PLoS ONE: Cold Atmosfærisk Plasma: En lovende Supplerende terapi for Pladecellekræft hoved og hals Cancer

Abstrakt

Hoved og hals pladecellekræft (HNSCC) er den 7

th mest almindelige kræftform i verden. Trods udviklingen af ​​nye terapeutiske midler, såsom monoklonale antistoffer, havde prognose ikke ændre i de sidste årtier. Kold atmosfærisk plasma (CAP) præsenterer den mest lovende nye teknologi i kræftbehandling. I denne undersøgelse af effektiviteten af ​​en overflade mikro afladning (SMD) plasma enhed mod to hoved- og halscancer cellelinier blev bevist. Virkninger på cellelevedygtigheden, DNA-fragmentering og apoptosis induktion blev evalueret med MTT-assayet, alkalisk mikrogel elektroforese (comet assay) og Annexin-V /PI-farvning. MTT-assay viste, at behandling FLP markant nedsætter cellelevedygtigheden for alle testede behandlingstider (30, 60, 90, 120 og 180 s). IC50 blev nået inden for maksimal 120 sekunders behandling fælles landbrugspolitik. Comet assay analyse viste en dosisafhængig høj DNA-fragmentering er en af ​​de centrale aktører i anti-cancer aktivitet fælles landbrugspolitik. Annexin-V /PI-farvning afslørede induktion af apoptose i CAP behandlet HNSCC cellelinier, men ingen signifikant dosis afhængighed blev set. Således har vi bekræftet, at SMD Plasma teknologien er absolut en lovende ny tilgang til kræftbehandling

Henvisning:. Welz C, Emmert S, Canis M, Becker S, Baumeister P, Shimizu T, et al. (2015) Cold Atmosfærisk Plasma: En lovende Supplerende terapi for Pladecellekræft hoved- og halscancer. PLoS ONE 10 (11): e0141827. doi: 10,1371 /journal.pone.0141827

Redaktør: Michael Hamblin, Massachusetts General Hospital, UNITED STATES

Modtaget: April 21, 2015; Accepteret: 13. oktober 2015; Udgivet: 20. november 2015

Copyright: © 2015 Welz et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. arbejdet blev støttet af Friedrich-Baur-Stiftung München (GrandNumber 40/13) [https://www.baur-stiftung.de/front_content php? idcat = 76]. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Selvom forfatterne J. Zimmermann T. Shimizu og G. Morfill ikke var tilknyttet terraplasma GmbH på det tidspunkt, at undersøgelserne blev foretaget, den nuværende beskæftigelse udgør en opfattet økonomisk konkurrerende interesse som virksomheden og dens medarbejdere vil sandsynligvis står til at drage fordel af succesen af ​​den kolde atmosfæriske plasma-teknologi. Selvfølgelig gælder det samme for et vilkårligt antal plasma selskaber, som offentliggørelsen af ​​vores resultater giver en gratis forskning input samt frihed til at operere.

Introduktion

Hoved og hals pladecellekræft (HNSCC), herunder maligniteter i mundhulen, svælget og strubehovedet, er den 7

th mest almindelige kræftform i verden bidrager mere end 4% af det samlede antal nye kræfttilfælde i 2012. det betyder, næsten 600.000 nye sygdomme diagnosticeres årligt på verdensplan [1]. For 2014 er 55.070 nye tilfælde og 12.000 dødsfald estimeret i USA. Den gennemsnitlige 5-års overlevelse er omkring 50%, hvilket hovedsageligt skyldes den høje metastase, sekundære maligniteter og især lokalt recidiv af disse tumorer [2]. Trods nye tilgange i behandlingen af ​​hoved- og halscancer, såsom monoklonale antistoffer den samlede overlevelse ikke kunne væsentligt forøget i de seneste årtier, som beder om udvikling af nye antitumorale metoder og teknologier. På grund af dets egenskaber, kold atmosfærisk plasma (CAP) er den mest lovende og udviklingspotentiale på dette område.

