PLoS ONE: Udnyttelse naturligt forekommende Tumor Immunitet: En klinisk Vaccine Trial i prostatakræft

Abstrakt

Baggrund

Studier af patienter med paraneoplastic neurologiske lidelser (PND) har afsløret, at apoptotisk tumor fungerer som en potentiel potent trigger for indledningen af ​​naturligt forekommende tumor immunitet. Formålet med denne undersøgelse var at vurdere mulighederne, sikkerhed og immunogenicitet af en apoptotisk tumor-autolog dendritiske celle (DC) vaccine.

Metoder og Resultater

Vi har modelleret PND tumor immunitet i et klinisk forsøg, hvor apoptotiske allogene prostata tumorceller blev anvendt til at generere en apoptotisk tumor-autolog dendritiske celle vaccine. Fireogtyve prostatacancerpatienter blev immuniseret i en fase I, at randomiseret, enkelt-blind, placebokontrolleret undersøgelse vurdere sikkerhed og immunogenicitet af vaccinen. Vaccinationer var sikker og veltolereret. Vigtigt er det, vi også fundet, at vaccinen var immunogen, inducere forsinket type overfølsomhed (DTH) responser og CD4 + og CD8 + T-celleproliferation, uden effekt på foxp3 + regulatoriske T-celler. En statistisk signifikant stigning i T-celleproliferation responser til prostatatumorceller

in vitro

(p = 0,002), fald i prostata specifikt antigen (PSA) hældning (p = 0,016), og en to gange stigning i PSA fordoblingstid (p = 0,003) blev identificeret, når vi sammenlignet data før og efter vaccination.

konklusioner

en apoptotisk kræftcelle vaccine modelleret på naturligt forekommende tumor immunrespons i PND patienter giver en sikker og immunogen tumor vaccine. (ClinicalTrials.gov nummer NCT00289341)

Prøve registrering

ClinicalTrials.gov NCT00289341

Henvisning:. Frank MO, Kaufman J, Tian S, Suárez-Fariñas M, Parveen S , BLACHERE NE et al. (2010) Udnyttelse naturligt forekommende Tumor Immunitet: En klinisk Vaccine Trial i prostatakræft. PLoS ONE 5 (9): e12367. doi: 10,1371 /journal.pone.0012367

Redaktør: Torbjørn Ramqvist, Karolinska Institutet, Sverige

Modtaget: Marts 1, 2010; Accepteret: 22 Juni 2010; Udgivet 1. september, 2010

Copyright: © 2010 Frank et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Burroughs Wellcome fonden og Doris Duke Foundation (MLA), National Institutes of Health (NIH) (R01 CA85784 til RBD), Rockefeller University Hospital Klinisk og translationel Science Awards (CTSA) (giver UL1 RR024143) fra National center for Forskning Ressourcer på NIH, at Leslie Misrock Memorial Fund, og David H. Koch. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Tumor immunitet hos patienter med paraneoplastic neurologiske lidelser (PND) er blevet undersøgt med håb om afdækker principper, der kan anvendes til den almindelige befolkning af kræftpatienter [1], [2]. Disse undersøgelser viste tumorantigen-specifik CD8

+ T-celler i det perifere blod af PND patienter [3], [4], men også genereret et paradoks. PND-antigener udtrykkes normalt i hjernen, og er ektopisk udtrykt i tumorer, men er ikke udtrykkes i dendritiske celler (DC’er), der behøves til prime naive T-cellereaktioner. [5] Baseret på observationer med lupus-antigener [6], vi antager, at apoptotiske celler kan tjene som et effektivt middel til antigen overførsel til udviklingslandene og præsentation på MHC i til aktivering af CD8

+ T-celler [7]. Dette viste sig at være korrekt for både tumor [3] og virale antigener [8], og det er sandsynligt, at fagocytose af apoptotiske celler som almindelig måde, hvorpå immunsystemet undersøgelser antigener hele livet. Insights fra studere naturlig tumor immunitet i PND giver et overbevisende grundlag, som at modellere kliniske studier [2], [9], [10].

