PLoS ONE: CD166 /ALCAM Expression er karakteristisk for tumorgenicitet og invasive og migrerende aktiviteter kræft i bugspytkirtlen Cells

Abstrakt

Baggrund

CD166, også kendt som aktiveret leukocyt celleadhæsionsmolekyle (ALCAM) , udtrykkes af forskellige celler i flere væv, herunder cancer. Imidlertid rolle CD166 i maligne tumorer er kontroversiel, især i bugspytkirtelkræft. Denne undersøgelse havde til formål at klarlægge, hvilken rolle og betydning CD166 ekspressionen i bugspytkirtelkræft.

Metoder

Vi udførte immunhistokemi og flowcytometri til at analysere ekspressionen af ​​CD166 i kirurgiske pancreas væv og kræft i bugspytkirtlen cellelinjer . Forskellene mellem isolerede CD166 + og CD166- bugspytkirtelkræftceller blev analyseret ved invasion og migration analyser, og i muse xenograftmodeller. Vi udførte også kvantitativ RT-PCR og microarray-analyser til at vurdere ekspressionsniveauerne af CD166 og relaterede gener i dyrkede celler.

Resultater

Immunhistokemi afslørede høj ekspression af CD166 i bugspytkirtelkræft væv (12,2% ; 12/98) sammenlignes med den i normale bugspytkirtel kontroller (0%; 0/17) (p = 0,0435). Flowcytometri tilkendegivet, at CD166 blev udtrykt i 33,8-70,2% af cellerne i kirurgiske pancreas væv og 0-99,5% af kræft i bugspytkirtlen cellelinjer. Invasion og migration analyser viste, at CD166- bugspytkirtelkræftceller viste stærkere invasive og vandrende aktiviteter end dem af CD166 + cancerceller (p 0,05). På den anden side viste CD166 + Panc-1-celler en markant stærkere kolonidannelse aktivitet end den for CD166- Panc-1-celler (p 0,05).

In vivo

analyse viste, at CD166 + celler fremkaldte signifikant større tumorvækst end CD166- celler (p 0,05) i både subkutan og ortotopisk musetumormodeller. mRNA-ekspression af epitel-mesenkymale overgang aktivator Zeb1 blev overudtrykt i CD166- celler (p 0,001). Microarray analyse viste, at TSPAN8 og BST2 var overudtrykt i CD166 + celler, mens BMP7 og Col6A1 var overudtrykt i CD166- celler.

Konklusioner

CD166 + bugspytkirtelkræftceller er stærkt tumorigene, mens CD166- bugspytkirtelkræftceller udviser forholdsvis stærkere invasive og vandrende aktiviteter. Disse resultater tyder på, at CD166 udtryk er relateret til forskellige funktioner i bugspytkirtelkræftceller

Henvisning:. Fujiwara K, Ohuchida K, Sada M, Horioka K, Ulrich CD III, Shindo K, et al. (2014) CD166 /ALCAM Expression er karakteristisk for tumorgenicitet og invasive og migrerende aktiviteter bugspytkirtelkræftceller. PLoS ONE 9 (9): e107247. doi: 10,1371 /journal.pone.0107247

Redaktør: Dhyan Chandra, Roswell Park Cancer Institute, USA

Modtaget 11. april 2014 Accepteret: August 8, 2014; Udgivet: 15 September, 2014

Copyright: © 2014 Fujiwara et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Microarray data er tilgængelige fra Gene Expression Omnibus (GEO) i NCBI (tiltrædelse nummer GSE55294)

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet delvist af tilskud-in-Aid fra Ministeriet for Undervisning, Kultur, Sport, Videnskab and Technology of Japan (Grant nummer: 23.390.327, 24.390.318, 24.390.319, 25.670.584, 25.670.585, 25.670.586, 241.237) og Fukuoka Foundation for Sound Health (https://www.jsps.go.jp/english/e-grants/) ( https://www.sukoken.or.jp/). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i bugspytkirtlen er en af ​​de mest dødelige menneskelige maligniteter, med en 5-års overlevelse på mindre end 5% [1]. Denne dårligt resultat skyldes primært tidlig diagnose er ualmindeligt og konventionelle lægemidler, såsom kirurgisk resektion, kemoterapi og strålebehandling har begrænset effekt [1], [2]. Derfor er der et akut behov for nye strategier for kræftbehandling. Senest har begrebet cancer stamceller (CSCS) modtog betydelig opmærksomhed. CSCS omfatte en meget lille population af cancerceller, der har evnen til at initiere og opretholde dannelse tumor [3]. Følgelig målrettet terapi af denne lille cellepopulation i cancer kan være mere effektiv end de nuværende behandlinger, herunder dem, for pancreascancer.