Plasma kan forenklet beskrives som en helt eller delvist ioniseret gas. Syntetiske genereret plasmaer såsom argon plasma koagulatoren allerede etablerede værktøjer inden for medicin [3]. Men på grund af deres høje temperatur ( 10.000 ° C), kan de kun anvendes til ablation eller koagulations- formål [4]. Da et par år plasmaer kan frembringes med en ion temperatur, som er tæt på stuetemperatur. Disse såkaldte kolde atmosfæriske plasmaer har allerede bevist deres enorme antimikrobielle effekt i kliniske forsøg og åbnede op for en bred vifte af medicinske anvendelser, især til alle varme-følsomme og vitale overflader såsom hud eller slimhinde [5-10].

Udover den antimikrobielle stoffer ansøgning, seneste resultater rejst en antitumoral potentiale fælles landbrugspolitik. De biologiske effekter og mekanismer forbliver dårligt forstået [11-15]. Nogle forfattere beskriver induktionen af ​​apoptose ved reaktive oxygenarter (ROS) [13,14]. Andre forfattere forklare plasma effekter ved mekanismer såsom nekrose og celle detachement [12]. Endvidere har nogle studier vist sig indflydelse på cellecyklussen, ligesom cellecyklusstandsning eller induktion af senescens mekanismer, CAP [15,16]. Desuden viste vores arbejdsgruppe en genoprettelse af følsomhed i kemo-resistente gliom celler ved CAP [17]. Sammenligningen og fortolkning af resultaterne af disse forskellige undersøgelser CAP om “anti-cancer formåen” er meget vanskelig. Dette er også relateret til indsættelsen af ​​forskellige teknologier (overflade micro afladningselektroderne (SMD), dielektrisk afladningselektroderne (DBD), plasma jets eller nåle) og deres applikationer. Derfor forskellig kemi, sammensætning og koncentrationer af plasmaprodukter, reaktive oxygen- og nitrogenforbindelser, elektroner, ioner, UV-lys og temperatur blev undersøgt. Ikke desto mindre, næsten alle undersøgelser kunne se en antitumoral effekt på mange forskellige maligne celler. Endvidere er virkningen viser specificitet for tumorceller [13-15,18,19].

Understregning denne hypotese vores arbejdsgruppe viste, at behandling CAP af sunde humane mucosa vævskulturer (svælg og nasale) inducerer kun en svag cytotoksicitet, men ingen signifikante genotoksisk effekt på op til 120 sekunders plasma behandling [20].

Formålet med denne undersøgelse var evalueringen af ​​antitumormakrofagaktivatoren effekt af vores CAP enhed mod to skællede hoved- og halscancer cellelinjer ( OSC-19 og FaDu), og undersøgelsen af ​​de mulige mekanismer, der forårsager denne effekt. Den metodiske fokus blev sat på akut cytotoksicitet (MTT-assay), DNA-fragmentering (Comet Assay) og induktion af apoptose (AnnexinV /PI). Plasma-behandling blev udført af en håndholdt og batteri-drevet enhed, der drives til Surface Micro Discharge (SMD) teknologi [21].

Materiale og metoder

Cell Culture

FaDu cellelinie, der stammer fra en lav gradueret tungen kræft [22], blev indkøbt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). OSC 19 cellelinien opnået 1989 under en hypopharyngeal cancer vokser in vivo som et godt differentieret pladecellecarcinom med en høj metastase [23] og blev indkøbt fra JCBR cellebank. OSC 19 celler blev dyrket i DMEM /Ham’s F-12 (Biochrom AG, Berlin, Tyskland) og FaDu celler i DMEM (Biochrom). Begge cellelinier blev også suppleret med 10% kalvefosterserum (Gibco, Carlsbad, CA, USA) og 10 U /ml penicillin-streptomycin (Biochrom). FaDu celler blev yderligere suppleret med 1% ikke-essentielle aminosyrer (Invitrogen, Karlsruhe, Tyskland) og hver 1% af L-glutamin og natriumpyruvat (Biochrom). Cellerne blev opretholdt ved 37 ° C med 5% CO

2 under fugtige forhold.

Plasma Behandling

Denne undersøgelse blev udført af den såkaldte MiniFlatPlaSter®, en håndholdt enhed CAP som bruger Surface Micro Discharge (SMD) teknologi til plasma produktion i luften [21] (figur 1). Nærmere oplysninger om enheden og dens plasma kemi blev udgivet i Welz et al. [20] og Maisch et al. [24]. Tabel 1 viser de vigtigste udgør produceret af plasma enhed

Koncentrationen af ​​reaktive arter blev målt som funktion af tiden.; ovennævnte værdier er gennemsnit over 1 min.