Flere observationer støtter forslaget om, at apoptotiske tumorceller kan tjene som en potent kilde af antigen til at stimulere værtens immunrespons

in vivo

. Teoretisk alle potentielle tumorantigener inden for en apoptotisk tumor celle, og flere epitoper fra hvert antigen, kan være cross-præsenteret af udviklingslandene, hvor forarbejdet antigen kan placeres på alle (typisk seks) MHC I alleler. Dette indebærer betydelige fordele i forhold til peptid-pulserede DC-protokoller, i hvilke investigator skal have kendskab tumorantigenet og skal vælge specifikke MHC I-begrænsede peptider for antigenstimulering. Antigenpræsentation fra apoptotiske celler er blevet anslået til at være 10.000-50.000 mere effektiv end frit peptid i indlæsning MHC-molekylerne af en DC [11], [12]. Apoptotisk materiale forarbejdes af en fysisk vej: apoptotiske celler er internaliseret af DC-begrænsede receptorer, herunder α

Vp

5 integrin receptor [13], derefter behandles inden DC’er ved forskellige mekanismer, [14]. Disse DC’er derefter generere både MHC I og MHC II peptidepitoper [13], hvilket fører til aktiveringen af ​​både CD8

+ og CD4

+ T-celler. Eftersom evnen af ​​DC’er cross-præsenterende apoptotiske celler til at aktivere effektor CD8

+ T-celler kræver signaler fra CD4 hjælperceller [15], evne apoptotiske materiale, der skal lastes på begge MHC I og MHC II-molekyler er af særlig betydning i betragtning af dets potentiale i immunterapi.

DC’er, der præsenterer apoptotiske tumorceller stimulerer T-celle responser i dyr og

in vitro

[16]. Klinisk flere undersøgelser har anvendt dræbte tumorceller i vaccineforsøg, herunder glia [17] – [21], prostata [22], melanom [23], bryst [24], ovarie- [25] og pædiatriske faste tumorceller [26] (revideret i [9], [16], [27]). Disse undersøgelser har ikke fokuseret på apoptotisk død i sig selv, men snarere har dræbt tumorceller ved forskellige midler (for eksempel frysetørring, eller store mængder UVB og gammabestråling), hvilket fører til var mangelfulde karakteriserede blandinger af nekrotisk og apoptotisk celledød. Fortolkning af disse undersøgelser kompliceres af uenighed om den immunogene styrke af forskellige former for døde celler [28]. Ikke desto mindre har nogle forsøg indikerede potentialet for immunologiske og kliniske respons til autolog DC præsentere døde tumorceller [19], [23]. Her er vi i gang med at mere præcist at teste forholdet mellem induktion af PND-lignende tumor immunrespons og udvikling af en klinisk vaccine. Vi induceret apoptotisk død LNCaP prostatacancerceller, og tilladt dem at blive fagocyteret af autologe dendritiske celler genereret fra prostatacancer patienternes perifere blodmonocytter; sådanne DC’er blev tidligere vist at stimulere både CD8

+ og CD4

+ T-celler

in vitro

[29], og i en B16 muse-melanom model DC’er cross-præsenterende apoptotisk tumor var effektive i forebyggelsen tumorvækst (Blachere et al., upublicerede data). Her rapporterer vi sikkerhed og immunogenicitet af DC /apoptotiske LNCaP prostata tumorceller i et kontrolleret studie af 24 prostata cancer patienter.

Resultater

Undersøgelse Befolkning

Fireogtyve træk egnede patienter blev vaccineret med DC /LNCaP, sammen med kontrol vaccinationer. I alt 28.4-78.9 millioner (gennemsnit 50,3 mio) DC’er cross-præsenterende apoptotisk LNCaP-tumorceller blev givet per patient, delt over 4 doser, hver 2 ugers mellemrum (figur 1). På tidspunktet for undersøgelsen indrejse, 11 af 12 patienter i Arm 1 og 10 ud af 12 patienter i Arm 2 kun havde biokemisk tilbagefald med ingen andre tegn på metastatisk sygdom (tabel 1). Gennemsnitsalderen for patienterne var 62,5 ± 6,7 og 65,7 ± 9,2 år, og den gennemsnitlige Gleason score ved studiets start var 7,25 og 7,17 in Arms 1 og 2.