CD166, også kendt som aktiveret leukocyt celleadhæsionsmolekyle (ALCAM), er et medlem af immunglobulin superfamilien [4]. Det er påviselig i en lang række celletyper, herunder epitelceller, lymfoide celler, myeloide celler, fibroblaster, nerveceller, hepatocytter og knoglemarvsceller [5]. CD166 er blevet rapporteret at være en markør for CSCS i coloncancer og prostatacancer, hvilket indikerer stærk tumorigenicitet [6], [7]. Desuden er dens overekspression blevet rapporteret som en uafhængig prognostisk markør for nogle kræftformer [8]. På den anden side har inhibering af CD166 blevet vist at forbedre invasive og vandrende aktiviteter i ovariekarcinom og glioblastomaceller [9], [10]. I kræft i bugspytkirtlen, har der været indberettet på forholdet mellem CD166 udtryk og prognose data, men det er stadig kontroversiel [11] – [13]

I den foreliggende undersøgelse, vi evaluerede betydningen af ​​CD166-ekspression. i kræft i bugspytkirtlen. Vi fandt, at CD166 + bugspytkirtelkræftceller udstillet stærkere tumorgenicitet end CD166- celler, hvorimod CD166- bugspytkirtelkræftceller udstillet forholdsvis stærkere invasive og vandrende aktiviteter. Disse resultater tyder på, at CD166 udtryk er relateret til forskellige funktioner i bugspytkirtelkræftceller.

Materialer og metoder

Etik erklæring

Denne undersøgelse blev godkendt af den etiske komité i Kyushu University (godkendelsesnummer: 24-222) og udført i overensstemmelse med de etiske retningslinjer for human Genome /Gene Research vedtaget af den japanske regering og Helsinki-erklæringen. Alle patienter skal have underskrevet informeret samtykke om godkendelse af brugen af ​​deres væv til uspecificerede forskningsformål. Mus eksperimenter blev godkendt af den etiske komité i Kyushu University (godkendelsesnummer: A-24-262-0). Dyrene blev opstaldet under specifikke patogenfrie betingelser.

Patienter og pancreas væv

bugspytkirtelkræft væv blev opnået fra patienter, som gennemgik bugspytkirtlen resektion på vores institution. For immunhistokemi blev prøver indsamlet fra 98 bugspytkirtlen kræftpatienter, herunder 62 mænd og 36 kvinder med en gennemsnitsalder på 65,2 år (spændvidde: 36-81 år). De klinisk-patologiske karakteristika for de patienter er beskrevet i tabel 1. Samlet overlevelse var baseret på datoen for operationen til dødsdagen eller sidste opfølgning. Prognoser blev bestemt i september 2013. Den mediane samlede overlevelse var 16 måneder (interval: 1-135 måneder). Sixty-seks patienter overlevede ikke for opfølgningen. Tilstødende væv til prøverne blev evalueret histologisk ifølge kriterierne af World Health Organization. Tumoren fase blev vurderet i henhold til klassificeringen af ​​Unionen for International Cancer Control. Som kontrol væv, vi opnåede 17 normale pancreas vævsprøver fra intakte pancreas, der blev reseceret for galdegang kræft, neuroendokrin tumor, eller benign faststof-pseudopapillary tumor. For flowcytometrisk analyse blev pancreas cancer væv indsamlet fra fem patienter, herunder tre mænd og to kvinder med en gennemsnitsalder på 62,0 år (interval = 37-80 år), som var blevet resektion på vores institution mellem juli 2013 og november 2013.

Immunohistokemiske procedurer og evaluering

CD166 blev detekteret under anvendelse af et monoklonalt muse-antistof (klon MOG /07, 1: 450; Novocastra, Newcastle upon Tyne, UK) ved inkubation natten over ved 4 ° C. Envision systemet (Dako, Glostrup, Danmark) blev anvendt til at visualisere immunfarvning. Celler blev vurderet positivt immunfarvet når membranen eller cytoplasmaet var plettet. Væv uden farvning eller svage og moderate farvning intensiteter i 70% og 30% af celler, henholdsvis blev betragtet som CD166

lav. CD166

høj fik væv med svage og moderate farvningsintensiteter i ≥70% og ≥30% af celler. Sektioner blev evalueret uafhængigt af to efterforskere uden nogen viden om de kliniske funktioner i hvert enkelt tilfælde.

