese og metastase assay

For xenograft eksperiment, HCT116-loven og HCT116 -TetSBP1 celler blev behandlet med 1 pg /ml doxycyclin i 72 timer og derefter 2 × 10

6 celler i 100 pi PBS blev injiceret subkutant i 6-8 uger gamle BALB /c CD-1 Nu hunmus på de forskellige sider ( HCT116-loven var på venstre side og HCT116-TetSBP1 var på højre side). Doxycyclin (200 ug /ml) opløst i 5% sucrose leveres som drikkevand blev udvekslet hver 3. dag. Fire uger efter injektion, tumorer blev isoleret og vægten (g) og volumen (mm

3) af tumorer blev bestemt. Tumorer blev opbevaret ved -80 ° C indtil anvendt til immunoblot og iTRAQ analyse.

At producere lungemetastasen blev HCT116-ACT og HCT116-TetSBP1 celler behandlet med 1 ug /ml doxycyclin i 72 timer og derefter 2 × 10

6 celler i 100 pi PBS blev injiceret i de laterale halevener 6-8 uger gamle BALB /c-CD-1 Nu hunmus. Doxycyclin (200 ug /ml) opløst i 5% sucrose leveres som drikkevand blev udvekslet hver 3. dag. Seks uger senere blev musene aflivet under bedøvelse. Lungerne blev opsamlet og fikseret i 10% formalin. For væv morfologi evaluering hæmatoxylin og eosin (HE) farvning blev udført på snit fra indlejrede prøver.

Protein udvinding, fordøjelse og iTRAQ mærkning

I alt proteiner blev udvundet fra tumorvæv af HCT116-loven injiceres (lov) og HCT116-TetSBP1 injicerede mus (TetSBP1) ved hjælp af følgende protokol. Tre biologiske replikater blev udført for hver prøve og blandet sammen for protein udvinding. Tumorvæv blev kogt i SDT-buffer (4% SDS, 100 mM Tris-HCI, 1 mM DTT, pH 7,6) i 5 minutter, homogeniseret ved anvendelse FastPrep-24 (MP Biomedicals, 6M /S, 30s, to cyklusser) og derefter sonikeret ( 100w, 30 sek på, 30 sek off, 10 cykler). Homogenatet blev centrifugeret ved 12.000 i 10 min ved 4 ° C. Proteinkoncentrationer blev analyseret ifølge Bradford-metoden [9]. En lige mængde af proteiner er udarbejdet for hver prøve. Protein fordøjelse blev udført ifølge den FASP beskrevet af Wisniewski, Zougman et al. [10], og den resulterende peptidblanding blev mærket under anvendelse af 4-plex iTRAQ reagens ifølge producentens instruktioner (Applied Biosystems). Kort fortalt 200 ug af proteiner for hver prøve blev inkorporeret i 30 pi STD-buffer (4% SDS, 100 mM DTT, 150 mM Tris-HCI pH 8,0). Vaskemidlet, DTT og andre lav molekylvægt komponenter blev fjernet under anvendelse UA puffer (8 M urea, 150 mM Tris-HCI pH 8,0) ved gentagen ultrafiltrering (Microcon enheder, 30 kD). Derefter 100 pi 0,05 M iodacetamid i UA puffer blev tilsat for at blokere reducerede cysteinrester og prøverne blev inkuberet i 20 min i mørke. Filtrene blev vasket med 100 pi UA buffer tre gange og derefter 100 pi DS puffer (50 mM triethylammoniumbicarbonate ved pH 8,5) to gange. Endelig blev proteinsuspensioner fordøjet med 2 ug trypsin (Promega) i 40 pi DS puffer natten over ved 37 ° C, og de resulterende peptider blev opsamlet som et filtrat. Indholdet peptid blev estimeret ved UV-lys spektral tæthed ved 280 nm med en udryddelser koefficient på 1,1 på 0,1% (g /l) opløsning, der blev beregnet på grundlag af hyppigheden af ​​tryptophan og tyrosin i vertebrate proteiner. Ved mærkning blev hver iTRAQ reagens opløst i 70 pi ethanol og tilsat til det respektive peptidblanding. Prøverne blev mærket som (TetSBP1) -114, (lov) -115, og var multiplex og vakuumtørret.