Patienterne blev screenet og randomiseret til en af ​​to arme hver 12 patienter. Patienterne i begge arme var blind i løbet af vaccine /placebo faser indtil uge 8. Patienter i Arm 1 fortsatte ind i post-vaccine fasen mens patienter i Arm 2 krydsede over i vaccinen fasen før indtastning post-vaccine fase.

DC vaccine egenskaber

DCs blev dyrket sammen med LNCaP eller LNCaP-M1 celler, der var 90% apoptotisk (figur 2). Alle DC vaccinepræparater administreres opfyldt kriterierne for levedygtighed og modenhed (tabel 2 og figur 2). DC-funktion blev overvåget ved allo-MLR; DCs stimuleret 2 × 10

5 allogene T-celler til at indarbejde ≥10

5 CPM af

3H-thymidin på dag 5 efter en 18-timer

3H thymidin puls (data ikke vist).

UV-bestråling (+ UV) specifikt induceret apoptose i LNCaP-celler som angivet ved 96% Caspatag + TOPRO + farvning 38 timer efter UV. DC dyrket sammen med apoptotiske LNCaP celler (vaccine) er modne, med 96% CD83 positive celler. De viste data er repræsentativ for alle 24 vacciner fremstillet.

Sikkerhed

Forekomsten af ​​injektionsstedet og systemiske reaktioner på vaccinen er vist i tabel 3. Ingen vaccine relaterede alvorlige bivirkninger blev observeret. Kun 1 toksicitet var signifikant forskellig mellem placebo og vaccine grupper i det indre blinde fase af undersøgelsen: grad 1 eller 2 injektioner reaktioner, der fandt sted i 11 af 12 patienter i vaccinen (p 0,001), henføres til vaccine (men ikke placebo) genererer DTH-lignende reaktioner. Der var ingen symptomatisk tegn på autoimmun sygdom hos enhver patient, herunder vasculitis, thyroiditis, colitis, neurologisk sygdom, endokrinopati eller kardiomyopati.

Immunrespons

Alle patienter, der fik DC /keyhole limpet hemocyanin (KLH) vaccine havde en positiv DTH reaktion på KLH. Ingen af ​​de 24 patienter havde en reaktion på LNCaP-lysat ved baseline (uge 0). Alle 24 patienter fik LNCaP-lysat som del af DTH paneler ved uge 3, 5, 7, og 9. Seksten af ​​24 patienter (67%) havde en DTH-respons på LNCaP-lysat i mindst 1 af disse 4 tidspunkter, med højeste andel af patienter (54,2%) reagerer på LNCaP-lysat ved 2 uger efter den sidste booster (uge 9). Respons opretholdt i 9 ud af 13 patienter (69%) ved 22 uger efter den sidste booster (uge 29, figur 3). Svarene på LNCaP lysat var statistisk signifikant på alle tidspunkter med et 95% konfidensinterval. Normalt saltvand, givet som en kontrol, var negativ ved alle tidspunkter i alle patienter.

Vaccine induceret DTH reaktion på LNCaP-cellelysater injiceret intradermalt blev målt på de angivne tidspunkter. Uge 1 var baseline, på hvilket tidspunkt ingen patienter havde DTH-responser (data ikke vist). DTH-responser blev betragtet som positive ved ≥5 mm erytem aflæst ved 48 timer efter anbringelse. Barer angiver antallet af patienter med positive reaktioner på hvert tidspunkt. Fejl søjler repræsenterer 95% konfidensintervaller. Punkterede linie repræsenterer tendens i procentdelen af ​​patienter med positive reaktioner på hvert tidspunkt. Statistisk signifikante positive DTH reaktioner på LNCaP cellelysat optrådte på Uge 3 (første tidspunkt efter baseline) og svarene var stadig til stede i 9 af 13 patienter (69%) på 22 uger efter den sidste booster-dosis (Uge 29).