Celler og dyrkningsbetingelser

Humane bugspytkirtlen celler blev adskilt fra kirurgiske pancreas væv ved hjælp af en Tumor Dissociation Kit (human ) og gentleMACS Dissociator (Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, Tyskland) ifølge producentens instruktioner. Umiddelbart efter dissociation, blev cellerne analyseret ved flowcytometri. Derudover har vi analyseret følgende ni bugspytkirtelkræft cellelinjer: BxPC3, CFPac-1, SW1990, AsPC1, og Capan-2 (American Type Culture Collection, Manassas, Va); Panc-1 (Riken, Tsukuba, Japan); MiaPaCa2, SUIT-2, og KP-2 (Health Science Research Resources Bank, Osaka, Japan). Vi analyserede også to normale pankreatiske duktale epiteliale cellelinjer: en human primær normal pancreas epitelcellelinje, CS-PE (DS Pharma Biomedical Co, Osaka, Japan), og en udødeliggjort pancreatisk ductal epitelcellelinje, HPDE6-E6E7 klon 6 ( en gave fra Dr. Ming-Sound Tsao, University of Toronto, Toronto, Canada). Desuden blev humane pancreas stjemeformige celler (PSC) isoleret fra friske pancreas prøver vha udvæksten metoden [14]. Den metastatiske SUIT-2-cellelinje er tidligere etableret i vores laboratorium [15]. Den samme fremgangsmåde blev anvendt til at etablere den metastatiske Panc-1-cellelinien. Celler blev holdt som tidligere beskrevet [16].

Flowcytometrisk analyse og celleseparation ved immunreaktivitet

Celler fra subkonfluente monolagskulturer blev suspenderet i phosphatbufret saltvand (PBS) og inkuberet med monoklonalt anti -human ALCAM-phycoerythrin (PE) (R BD Biosciences, Bedford, MA) -belagt transwell kamre med 8 um porer (BD Biosciences) som tidligere beskrevet [16], [17]. Kræftceller (5 × 10

4 celler /0,25 ml) blev podet i de øvre kamre og inkuberet i 24 timer (Panc-1-celler) 48 timer (SW1990 celler) eller 72 timer (til jakkesæt-2-celler). Kræftceller, migreret til den nedre overflade af membranerne blev fikseret med 70% ethanol, farvet med hematoxylin og eosin (H var 20 celler talt og afbildes under et lysmikroskop. Eksperimentet blev udført to gange.

Adhæsion assay

Adhæsionen assay blev udført som beskrevet i en tidligere undersøgelse [12] med mindre modifikationer. Celler blev podet ved en tæthed på 1 x 10

6 celler /brønd i 24-brønds plader (Becton Dickinson Labware). Efter 60 min blev cellerne vasket med PBS for at fjerne ikke-adhærerende celler. De klæbende celler blev farvet med krystalviolet og talt under et lysmikroskop. Alle betingelser blev testet firdobbelt, og forsøget blev udført to gange.

In vivo eksperimenter

Fem uger gamle nøgne hunmus blev implanteret subkutant eller orthotopisk med cancerceller suspenderet i 100 pi PBS som tidligere beskrevet [19]. Tredimensionale diametre blev målt til at beregne tumorvolumen. Musene blev aflivet på angivne dato og subkutane eller ortotopisk tumorer blev udskåret og vejet. For flowcytometrisk analyse blev tumorceller dissocieret ved hjælp af Tumor Dissociation Kit (human) og gentleMACS Dissociator.

Silencing af CD166-ekspression af små interfererende RNA

Kræftceller på ca. 90% sammenløb blev transficeret med CD166-7 (SI02780169) små interfererende RNA (siRNA) (Qiagen, Tokyo, Japan) ved elektroporation under anvendelse af Nucleofector System (Lonza, Bazel, Schweiz) i overensstemmelse med producentens anvisninger. For at verificere knockdown specificitet, brugte vi en kontrol siRNA (Qiagen). Cellerne blev anvendt i efterfølgende forsøg på 24-144 timer efter transfektion.

Kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR)

Totalt RNA blev ekstraheret fra dyrkede celler under anvendelse af et High Pure RNA Isolation Kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland) og DNase i (Roche Diagnostics) behandling ifølge producentens anvisninger. QRT-PCR blev udført under anvendelse af en QuantiTect SYBR Green Reverse Transcription-PCR-kittet (Qiagen) og CFX96 Real-Time PCR System (Bio-Rad Laboratories). Primere blev indkøbt fra Takara Bio Inc. (Tokyo, Japan). Primersekvenser er vist i tabel 2. Hver reaktionsblanding blev først inkuberet ved 50 ° C i 30 minutter til revers transkription til at syntetisere første-streng komplementær DNA ved priming det totale RNA med en genspecifik primer. PCR blev initieret ved inkubering ved 95 ° C i 15 minutter for at aktivere polymerasen, efterfulgt af 40 cykler ved 95 ° C i 5 s, 60 ° C i 20 s og 72 ° C i 30 s. Genes ekspressionsniveauer blev beregnet under anvendelse af en standardkurve konstrueret med totalt RNA fra Panc-1, SUIT-2 eller specifikke PSC. Ekspressionsniveauerne af gener blev normaliseret til dem af β-actin som en intern kontrol og udtrykt som forholdet mellem mål-genekspression til p-actin-ekspression. Alle prøver blev kørt tredobbelt, og hver prøve blev analyseret mindst to gange. Ingen påviselige PCR-produkter blev amplificeret uden forudgående revers transkription. Nøjagtigheden og integritet PCR-produkterne blev bekræftet ved hjælp af en Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies Inc, Palo Alto, CA).

Microarray analyser

Vi udførte microarray analyser af CD166 + og CD166- celler afledt fra både Panc-1 og SW1990 cellelinier. Kvaliteten af ​​RNA-prøver blev vurderet ved anvendelse af Agilent 2100 Bioanalyzer. En human HT-12v4 Expression BeadChip (Illumina, San Diego, CA) blev anvendt til analyserne. Data blev analyseret under anvendelse BeadStudio softwareversion 3.2.3 (Illumina).

Statistisk analyse

Værdierne er udtrykt som middelværdi ± standardafvigelse. Sammenligninger mellem to grupper blev foretaget ved anvendelse af Student t-test. Statistisk signifikans blev defineret som p 0,05. Den χ2 test blev anvendt til at analysere sammenhængen mellem CD166 ekspression og klinisk-patologiske karakteristika observeret i den immunhistokemiske undersøgelse. Overlevelse blev beregnet ved Kaplan-Meier-analyse, og overlevelseskurverne blev sammenlignet under anvendelse af log-rank test. Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af JMP 9.0.2 software (SAS Institute, Cary, NC).

Resultater

Tilfælde af kræft i bugspytkirtlen er ofte CD166

Høj

immunohistokemisk farvning for CD166 blev udført under anvendelse af kirurgisk resektion pancreas væv (figur 1A). I overensstemmelse med en tidligere undersøgelse fandt vi stærke CD166 farvning i ø-celler og moderat farvning i nerver som positive kontroller [11] – [13]. I nogle tilfælde blev CD166 udtrykkes moderat i acinære celler. I 17 normale pancreas vævsprøver, gjorde pancreas duktale epitelceller ikke udtrykke CD166 eller viste svag CD166 udtryk. Alle normale pancreas væv blev identificeret som CD166

lav. I bugspytkirtelkræft væv blev nogle kræftceller farvet moderat til CD166, og vi identificerede 12,2% (12/98) af kræft i bugspytkirtlen væv som CD166

høj. Procentdelen af ​​CD166

høje bugspytkirtelkræft væv var betydeligt højere end i normale pancreas væv (p = 0,0435). I bugspytkirtelkræft væv, fandt vi, at CD166 ekspressionen var forbundet med perineurale invasion (p = 0,037, tabel S1), men ikke prognose hjælp Kaplan-Meier overlevelsesanalyse (p = 0,1473, Figur 1B).