væskekromatografi (LC) -electrospray (ESI) tandem MS (MS /MS) analyse af Q exactive

peptidblanding blev afsaltet på C18 Cartridges (Sigma) og derefter koncentreret ved vakuum centrifugering og rekonstitueres i 40 pi 0,1% (v /v) trifluoreddikesyre. MS blev udført på en Q Exactive massespektrometer, der blev koblet til Easy nLC (Thermo Fisher Scientific). 10 pi af prøven blev injiceret for nanoLC-MS /MS-analyse. Peptidblandingen (5 ug) blev fyldt på en C18-søjle med omvendt fase (Thermo Scientific Easy Column, 10 cm lang, 75 um indvendig diameter, 3 um harpiks) i puffer A (0,1% myresyre) og adskilt med en lineær gradient puffer B (80% acetonitril og 0,1% myresyre) ved en strømningshastighed på 250 nl /min kontrolleret af IntelliFlow teknologi over 240 min. MS-data blev erhvervet ved hjælp af en data-afhængig TOP10 metode dynamisk at vælge de mest udbredte precursor-ioner fra undersøgelsen scan (300-1800 m /z) for HCD fragmentering. Bestemmelse af målværdien er baseret på prædiktiv Automatic Gain Control (pAGC). varighed dynamisk udelukkelse var 60 s. Undersøgelsens scanninger blev erhvervet ved en opløsning på 70.000 ved m /z 200 og opløsning til HCD spektre blev sat til 17.500 ved m /z 200. Normalized sammenstød energi var 30 eV og underfyldningen ratio, der angiver den mindste procentdel af målværdien sandsynlige skal nås ved maksimal fyldning tidspunkt blev defineret som 0,1%. Instrumentet blev kørt med peptid anerkendelse tilstanden aktiveret

iTRAQ protein identifikation og kvantificering

MS /MS-spektre blev søgt hjælp MASCOT motor (Matrix Science, London, UK, version 2.2). Indlejret i Proteome Discoverer 1.3 (Thermo Electron, San Jose, Californien) mod UniProt Menneskelig database (136615 sekvenser, downloadet den 7. maj, 2014) og lokkedue databasen. Til identifikation protein, blev følgende muligheder anvendes: peptid masse tolerance = 20 ppm, MS /MS tolerance = 0,1 Da, Enzyme = trypsin, Missed spaltning = 2, Fast ændring: Carbamidomethyl (C), iTRAQ 4-plex (K), iTRAQ 4-plex (N-term), Variabel ændring: Oxidation (M), FDR≤0.01. I betragtning af at flere MS /MS spektre match til et peptid, normalisering af signalintensiteter af hver MS /MS spektre blev udført for at finde den mest sandsynlige udtryk ratio for et peptid. For kvantitative forandringer blev en 1,2-fold cutoff sat til bestemmelse up-akkumuleret og ned-akkumuleret proteiner, med en p-værdi 0.05.

Bioinformatik analyse

Funktionel analyse af proteiner identificeret blev udført ved hjælp af Gene Ontology (GO) annotation (https://www.geneontology.org/) og proteiner blev kategoriseret efter deres biologiske proces, molekylær funktion og cellulære lokalisering [11]. De forskelligt akkumulerede proteiner blev yderligere tildelt Kyoto Encyclopedia of Gener og genomer (Kegg) database (https://www.genome.jp/kegg/pathway.html) [12].

Resultater

SBP1 induktion i nøgne mus hæmmede tumorvækst af xenografter

SBP1 udtryk niveauer i HCT116-loven og HCT116-TetSBP1 celler blev bestemt ved immunblotting analyse. Som vist i fig 1A, HCT116-TetSBP1 cellelinie udtrykte høje SBP1 efter doxycyclin induktion, sammenlignet med de HCT116-ACT-celler. For at teste, om SBP1 overekspression havde tumor undertrykke funktionen

in vivo

som tidligere rapporteret [13], udførte vi xenograft eksperimenter i CD1 Nu nøgne mus (n = 10 i alt). HCT116-ACT og HCT116-TetSBP1 celler blev behandlet med 1 pg /ml doxycyclin i 72 timer og derefter 2 × 10