A

3H thymidin proliferationsassay blev anvendt til at vurdere reaktiviteten af ​​T-celler til KLH-proteinet og til prostata tumorceller (enten dem, der anvendes i vaccination (LNCaP) eller til et andet prostata tumorcellelinie (PC3) ). Negative kontrolprøver antigener inkluderet autologe monocytter og et irrelevant cellelinie (3T3). 3T3 inficeret med influenza blev anvendt som positiv kontrol. T-celler blev opsamlet i uge 0 (præ-vaccine) leukaferese og uge 13 (post-vaccine) leukaferese (figur 1). For at være gyldig, skal hver enkelt proliferationsassay have haft en påviselig influenza respons før og efter vaccine. To af 24 patienter havde ingen detekterbar influenza respons og dermed blev udelukket fra analysen. De 22 evaluerbare patienter, betragtet som en gruppe, havde ingen statistisk signifikant forskel i T-celle-respons på influenza, præ- versus post-vaccine (p = 0,310, data ikke vist). Der var en statistisk signifikant T-cellerespons til KLH post-vaccine vs pre-vaccine (p = 0,008), samt til apoptotisk LNCaP (p = 0,017) og apoptotiske PC3-tumorceller (p = 0,011) (figur 4A). Der var ingen statistisk signifikante forskelle i præ- vs post-vaccine T-celle responser på antigen-præsenterende celler (APC’er) alene (p = 0.160) for at kontrollere antigener, 3T3 (p = 0,070) eller autologe monocytter (p = 0,156) (tabel 4, 4a og data ikke vist).

Sammenligning af præ- og post-vaccine bulk-T-celle-responser på prostata-antigen. en. Apoptotiske tumorceller (LNCaP og PC3, eller et irrelevant cellelinie (3T3)) eller KLH-proteinet blev co-dyrket med patientens perifere blodmonocytter og syngene bulk-T-celler opnået fra patienter før eller efter vaccination. Monocytter uden exogent antigen (nr Ag) eller apoptotisk 3T3 celler (Ctrl AG), tjente som negative kontroller. Proliferation blev vurderet på dag 5 efter en 18-timer

3H thymidin puls. Data præsenteret for 22 af 24 patienter. Forskellen i proliferation (post- minus præ-vaccine) for hvert antigen gruppe fremgår af boks plots. Rapporterede værdier er gennemsnitsværdier tællinger per minut (CPM) af tredobbelte brønde. Medianen forskel for hvert antigen gruppen vises af linien i kassen. Hver patient, der er en outlier er angivet med et unikt symbol. Statistisk blev fundet signifikante forskelle i pre-vaccine vs. post-vaccine T-celle proliferative responser for KLH (p = 0,008), LNCaP (p = 0,017) og PC3 (p = 0,011). b. Bulk T-celler opnået efter vaccination blev farvet med CFSE og dyrket med DC’er cross-præsenterende prostata antigener, LNCaP og PC3, eller et irrelevant cellelinie (293-celler, Ctrl Ag). Celleproliferation på dag 5, vurderet ved CFSE farvestof fortynding, vist på x-aksen og CD8-ekspression er vist på y-aksen. Procenter repræsenterer CD8 + celler, der er opdelt i bulk T-celle population. Fire af fem yderligere patienter testede viste lignende CD8 + reaktioner; viste data er for patient # 15.

Baseret på de DTH data (Figur 3), og

3H thymidin spredning data (figur 4a), vi beregnet og rangeret en DTH indeks og et proliferationsindeks at bestemme, om der var en sammenhæng mellem de to. En positiv korrelation blev fundet (0,55 under anvendelse af Spearman rank korrelation test (p = 0,008)), hvilket indikerer, at patienter, som havde positive DTH responser på LNCaP-lysat også tendens til at have T-celleproliferation reaktioner på apoptotiske LNCaP-celler

in vitro

.

spredning respons blev også vurderet af CFSE farvestof fortynding assay [30]. I 5 ud af 6 patienter, blev en CD8 + T-celle respons specifikt for prostata-antigener observeres (figur 4b og data ikke vist). Vi bekræftede, at alle seks patienter testede også havde en CD4 + T-celle respons på prostata-antigener.