(A ) Immunohistokemisk farvning for CD166 blev udført under anvendelse resekteret pancreas væv. (A) I de normale bugspytkirtlen blev CD166 udtrykkes kraftigt i membranen af ​​ø-celler (sorte pile) og svagt i normale pancreas ductusceller celler (sort pilespids). (B) I nogle bugspytkirtelkræft væv, cancerceller var positive for CD166. Original forstørrelse: 200 ×. Mellemværker: 600 ×. (B) Kaplan-Meier overlevelse analyse afslørede, at intensiteten af ​​CD166 ekspression i pancreascancer ikke var korreleret med prognose (p = 0,1473). (C) Flowcytometrisk analyse af CD166 ekspression i celler separerede baseret på EpCAM ekspression. Den positive udtryk rate (%) er angivet for hvert markør.

Vi har også evalueret CD166expression i pancreas væv ved flowcytometri. I pancreas cancer væv, den CD166 + sats varierede fra 15,2 til 45,3% (middelværdi = 29,1%). Fordi CD166 udtrykkes i forskellige typer af celler [5], anvendte vi epitel celleadhæsionsmolekyle (EpCAM), som udtrykkes udelukkende i epitel og epiteliale-afledte neoplasmer, at udelukke ikke-epitelvæv fra analysen. Blandt EpCAM + celler (10-56,5% af celler, middelværdi = 20,6%), den positive rate af CD166 varierede fra 33,8% til 70,2% (middelværdi = 47,9%) (figur 1C). Der var ingen signifikant forskel mellem CD166 og EpCAM positivitet satser (p = 0,3488).

CD166 Expression i humane bugspytkirtelkræft cellelinjer

Næste, vi analyserede CD166 + sats i bugspytkirtelkræft cellelinjer af flowcytometri, og fundet, at CD166 blev udtrykt i en lang række celler (0-99,5%) (figur 2A). Især blev ingen sammenhæng fundet mellem CD166 + sats og maligne potentialer, såsom invasion, migration, og spredning, hvilket er på niveau med resultaterne i en tidligere rapport (tabel S2 og figur S1) [20]. For yderligere at vurdere betydningen af ​​CD166-ekspression i bugspytkirtelkræft, vi analyserede SW1990 og Panc-1 celler blandt hvilke 77,7-99,3% (middelværdi = 86,4%) og 38,5-54,0% (middelværdi = 46,9%) udtrykte CD166 hhv. Efter adskillelse af CD166 + og CD166- subpopulationer, kontrolleres vi CD166 udtryk ugentligt i forældrenes, CD166 +, og CD166- celler over en 6-ugers periode (figur 2B, C). Den CD166 + rente ikke ændres væsentligt i CD166 + celler, mens der i både forældre- og CD166- celler øges gradvist. Notatet vi ikke observere tydelige morfologiske forskelle mellem CD166 + og CD166- Panc-1 celler (figur 2D).

(A) CD166 positivitet satser i to normale pancreas kanalen epiteliale cellelinjer, bugspytkirtelkræft cellelinjer, og pancreas stjerneformige celler (kvikskranker). (B, C) SW1990 (B) og Panc-1 (C) celler (parentale celler) blev adskilt baseret på CD166 ekspression (CD166 + og CD166-) af en AutoMACS PRO separator. Ændringer i CD166 udtryk i forældrenes og CD166 +/- subpopulationer blev overvåget ofte ved flowcytometri over 6 uger. (D) Morfologi af Panc-1-celler separeres baseret på CD166 ekspression. Original forstørrelse:. 40 ×

CD166- celler viser høje invasive og vandrende aktiviteter, hvorimod CD166 + celler vise en stærkere kolonidannelse aktivitet

For at udforske virkningerne af CD166 i bugspytkirtelkræft, forskellige cancerassocierede processer blev testet i pancreas cellelinier, der blev adskilt baseret på CD166 ekspression. Vi sammenlignede de invasive og migrerende evner CD166 + og CD166- celler afledt fra både SW1990 og Panc-1 cellelinier. CD166- SW1990 og CD166- Panc-1 celler udviste signifikant større celle invasion end deres CD166 + celle modparter (p 0,05, figur 3A). Desuden CD166- celler udviste en markant forøget vandrende potentiale sammenlignet med CD166 + celler fra både SW1990 og Panc-1 cellelinier (p 0,05, figur 3B). Ved hjælp af en proliferationsassay, fandt vi, at CD166 + celler viste større proliferative aktivitet end den for CD166- celler fra SW1990 cellelinje (p 0,0001), men ikke CD166- celler fra Panc-1 cellelinje (figur 3C). I kolonidannelse assayet, viste CD166 + Panc-1-celler en markant stærkere kolonidannelse aktivitet end den for CD166- Panc-1-celler (p 0,05; figur 3D). I området dannelse og adhæsionsassays, fandtes ingen forskelle mellem kapacitet CD166 + og CD166- Panc-1 celler (figur 3E og 3F).