SMD elektrode består af et glas epoxy bord, som er klemt af en kobberfolie lag og en rustfri stål mesh gitter. Ved at anvende en høj puls-lignende spænding på 7 kV (peak-to-peak) med en gentagelsesfrekvens på 6,75 kHz plasmaet frembringes homogent på mesh gitter side i den omgivende luft. Således er de genererede arter transporteres til cellerne ved diffusion. I modsætning til Dielektrisk Barrier Discharge (DBD) enheder-de brugte SMD enheder producerer meget lave strømme (tabel 1), hvilket sikrer en sikker anvendelse, hvis det anvendes in vivo.

For eksperimenter 5×10

5 kræftceller var anbragt i plader med 6 brønde og lodes binde i 24 h timer under samme betingelser som beskrevet ovenfor. Før behandling af den fælles landbrugspolitik, blev celledyrkningsmedium fjernes, så cellerne weren’t omfattet af væske. elektrode FLP blev konstrueret med en diameter på 28 mm, således at det passer nøjagtigt kanten af ​​en brønd. Denne lukkede volumen tilstand under hele behandlingen af ​​den fælles landbrugspolitik begrænse de producerede arter (Fig 2) inde. Afstanden mellem elektroden og cellerne svarede 17,5 ± 0,5 mm. Temperaturen i bunden af ​​brønden ikke forøges med mere end én grad efter 180 sekunders behandling CAP. Sammen med ansøgningen ved diffusion, er dehydrering virkninger på cellerne for at være usandsynligt. Behandlingsgrupperne CAP gange på 30, 60, 90, 120 og 180 s blev anvendt. For at udelukke ikke-specifikke plasma effekter (såsom “tørring virkninger”) som en mulig skævhed blev en separat kontrol for hver behandlingstid udført. Det betyder, at de respektive kontroller blev behandlet på samme måde som de tilsvarende plasma behandling eksperimenter, bortset fra at kontrolcellerne ikke modtog et plasma behandling. Cell medium blev sat til alle brønde umiddelbart efter eksponering CAP.

Cell levedygtighed /MTT-Assay

Cytotoksicitetsstudier målinger blev udført ved hjælp af Cell Proliferation Kit I af Roche Diagnostics (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Tyskland) i henhold til brugsanvisningen. At overvåge cellelevedygtighed ændrer sig efter forskellige behandlingsmetoder CAP gange, som beskrevet ovenfor, blev de behandlede celler og de respektive kontroller trypsiniseret og podet med 8000 celler /brønd (100 pi) i en plade med 96 brønde. Celletoksicitet blev målt 24 timer efter plasmabehandling udskiftning af dyrkningsmediet med 10 pi mærkning medium indeholdende 0,5 mg /ml MTT. Efter 4 timers inkubering i en fugtig atmosfære (37 ° C med 5% CO

2) blev 100 pi MTT-farvning opløsning tilsat til hver brønd efterfulgt af inkubation natten over. Den lilla formazanfarvestof blev kvantificeret under anvendelse af en VERSAmax ™ ELISA- læser (Molecular Devices GmbH, Biberach, Tyskland) ved en bølgelængde på 550 nm. Henvisningen bølgelængde svarer til 690 nm. Hver eksperiment indeholdt tredobbelte målinger af cellernes levedygtighed reduktion af hver plasma behandlingstid. Desuden blev hvert eksperiment gentages fem gange (målinger for hver behandlingstiden n = 15). De gennemsnitlige levedygtighed celle kurver reduktion blev standardiseret til den nedsatte procentdelen af ​​levende celler, mens kontrol cellerne blev sat til 0%.

DNA-skader /Comet assay

For at kvantificere DNA skader efter de forskellige behandling CAP, vurdering af den alkaliske mikrogel elektroforese (Comet assay) blev udført. Dybest set protokollen er i stand til at opdage DNA-streng pauser i enkelte celler, alkali-labile steder (ALSs) og ufuldstændig excision reparation [25].