Vi overvejede den mulighed, at den forøgede T-celleproliferation respons efter vaccination kan vedrøre et fald i regulatoriske T-celler i omløb. For at bestemme procent af CD4 + -T-celler, som er T regulatoriske celler i præ- og post-vaccinerede blodprøver blev PBMC’er farves og vurderet for Foxp3 ekspression (figur 5). Ingen forskel (p = 0,924) blev fundet i Foxp3 ekspression sammenligne præ- og post-vaccination CD4 + T-celler fra 15 patienter (tabel 4).

a. FACS profil Foxp3 ekspression i præ- og post-vaccinerede perifert blod gated på CD4 + -T-celler. Et repræsentativt patient (# 13) er vist. b. Box afbildninger af procent Foxp3 + celler (gated på CD4 + T-celler) før og efter vaccination i 15 repræsentative patienter, herunder dem på tværs af hele spektret af proliferative reaktioner og ændringer i PSA hældning. Medianen er vist ved +. Outliers er angivet med •. Ingen forskel i pre-vaccine vs. post-vaccine T-celle udtryk for Foxp3 (p = 0,924) blev observeret.

PSA respons

prostata specifikt antigen fordoblingstid (PSADT) blev beregnet for hver patient under hver fase af undersøgelsen. Den mediane fordoblingstid i før-vaccine fase var 4,5 måneder, og det steg til 5,4 og 8,9 måneder i løbet af vaccine og post-vaccine faser hhv. Der var statistisk signifikante forskelle i PSADT mellem før og efter vaccine faser (p = 0,003) og mellem vaccine og post-vaccine faser (p 0,001), men ikke mellem de præ-vaccine og vaccine faser (p = 0,915) .

Vi sammenlignede også hældningen af ​​PSA stigning mellem de 3 studie faser. Atten af ​​23 (78%) evaluerbare patienter havde et fald i PSA hældning mellem før og efter vaccine faser. Når man overvejer alle 23 patienter, der var et statistisk signifikant fald i PSA hældning mellem de præ-vaccine- og efter vaccination faser -0,093 /måned (p = 0,016, figur 6 og tabel 5). Der var ingen statistisk forskel i PSA hældning mellem de præ-vaccine og vaccine faser (-0,018 /måned, p = 0,681) eller vaccine og post-vaccine faser (-0,075 /måned, p = 0,098). Vi vurderet, om denne PSA hældning ændring kunne følge af udviklingen af ​​serum anti-PSA-antistoffer. Præ- og post-vaccine serum blev vurderet ved måling af serum antistofreaktivitet til renset PSA protein på Western blot under anvendelse af PSA monoklonale antistoffer som en positiv kontrol. Vi fandt ingen beviser for antistofreaktivitet til PSA (data ikke vist). Ikke desto mindre kan vi ikke udelukke, at antistoffer er ikke påvises på grund af antigen /antistof-komplekser bliver dannet, og at disse eller anden måde hjulpet i clearing PSA fra serum.

Graf af den gennemsnitlige log

2 (PSA) hældning per undersøgelse fase (fuldt optrukket linie); til sammenligning, en ekstrapolering af den præ-vaccine gennemsnitlige log

2 (PSA) hældning vises (stiplet linje). Baseret på den lineære spline model, den gennemsnitlige ændring i PSA hældning på 23 patienter fra før til efter vaccine faser er -0,093 /måned (p = 0,016). Et patientens PSA-værdier blev ikke medtaget i analysen, da hans pre-vaccine værdier blev påvirket af anden behandling nær starten af ​​studiet deltagelse. Tre andre patienter startede anden behandling enten under eller efter vaccination; PSA værdier opnået efter dette punkt blev ikke medtaget i analysen