(A) Invasion analyser af CD166 + og CD166- celler afledt SW1990 og Panc-1 cellelinier blev udført ved at dyrke cellerne på Matrigelcoatede Transwell skær. Efter de angivne tidspunkter blev cellerne på den nedre membran af inserterne farvet med H *,

s

0,05; **,

s

0,01; ***,

s

0,0001; NS, ikke signifikant.

CD166 + celler viser stærk tumorigenicitet i muse xenograftmodeller

For at vurdere virkningerne af CD166 på

in vivo

tumorvækst, vi subkutant transplanteret CD166 + eller CD166- celler i nøgne mus. Vi fandt, at CD166 + celler havde signifikant større tumorigenicitet end CD166- celler afledt fra Panc-1 cellelinje (p = 0,0082, figur 4A og tabel 3). Tilsvarende SW1990-afledte CD166 + -celler tendens til at generere større tumorer end hos CD166- celler, selvom forskellen ikke var statistisk signifikant (figur S2 og tabel S3). I muse ortotopisk xenograftmodeller, tumorer afledt af CD166 + Panc-1-celler var tungere end dem fra CD166- Panc-1-celler (p 0,05, figur 4B). Analyse af subkutane og ortotopisk xenograftmodeller ved flowcytometri viste, at CD166 + sats i tumorer fra CD166 + celler var signifikant højere end i tumorer fra CD166- celler, selvom immunhistokemi ikke viste signifikante forskelle i CD166 ekspression (figur 4C-F). Der var heller ingen signifikant sammenhæng mellem størrelsen af ​​tumorer og CD166 + sats af celler (figur 4G).

(A) Mus blev subkutant transplanteret med forældrenes, CD166 +, og CD166- celler fra Panc-1 celle line (repræsentativt billede), og tumorvolumener blev regelmæssigt målt i 7 uger. (B) Mouse ortotopisk tumor xenograftmodeller blev også genereret fra CD166 + og CD166- Panc-1-celler. Tumorer blev udskåret og våd vejet. (C, E) Immunohistokemisk analyse af CD166 i subkutant (C) og ortotopisk (E) tumorer afledt af CD166 + og CD166- SW1990 og Panc-1-celler. Original forstørrelse: 100 ×. (D, F) CD166 ekspressionen blev analyseret i subkutant (D) og ortotopisk (F) tumorer afledt af CD166 + og CD166- celler ved flowcytometri. (G) Analyse af forholdet mellem tumorvægt og positivitet på CD166-celler i ortotopisk tumorer afledt af CD166 + og CD166- Panc-1-celler. Alle grafer viser middelværdien ± SD; *,

s

0,05, **,

p

. 0,01

CD166- celler over-udtrykke epitel-mesenkymale overgang (EMT) aktivator Zeb1

Hong et al. rapporterede, at knockdown af CD166 ved RNA-interferens har ingen effekt på væksten eller invasion af bugspytkirtelkræftceller [12]. Vi inhiberede også CD166 ekspression ved RNA-interferens i pancreas cancercellelinie SUIT-2. Som følge heraf havde knockdown af CD166 ikke påvirke invasion, migration, proliferation, eller kolonidannelse aktiviteter (figur 5A, 5B og S3A-C). For at belyse nøglefaktorer understreger den funktionelle forskelle mellem CD166 + og CD166- celler, vi næste fokuseret på ekspressionen af ​​markører for EMT og pancreas CSCS. Vi evaluerede udtryk for EMT markører i SW1990 og Panc-1 celler ved hjælp QRT-PCR. Ved det primære stadium af EMT, celler mister ekspression af epiteliale markører, ekspres mesenchymale markører, og erhverve bevægelige og invasive egenskaber [21]. Niveauet af Zeb1 mRNA, en EMT aktivator, var større i CD166- celler end i CD166 + celler, selv om der var nogen forskel i mRNA-niveauerne af epitel markør E-cadherin (fig 5E). Niveauet af N-cadherin-mRNA, en mesenchymal markering, var højere i CD166 + celler end i CD166- celler. Desuden er omfanget af metalloproteinase 2 (MMP2) mRNA, som er relateret til celle invasionsevne, blev forøget i CD166- celler sammenlignes med den i CD166 + celler [22]. Dernæst analyserede vi forholdet mellem CD166 udtryk og CSC markører CD24, CD44, og CD133; Men vi fandt ikke nogen væsentlige ændringer i deres udtryk mellem CD166 + og CD166- celler afledt af Panc-1 celler (figur 5D) [23], [24].