Til målinger blev trypsinering udført direkte efter behandling CAP ved inkubation med en ml trypsin /EDTA-opløsning for 8-10 min. Efter neutralisering og centrifugering (10 min, 900 U /min), celletælling og cellelevedygtighed skærm ved trypan blå-udelukkelse testen blev udført. På hver dias blev 200.000 celler anvendt og dækket med 0,5% normalt smeltende agarose (Biozym) for at sikre stabilitet til agarose lag. For cellelysis blev objektglassene dækket med alkalisk opløsning i 1 time (10% DMSO, 1% Triton-X, 2,5 M NaCl, 10 mM Trizma-base, 100 mM Na

2 EDTA og 1% N -lauroylsarcosine natriumsalt) . Derefter blev objektglassene anbragt i gelelektroforese kammer (Renner, Dannstadt, Tyskland) og inkuberet i 20 min med alkalisk pufferopløsning indeholdende 300 mM NaOH og 1 mM Na2EDTA ved pH 13,2. Efter dette DNA afvikling periode blev elektroforese startet på 0,8 V cm-1 og 300 mA og fortsatte i 20 minutter efterfulgt af neutralisering (Trisma base, 400 mM, pH 7,5; Merck, Tyskland).

Før analyse med en DMLB mikroskop (Leica, Bensheim, Tyskland) fluorescerende DNA-farvning blev udført med 75 pi ethidiumbromid (Sigma; [51 pM]). 80 cellekerner pr slide (2 slides per behandling CAP tid) blev udvalgt med tilfældigt mønster og digitaliseret med vedlagte monokromt CCD-kamera (Cohu Inc., San Diego, CA, USA).

En høj DNA fragmentering /DNA-beskadigelse fører til en hurtigere og længere migration i det elektriske felt, idet intakt DNA ikke migrere (figur 3). DNA-migration blev målt ved billedanalyse software Komet ++ (Kinetic Imaging, Liverpool, UK) under anvendelse af% af DNA i halen. Den% hale DNA er et mål for den relative fluorescerende intensitet i hoved og hale.

En ubeskadiget OSC-19 celle med intakt DNA og ingen migration. DNA fragmentation fører til en hurtigere og længere migration til det elektriske felt, hvilket resulterer i en figur formet som en komet med ubeskadiget DNA i hovedet og beskadiget DNA i halen (B + C). Den lysere og længere halen, jo højere niveau af DNA fragmentation. B OSC-19 celle med en moderat CAP induceret DNA-beskadigelse. C repræsentant billede af høj DNA-fragmentering.

Apoptose detektion

Induktion af apoptose 24 timer efter behandlingen af ​​den fælles landbrugspolitik blev undersøgt med fluorescens mikroskopi ved hjælp af Annexin V-FITC afsløring kit (PromoKine , Heidelberg). behandling og trypsinering CAP blev udført som beskrevet ovenfor. Til forsøg 1×10

5-celler blev resuspenderet i 500 pi bindende puffer-opløsning og inkuberet i 5 minutter under rødt lys med 5 pi Annexin V-FITC og 5 pi Propidium iodid (PI). Translokation af phosphatidylserin (PS) fra det indre til det ydre flade af plasmamembranen er et tidligt trin af apoptose. Annexin-V er en calcium-afhængig phospholipid bindingsprotein med en høj affinitet til PS og kan derfor anvendes som en følsom markør for de apoptotiske celler. Kombinere Annexin-V mærkning med en PI-farvning muliggør differentiering mellem levedygtige, tidlig apoptotiske og sene apoptotiske /nekrotiske celler (Fig 4). 100 celler pr behandling CAP blev talt og tidlige apoptotiske celler blev identificeret og indekser blev beregnet.

Resultater opnået ved fluorescensmikroskopi viser, at tidlig apoptotiske celler er bundet Annexin-FITC til phosphatidylserin på membranoverfladen (grøn celle) . Som apoptose skred frem, bliver plasmamembranintegritet den tabt, og propidiumiodid er i stand til at binde sig til nukleotid DNA, således at sene apoptotiske eller nekrotiske celler vises i rødt.