Vi stratificeret derefter studiepopulationen med to flere faste effekter på en blandet model og gennemførte en likelihood ratio test.; patienterne, der havde en DTH-respons på LNCaP-lysat havde en signifikant forskellig PSA hældning ændring i forhold til dem, der havde ingen DTH reaktion på LNCaP-lysat (p = 0,004). Seksten ud af 24 patienter havde DTH-responser til LNCaP i mindst én tidspunkt. Denne gruppe af patienter havde en statistisk signifikant ændring i PSA hældning mellem de præ-vaccine og post-vaccine faser (-0,105 /måned, p = 0,020, tabel 6). Otte af 24 patienter havde intet svar til LNCaP-lysat på ethvert tidspunkt, og disse patienter havde ingen statistisk signifikant ændring i hældning mellem de præ-og post-vaccine-faser (-0,033 /måned, p = 0,631). Når vi stratificeret studiepopulationen i 2 grupper baseret på PSA-værdi ved undersøgelsens start, er sandsynligheden kvotientkriteriet angivet en væsentligt anderledes PSA hældning skift mellem disse to grupper (p 0,001). Med den blandede model, fandt vi, at dem, der havde en PSA ≥1 ng /ml ved undersøgelsens start (15 patienter) havde en signifikant PSA hældning skift mellem før til efter vaccine fase (-0,099 /måned, p = 0,031, tabel 6), mens en undergruppe af patienter, der havde en PSA 1 ng /ml ved indgang i undersøgelsen (8 patienter) ikke gjorde (-0,078 /måned, p = 0,279). Tilsammen viser disse data, at undersøgelsens patienter tages som en gruppe havde en betydelig nedsættelse af stigningen af ​​PSA efter vaccinationen, og at denne effekt var særlig tydeligt i dem med immunologisk respons og lettere målbar sygdom.

diskussion

Patienter med PND udvikle effektiv tumor undertrykkelse af almindelige cancertyper [2], der sandsynligvis vil blive udløst af immun anerkendelse af ektopisk udtryk for neuronale proteiner, som disse kræftformer. Der udløser sådanne immunresponser, vi hypotese og viste, at apoptotisk tumor fungerer som en potent kilde af antigen til præsentation af APC’er [7], [29]. Fokus for denne undersøgelse var at evaluere sikkerhed og immunogenicitet efterligne dette middel til at udløse tumor immunitet ved hjælp af prostata kræftpatienters DCs tværs præsentere apoptotiske tumorceller som en kræft-vaccine.

På trods af den begrebsmæssige forbindelse mellem udvikling af apoptotiske celler som en vaccine og tumor immunitet i PND, fandt vi ingen beviser for, at denne tilgang udløste autoimmun sygdom i vores patienter. Vi bemærke små ANA stigninger skrive vaccine i 5 patienter (titer af 1:160 hos én patient, ≤1:80 i fire patienter), som løses over tid i 4/5 patienter. Men vi bemærkede også, at af 7 patienter med påviselige ANA niveauet fra før vaccination, 5 blev lavere efter vaccination. Statistisk analyse af ANA ændrer pre versus indlæg vaccine /placebo i Arm 1 versus Arm 2 afslørede ingen signifikante forskelle (Fishers eksakte test), og vi konkludere, at ANA ændringerne ikke var klinisk betydningsfuld; desuden har sådanne forbigående respons almindeligvis blevet set i DC baserede vacciner [26], [31], [32]. En grund til, at vi valgte prostatakræft som en indledende tumor for at studere ved hjælp af denne vaccine tilgang er, at disse tumorer sjældent er forbundet med PND. På trods af vaccinens sikkerhed her, udvises forsigtighed i at udvide denne tilgang til patienter, huser tumorer kendt for at være forbundet med PND (f.eks gynækologiske tumorer, der udtrykker CDR2 eller Nova antigener og småcellet lungekræft der udtrykker Hu antigen) [1], [2].

Vores dendritiske celle /apoptotisk tumor vaccine var immunogene. Sixty-syv procent af patienterne udviklede DTH responser på LNCaP antigener. Endvidere blev disse DTH-responser positivt korreleret med post-vaccine bulk-T-celleproliferation responser. Dette høje immunogenicitet var den samme som rapporteret i andre studier af peptid-pulserede eller tumor celleassocieret DC vacciner. Vigtigere er, disse responser inkluderet CD8 + T-cellereaktioner på prostata tumorceller (figur 4b). Dette er væsentligt, som en kritisk faktor for vellykket tumorvacciner sandsynligvis er induktion af CD8 + T-cellereaktioner [33]. Evnen til at detektere sådanne svar her er konsistent med den iagttagelse, at cross-præsentation af apoptotiske celler er i stand til at stimulere naive og memory CD8 + T-cellereaktioner på tumorceller [3] eller til viralt inficerede celler [8]