6 celler i 100 pi PBS blev injiceret subkutant i 6-8 uger gamle BALB /c CD-1 Nu female mus på forskellige sider, henholdsvis. HCT116-loven var på venstre side og HCT116-TetSBP1 var på den rigtige side. For at opretholde vedvarende induktion af SBP1 blev doxycyclin (200 ug /ml) opløst i 5% sucrose leveres som drikkevand udveksles hver 3 dage. Fire uger efter injektion blev tumorer isoleret, og tumorvægt (g) og volumen (mm

3) blev analyseret. Vi fandt, at tumorstørrelser afledt fra HCT116-TetSBP1 celler var meget mindre end dem i kontrolgruppen HCT116-ACT-celler (Fig 1B og 1C). Endvidere blev tumorer vægt afledt af HCT116-TetSBP1 celler signifikant reduceret sammenlignet med HCT116-loven (Fig 1D). Disse resultater kraftigt antydet, at

in vivo

induktion af SBP1 viste tumor hæmning i mus.

(A) SBP1 fremkaldt af doxycyclin i HCT116-TetSBP1 celler blev valideret af immunoblotanalyse. (B) Fotografier illustrerer repræsentative tumorer i xenotransplantater med SBP1 induktion (TetSBP1, højre) sammenlignet med tumorer uden SBP1 induktion (lov, til venstre). 10 mus i alt. (C-D) SBP1 induktion resulterer i et fald på tumor volumen og vægt. Resultater blev analyseret med t-test og vist som middelværdi ± SD. ** P. 0,01

SBP1 induktion undertrykt tumormetastaser

in vivo

For at undersøge SBP1 hæmning af tumor metastase, den HCT116-loven og HCT116-TetSBP1 celler blev behandlet med 1 pg /ml doxycyclin i 72 timer og derefter 2 × 10

6 celler i 100 pi PBS blev injiceret i de laterale halevener 6-8 uger gamle BALB /c CD-1 Nu hunmus (n = 5 for hver gruppe). For at opretholde vedvarende induktion af SBP1 blev doxycyclin (200 ug /ml) opløst i 5% sucrose leveres som drikkevand udveksles hver 3 dage. Efter 6 uger blev musene bedøvet, og muselunger høstedes, fikseret og dissekeret. Vi fandt, at mus transplanteret med HCT116-ACT-celler havde synlige pulmonære metastatiske knuder, mens ingen mus i HCT116-TetSBP1 gruppen viste synlige lunge metastase (Fig 2A). Efter hematoxylin og eosin (HE) farvning blev antallet af pulmonære metastatiske knuder talt. Resultaterne viste, at mus med SBP1 induktion (HCT116-TetSBP1 gruppe) resulterede i et signifikant fald i pulmonære metastatiske knuder (Fig 2B), hvilket indikerer en metastatisk inhibering af SBP1

in vivo

.

( A) Repræsentative billeder af lunger og hematoxylin og eosin (HE) -staining af lunger isoleret fra mus, som modtog haleveneinjektion af HCT116-Act-celler (ACT) og HCT116-TetSBP1 celler (TetSBP1). Hver gruppe indeholder 5 mus. Pile viser de synlige knuder og metastatiske knuder i lungerne. Scale bar = 200 um. (B) SBP1 induktion hæmmer tumormetastaser

in vivo

. Antallet af pulmonale metastatiske knuder blev talt under mikroskop og analyseret med t-test. Resultaterne er vist som middelværdi ± SD. ** P. 0,01

Kvantitativ identifikation og bioinformatik analyse af tumor væv proteiner analyseret af iTRAQ

For at bestemme mekanismerne i SBP1-medieret hæmning af tumorvækst og metastase i mus, vi udvundet totalt protein fra tumorvæv af HCT116-loven injiceres (lov) og HCT116-TetSBP1 injicerede mus (TetSBP1), og protein profiler blev udført ved hjælp iTRAQ. I sidste ende blev 9147 unikke peptider, 2015 protein grupper og 1975 proteiner identificeret. Fordelingen af ​​længder og antal peptider, masse og sekvensdækning af proteiner er tilvejebragt (S1 tabel).