(A) QRT-PCR-analyse af mRNA-niveauer af CD166 i SUIT-2-celler efter RNA-interferens blev udført ved de angivne dage efter transfektion. Kontrolsystemer (siControl) eller CD166 tavse celler (siCD166) blev analyseret ved (B) kolonidannelse assays ved de angivne dage efter transfektion. (C) QRT-PCR-analyse af EMT markører E-cadherin, N-cadherin, Zeb-1, og MMP2 i CD166 + og CD166- Panc-1 og SW1990 celler. (D) forholdet mellem ekspression af CD166 og CSC markører CD24, CD44, og CD133 i Panc-1-celler blev analyseret ved flowcytometri. Dataene repræsenterer gennemsnittet ± SD; *,

s

0,05; NS, ikke signifikant.

Microarray analyse viser overekspression af TSPAN8 og BST2 i CD166 + celler, mens BMP7 og Col6A1 er over-udtrykkes i CD166- celler

For at identificere andre centrale molekyler, der er involveret i CD166 ekspressionen, udførte vi microarray analyser af CD166 + og CD166- celler fra både Panc-1 og SW1990 cellelinier. Sammenligninger af microarray data identificeret 26 gener, der blev opreguleret med mere end 2-fold i CD166 + -celler (tabel S4) og 11 gener, der blev opreguleret med mere end 2-fold i CD166- celler (tabel S5). Af disse gener, valgte vi TSPAN8, BST2, BMP7, og Col6A1 til yderligere analyse, fordi disse gener er blevet rapporteret at være involveret i tumorigenicitet eller kræft celle invasion og migration. QRT-PCR-analyse blev derefter udført for at validere microarray data (figur 6A) [25] – [29]. Til bedømmelse af virkningerne af CD166 knockdown på ekspressionen af ​​disse fire gener blev deres mRNA-niveauer vurderes i jakkesæt-2-celler efter RNA-interferens. Som følge heraf var der ingen væsentlige ændringer i ekspressionsniveauerne af disse gener (figur S4).

(A) QRT-PCR blev anvendt til at analysere mRNA-niveauer af TSPAN8, BST2, BMP7, og Col6A1, som viste sig at være opreguleret med mere end 2 gange i CD166 + og CD166- celler i sammenligninger af microarray data. (B) Den positivitet på CD166 i metastatiske Panc-1 og metastatiske SUIT-2-cellelinier blev målt ved flowcytometri. (C) QRT-PCR-analyse blev også anvendt til at undersøge CD166 mRNA niveauer i den metastatiske cellelinier. Dataene repræsenterer gennemsnittet ± SD; *,

s

0,05, **,

s

0,01, ***,

s

. 0,001

For at undersøge, om CD166 spiller en rolle i metastase, brugte vi to tidligere etablerede metastatiske kræft i bugspytkirtlen cellelinjer, der blev genereret fra levermetastaser hos nøgne mus xenograftmodeller [15]. Disse cellelinier, metastatisk Panc-1 og metastatisk SUIT-2, viste en stærkere lever metastatisk potentiale sammenlignet med deres parentale cellelinjer. I den metastatiske Panc-1-cellelinien blev CD166 ekspressionen rate signifikant forøget sammenlignet med den af ​​de parentale celler (99,2% vs. 46,9%, figur 6B). I SUIT-2-cellelinje, de fleste celler udtrykte CD166 i både parentale SUIT-2-celler (99,3%) og metastatiske SUIT-2-celler (99,4%). QRT-PCR-analyse viste, at niveauerne af CD166 mRNA i både metastatisk Panc-1 og metastatiske SUIT-2-celler var signifikant større end dem i deres parentale cellelinier (p 0,0001 og p = 0,0015 for Panc-1 og SUIT-2,