ex vivo

. På grund af karakteren af ​​sygdommen, autologe tumorceller var ikke tilgængelig til testning T-cellereaktioner. Men både CD4 og CD8 proliferationsresponser blev påvist til prostata tumorcellelinjer, til trods for de høje baggrundsresponser set i T-celler efter vaccination (figur 4a). Sådanne baggrund respons er set før i DC-baserede vacciner og er af usikker ætiologi [34], og kan komme til udtryk i forbigående stigninger i ANA set hos nogle patienter. Det er sandsynligt, at patienterne havde variable immunreaktioner på tumoren vaccination, enten som følge af iboende forskelle i immun repertoire, eller fra handlinger tumoren selv at modificere patientens immunrespons [35].

Betydeligt, fandt vi, at PSA skråninger faldt og PSADT steg efter vaccination i vores patientgruppe som helhed (p = 0,016). Vi antager, at hvis denne korrelation var relateret til immunogeniciteten af ​​vaccinen, bør PSA ændringer være til stede i undergruppen af ​​patienter, der viser immunogen respons på vaccinen, men ikke i dem, der ikke gør. Faktisk patienter, som havde DTH reaktioner på LNCaP efter vaccination havde signifikante fald i PSA hældning (p = 0,020) sammenlignet med patienter, der ikke har DTH-responser (p = 0,631). Tilsammen vores data antyder, at de ændringer, der ses i PSA hældning repræsenterer en immunrespons på patientens tumorceller

in vivo

.

Selvom variabel immunologisk og kliniske responser er blevet rapporteret at vacciner under anvendelse døde tumor celler som en kilde til antigen, har disse undersøgelser ikke fokuseret på anvendelse af rene, veldefinerede populationer af apoptotiske tumorceller. Vi anvendte UV-B-bestråling for at inducere apoptotisk (ikke nekrotisk) død i 90% af prostata-cellelinien anvendes til vaccine; ikke desto mindre, vores bivirkningsprofil var meget lav, i lighed med andre tumorvacciner. De fleste andre studier har brugt gammastråling eller fryse-optøning, genererer variable blandinger af apoptotiske og nekrotiske celler, som kan ligge til grund for forskelle i immunogen potentiale [28].

Samlet set resultaterne i denne undersøgelse giver indledende sikkerhed og immunogenicitetsdata for en vaccine efterligne hvad vi tror er en kritisk udløser naturligt forekommende effektive tumor immunrespons ses i PND patienter. Disse svar korrelerer med en klinisk relevant respons på patientens tumor, som vurderet af meget statistisk signifikante effekter på PSA hældning og fordoblingstid. Disse observationer tyder på, at denne vaccination tilgang garanterer yderligere udforskning som en sikker og potent middel til at udløse tumor immunrespons i den almindelige befolkning af kræftpatienter. Fremtidige vaccine ændringer, der skal overvejes, er tilsætning af immunadjuvanser under vaccinefremstilling ex vivo eller i forbindelse med vaccine administration in vivo [9], [36], eller anvendelse af autolog tumor som en kilde til apoptotisk antigen. Endvidere kan en sikker fremgangsmåde ved at vaccinere mod prostata (eller andre) cancere tjene på en synergistisk måde med andre immunstimulerende midler, såsom CTLA4-lg, som viser lovende resultater i kombinerede immunterapier i prostata [37] og andre kræftformer [ ,,,0],38]

Metoder

protokollen for dette forsøg og støtte CONSORT tjekliste er tilgængelige som underbyggende oplysninger.; se Tjekliste S1 og protokol S1.

Patienter og Study Design

Etik erklæring.

Undersøgelsen blev godkendt af The Rockefeller University Institutional Review Board (RDA-0466) og FDA (IND 10710). Skriftligt samtykke blev opnået fra alle patienter. Nej

de novo

cellelinjer blev genereret i denne undersøgelse

Study Design

Undersøgelsen blev foretaget ved Rockefeller University i New York..; fireogtyve patienter i alderen 53 til 81 blev inkluderet mellem november 2003 og februar 2006. Alle forfattere stå inde for fuldstændigheden og nøjagtigheden af ​​de data og analysen og deltog i at skrive artiklen.