Ændringerne i proteinet profil som reaktion på SBP1 induktion blev analyseret. 132 proteiner viste en signifikant forskel (p-værdi 0,05) med en FDR på mindre end 1%, herunder 53 opreguleret proteiner og 79 nedreguleret proteiner. Relevant detaljerede oplysninger leveres (S2 Table). Disse differentielt akkumulerede proteiner beriget 1364 anmærkninger gennem GO analyse, og blev klassificeret i tre grupper: biologisk proces, molekylær funktion, og cellulær komponent (figur 3A). De vigtigste kategorier af biologisk proces omfattede cellulær proces, single-organisme proces, biologisk regulering, metaboliske proces og reaktion på stimulus. Baseret på forskellige molekylære funktioner blev disse proteiner opdelt i grupper af binding, katalytisk aktivitet, strukturel molekyle aktivitet, enzym regulator aktivitet, transportør aktivitet og antioxidant aktivitet. Disse proteiner blev også involveret i forskellige cellulære komponenter, herunder celle, organel, makromolekylært kompleks, membran og membran-lukkede lumen. Disse differentielt akkumulerede proteiner blev yderligere klassificeret ved anvendelse af Kegg databasen. De store veje er involveret i differentielt udtrykte proteiner fra SBP1 induktion, herunder transkriptionel fejlagtig regulering i kræft, tight junction, lysosomer, protein forarbejdning i endoplasmatisk reticulum, HIF-1 signalvejen, PI3K-Akt signalvej, veje i kræft, proteoglycaner i kræft , microRNA i kræft, og glykolyse /gluconeogenese, og andre veje. Nyere undersøgelser har vist, at lipid /glucosemetabolisme er stærkt forbundet med carcinogenese [14-17]. Derfor derefter analyseret vi de meste ændrede proteiner, der er knyttet til lipid /glucosemetabolisme fra muse xenotransplantattumorer. Interessant, blev tretten Lipidmetabolisme-relaterede proteiner og syv glukosemetabolismen-relaterede proteiner ændret væsentligt ved SBP1 induktion i mus xenotransplantattumorer. Alle disse lipid /glukosemetabolismen-relaterede proteiner blev illustreret i figur 3B på grundlag af deres biologiske funktioner gennem Gene Ontology (GO) analyse

(A) Alle 132 forskelligt akkumulerede proteiner blev klassificeret i tre grupper:. Biologisk proces, molekylær funktion, og cellulær komponent gennem GO analyse. (B) Antallet af lipid /glukosemetabolismen-relaterede proteiner blev vist gennem GO analyse.

Ændringer af lipid /glukosemetabolismen-associerede proteiner i respons på SBP1 induktion

Som vist i figur 3B, blev tretten lipidmetabolismen-relaterede proteiner valgt, herunder fem opreguleret proteiner og otte nedreguleret proteiner (tabel 1). De mest opreguleres proteiner ved SBP1 induktion inkluderet DKK1 der inhiberer WNT pathway [18], DHCR7 der styrer kolesterol og D-vitamin-syntese [19], ANXA4 der inhiberer NFkB pathway og IL-8 [20], og AGPAT5 der inhiberer brystcancercelleproliferation [21]. Alle disse proteiner er blevet rapporteret at vise potentielle anticancer effekter. Betragtninger, andre proteiner, såsom LPCAT2 der er stærkt udtrykt i inflammatoriske celler [22], BPIFA3 der er stærkt udtrykt i lungekræft [23], PPIA der aktiverer NFkB vej [24], og FABP4 der har pro-angiogene rolle [25 ], blev nedreguleret i SBP1 overekspression xenotransplantattumorer. I modsætning hertil blev der syv glukosemetabolismen-relaterede proteiner betydeligt nedreguleret i SBP1 overekspression xenotransplantattumorer, herunder GAA, GAPDH, ALDH2, Thioredoxin, ENO3, UGDH og Lumican (tabel 2).

Til validere den differentierede ændringer i lipid /glukosemetabolismen-relaterede proteiner analyseret fra iTRAQ proteomisk analyse i mus xenotransplantattumorer blev immunoblotting analyser udført. I overensstemmelse med dem, der observeres fra iTRAQ profil, to proteiner (DKK1 og ANX4) blev signifikant øget og fire proteiner (PPIA, FABP4, ALDH2 og UGDH) blev signifikant reduceret i SBP1 overekspression xenotransplantattumorer (S1 Fig). Den høje konsistens indikerede høj pålidelighed af iTRAQ resultater. MS /MS-data for disse seks proteiner leveres (S2 Fig).

Tumor hæmning af SBP1 var forbundet med flere signalveje

in vivo

For at bestemme de yderligere mekanismer af SBP1 induktion medieret hæmning af tumorvækst og metastase, analyseret vi tumorvækst og metastase-associerede signaleringsveje anvendelse af muse xenograft tumor proteinprøver, som også blev anvendt til iTRAQ proteomisk analyse. Først GPX1 blev nedreguleret i TetSBP1 tumorer (Fig 4), i overensstemmelse med dem, der observeres i humane prostatakræft væv [26], men det var forskellige fra de

in vitro

undersøgelser, der viste, at overekspression SBP1 ikke påvirkede GPX1 protein niveauer i HCT116 celler selvom GPX1 aktiviteter blev signifikant nedreguleret [6]. Dette finde igen foreslået omvendt korrelation mellem SBP1 og GPX1

in vivo

ikke

in vitro

. Sekund, induktion af SBP1 førte til aktivering af JNK1 /Wnt-vejen, med hensyn til øget phosphorylering af JNK1 og c-Jun og nedsat ekspression af beta-catenin og dens downstream mål cyclin D1, især phosphoryleret cyklin D1 blev signifikant nedreguleret ( fig 4). Desuden, beta-catenin inhibitorer p53 (phosphoryleret p53, p-p53) og p21, en direkte nedstrøms target af p53, blev forøget som respons på SBP1 induktion i mus TetSBP1 tumorer (figur 4). For det tredje, induktion af SBP1 ført til en betydelig reduktion af TWIST (Fig 4), en kritisk regulator for EMT og metastase.

Flere typiske markører for forskellige signalveje blev undersøgt ved hjælp iTRAQ proteomisk analyse proteinprøver. Disse kræftrelaterede signalveje reagerer forskelligt på SBP1 induktion.

Diskussion

er der observeret reduceret ekspression af SBP1 i flere typer af humane kræftformer, herunder kolorektal, lunge-, esophageal, mave, bryst og leverkræft, og reduktion af SBP1 er forbundet med dårlig overlevelse [5]. Nedsættelse af SBP1 øget celle motilitet, fremmet celledeling, og undertrykt celledifferentiering

in vitro

, selvom mus med SBP1 genetisk mangel (dvs. SBP1 knockout mus) ikke viste tydelige fænotyper [3,27,28]. I modsætning hertil øgede SBP1 ekspression i celler ved transfektion af SBP1-udtrykkende plasmid kunne fører til degeneration i inhibering af cancercelleproliferation, migration og tumorvækst i immunkompromitterede mus [3,13,29,30]. Vores tidligere undersøgelser har vist, at SBP1 blev reduceret i de fleste kolorektale tumorer sammenlignet med nontumor væv det har variable ekspressionsniveauer i forskellige cancercellelinier [6,13,29]. For eksempel er SBP1 højt udtrykt i LS174T, Caco-2, HT-29 og MCF-7, men ikke påvises i HCT116. Så human coloncancer cellelinie HCT116 blev anvendt til at overudtrykke SBP1 i vores undersøgelse. I denne undersøgelse under anvendelse af et inducerbare system og muse xenograft model, har vi fundet, at

in vivo

induktion af SBP1 viste signifikante anti-cancer effekter, herunder inhiberet tumorvækst og metastase i nøgne mus. Fordele ved at anvende denne SBP1 Tet-on inducerbart gen ekspressionssystem er opført som følger: 1) Denne inducerbart genekspression system gør SBP1 overekspression styrbar, således at cellerne holdes uden SBP1 interferens og transfektionsblandingen skader kan minimeres, når overekspression er behov; 2) I denne undersøgelse SBP1 udtryk har ingen tags modifikation og den udtrykte protein forbliver i naturlig tilstand. Alle disse observation foreslog, at både endogene og ektopisk SBP1 kunne tjene som en potentiel tumor suppressor.