Fireogtyve patienter var tilfældigt henføres til en af ​​to arme med henblik på at vurdere vaccine sikkerhed, vores primære endpoint (figur 1). Alle patienter blev blændet. Tolv patienter tildelt til arm 1 modtog vaccine efterfulgt af 3 vaccine boosts ved 2-ugers intervaller, for i alt fire injektioner over otte uger, og blev afblindes efter den sidste booster. Tolv patienter tildelt Arm 2 modtog placebo (vehikel (5% DMSO i saltvand)) for hver af fire injektioner, var ublindet, krydsede over til vaccinen fase, og modtog vaccine efterfulgt af 3 boosts ved 2-ugers intervaller. Efter den sidste booster, blev patienterne i begge grupper blev fulgt i op til 22 uger. Alle tidspunkter i begge arme op til og med dagen for den første vaccination med DC-vaccine blev betragtet pre-vaccine fase. Alle tidspunkter fra den første booster gennem den første opfølgning besøg efter den endelige vaccination (uge 9) blev anset vaccine fase. Alle resterende tidspunkter i undersøgelsen, blev betragtet som post-vaccine fase. Sikkerhedsdata blev sammenlignet mellem de 2 arme af undersøgelsen, mens immun- og PSA data blev vurderet af sammenligninger mellem før og efter vaccine faser i alle 24 patienter.

Patient Valg og Vaccination.

Patienterne var berettiget til at deltage, hvis de leveres informeret samtykke, havde biopsi bevist prostatakræft og progressiv sygdom: PSA dokumenteret at være stigende på 3 gange, enten trods kastrationsniveauer testosteronniveauer (under 50 ng /dl) eller på trods af endelig lokal terapi (prostatektomi , stråling osv). Eksklusionskriterier inkluderet forudgående biologisk behandling med dendritiske celler, autoimmun sygdom, eller betydelig større organ sygdom.

DC vacciner blev givet sammen med DTH paneler og patienter blev nøje observeret i en time. Patienterne returnerede til klinikken på 48 timer, på hvilket tidspunkt de blev undersøgt klinisk og deres DTH responser blev læst. Vacciner blev administreret i en celle dosis i intervallet 2-10 × 10

6 DC’er /vaccination, givet subkutant i den indre del af overarmen, ca 6-8 cm fra armhulen lymfeknuder. Patienterne fik en priming og tre hver anden uge boostervaccinationer. I løbet af de to første injektioner, fik patienterne også 2-10 × 10

6 DC /KLH.

Vaccine

Vaccine blev fremstillet i et BSL-2 anlæg vedligeholdes og revideres uafhængigt at mødes Gode ​​Tissue Practice specifikationer. Til fremstilling autologe dendritiske celler, mononukleære celler fra perifert blod (PBMC’er) blev opnået ved leukaferese, klæbet til endotoksinfrit vævstype-dyrkningsskåle (Falcon), og differentieres

in vitro

til umodne DC’er over seks dage i RPMI-1640 suppleret med 1% autologt plasma, GM-CSF (180 ng /ml; Bayer HealthCare Pharmaceuticals) og IL-4 (10 mg /ml; R 90% af cellerne undergik apoptotisk død (Caspatag positiv, som beskrevet [29]). Umodne DC’er og apoptotisk LNCaP blev co-dyrket i et forhold på 1:01 i 36-48 timer i nærvær af PGE

2 (20 mM, Sigma) og TNF-a (150 ng /ml; R at passere kriterier release HLA-DR (DC) celle fraktion skulle være 70% CD83 +, 15% CD14 + og 20% propidiumiodid (PI) + (Serologicals). Alle antistoffer blev indkøbt fra BD Pharmingen. Sterilitet blev testet ved gram pletten, ved dyrkning for bakteriel og svampekontaminering (BacT /ALERT, Biomereux), og ved hjælp af DNA fluorochrom for mycoplasma (Bionique Testing Laboratories, Inc.). LAL-metoden (Associates of Cape Cod) blev anvendt til at teste for endotoksin. Slutproduktet blev opdelt i 4 lige store portioner, der hver indeholder 2-10 × 10

6 DC’er hver.