For at bestemme de underliggende molekylære mekanismer, den proteomik teknik iTRAQ label assay blev ansat. Blandt de 1975 identificerede proteiner, blev 132 proteiner udtrykkes forskelligt i SBP1-induceret tumorvæv. Yderligere analyser indsnævret de differentielt udtrykte proteiner i tretten Lipidmetabolisme-relaterede og syv glukosemetabolismen-relaterede proteiner. Blandt de tretten Lipidmetabolisme-relaterede proteiner, fem blev opreguleret (DKK1, HSP60, DHCR7, ANXA4 og AGPAT5) og otte blev nedreguleret (LPCAT2, GPX5, GAPDH, NMe2, ALDH2, BPIFA3, PPIA og FABP4). I de opreguleres proteiner ved SBP1 induktion, er DKK1 kendt som en inhibitor af Wnt /β-catenin pathway [18]. Opregulering af DKK1 kunne aktiv juni N-terminal kinase (JNK) og inducere apoptose [31,32], og kan have en negativ regulere EMT gennem TWIST inhibering [33]. Faktisk har vores tidligere undersøgelser viste, at aktiveret JNK1 også negativt kan regulere β-catenin gennem GSK3-beta [34]. Desuden kunne den forøgede ekspression af DKK1 føre til nedregulering af cyclin D1, en direkte nedstrøms target af beta-catenin. Vores tidligere arbejde har også vist en regulerende samspil mellem JNK1 og p21 [35]. Heri fandt vi, at som reaktion på opregulering af DKK1 og JNK1, p21 og dets opstrøms target p53 blev også forøget (figur 4). Interessant i Wnt /beta-catenin signalvej, der er en negativ regulatorisk vekselvirkning mellem beta-catenin /Cyclin D1 og p53 /p21 [36]. Blandt de validerede Lipidmetabolisme-relaterede proteiner, ANXA4 var opreguleret og PPIA blev nedreguleret. Det er blevet rapporteret, at ANXA4 kunne undertrykker NF-kB transkriptionel aktivitet ved at interagere med NF-kB p50 subunit [20] og cytokiner (fx IL-8 [37]). I modsætning hertil PPIA kunne aktiv NF-kB-vejen og inflammatorisk signalering [24]. Talrige undersøgelser har kraftigt vist, at aktivering af NF-kB og kronisk inflammation spiller afgørende roller i dannelsen af ​​kræft og progression [38]. En anden nedreguleret protein var FABP4. Det er blevet rapporteret, at FABP4 medierer VEGFA-afhængige pro-angiogene virkninger, som er knyttet til HAK signalering under carcinogenese og metastase [25].

Alle syv glukosemetabolismen-relaterede proteiner blev nedreguleret i SBP1 induceret tumorvæv , herunder GAA, GAPDH, ALDH2, Thioredoxin, ENO3, UGDH og Lumican. UGDH (UDP-glucose dehydrogenase) katalyserer oxidationen af ​​UDP-glucose til opnåelse af UDP-glucuronsyre, en precursor af hyaluronsyre (HA) og andre glycosaminoglycaner (GAG) i ekstracellulær matrix. En tidligere undersøgelse har vist, at faldende UGDH hæmmer celle sammenlægning og migration [39]. Det blev endvidere rapporteret, at ALDH2 inaktivering kunne øge cytotoksicitet produceret af lipidperoxidation [40]. Disse resultater antydede, at nedregulering af UGDH og ALDH2 måske kunne tilskrives de anticancer effekter af SBP1.

Sammenfattende ved hjælp af et SBP1 inducerbart system, og

in vivo

musemodel, vores undersøgelser har klart vist, at tumor hæmning roller SBP1 er forbundet med ændringer af lipid /glukosemetabolismen-relaterede proteiner gennem inddragelse af flere signalveje, afslører en ny molekylær mekanisme for tumor hæmning af SBP1.