Statistisk analyse

Medmindre andet sted bemærkede data blev rapporteret som det aritmetiske gennemsnit ± SEM. Den SigmaPlot software til Windows Version 12.0 (2011 af Systat Software Inc. CA, USA) blev anvendt til statistiske analyser. Til beregning af den statistiske signifikans af resultaterne blev brugt Friedman Gentagne foranstaltninger variansanalyse på Ranks og alle parvise Flere Sammenligning Procedurer (Student-Newman-Keuls Metode). Forskelle blev betragtet signifikant ved p-værdier 0,05, før den statistiske analyse.

Resultater Salg

Dosisafhængig reduktion af cellelevedygtighed efter behandling CAP

Fig 5 viser reduktionen af ​​levedygtighed OSC-19 og FaDu kræft celler efter CAP eksponering for behandlinger på 30, 60, 90, 120 og 180 s sammenlignet med de ubehandlede kontroller. Cellelevedygtighed blev kvantificeret ved anvendelse af MTT-assayet som beskrevet i metodeafsnittet. Reduktionen af ​​levedygtighed blev sat til 0%, således at resultaterne -expressed i negativ procent af kontrol- tillader visuel sammenligning mellem de to cellelinier. For FaDu celle celler levedygtighed blev signifikant reduceret med 4,8% (p 0,05) for en behandling CAP på 30 s sammenlignet med kontrollerne. En behandling på 60 s inducerede en reduktion på 23,4% (p 0,05), som var statistisk signifikant sammenlignet med kontrollerne og 30’erne. Længere behandlingstider på 90 s og 120 s faldt levedygtighed ved 43,6 henholdsvis 49,2%. I forhold til kontrollerne og de forudgående kortere behandlinger tider af 30 s og 60 s nedsættelserne var stærkt signifikant (p 0001). En behandlingstid på 180s falder FaDu levedygtighed ved 51,4%. I tilfælde af 90 s og 120 s var dette en betydelig reduktion sammenlignet med kontroller og behandlingstider på op til 60 s (p 0,05). Sammenligningen af ​​90, 120 og 180 s viste ingen yderligere signifikant reduktion cellernes levedygtighed (p 0,05).

For begge HNSCC cellelinjer levedygtigheden falder for at øge behandling CAP gange. Standard fejl middelværdien, afbildet ved knurhår blots.

For levedygtighed OSC 19 celler blev reduceret med 20% efter en behandlingstid på 30 s og med 31,2% i 60 s hhv. Længere behandlingstider (90 s og 120 s) induceret yderligere reduktion af cellelevedygtighed med 51,7% (90 s) og 64,1% (120 s). Alle reduktioner levedygtighed var statistisk signifikant sammenlignet med de ubehandlede kontroller og de kendte kortere behandlingstider (p 0,05). 180 s af behandling fører til en yderligere reduktion af 73,3%, hvilket var signifikant sammenlignet med kontrollerne og behandlingstider på op til 90 s (p 0,05)

Induktion af DNA-skade ved. CAP

for at undersøge, om den afhængige reduktion tid i celle levedygtighed og den stigende rente af apoptose er forårsaget af den fælles landbrugspolitik induceret DNA skade alkaliske mikrogel elektroforese blev udført. Fig 6 og 7 viser procentdelen af ​​halen-DNA fra hver cellelinie i detaljer.

Standard box-plots (laveste kvartil, median, øvre kvartil) blev anvendt til at illustrere resultaterne. Prikker angiver milde statistiske outliers (mellem 1,5 og 3 gange interkvartile område (IQR)); Stjernerne betegner ekstreme statistiske outliers (mere end 3 gange IQR).

Standard box-plots (lavere kvartil, median, øvre kvartil) blev anvendt til at illustrere resultaterne. Dots betegne milde statistiske outliers (mellem 1,5 og 3 gange interkvartile område (IQR)).

Analyse af eksperimenter ved hjælp af FaDu cellelinje (figur 6) viste ingen signifikant stigning af DNA-skader i forhold til kontrollerne (4,2%; p 0,05) i 30 s for plasmabehandling (4,8% af DNA i halen). For 60 s en betydelig stigning på% hale DNA (7,6%) i forhold til de ubehandlede kontroller (p 0,05) og varighed på 30 s CAP (p 0,05) blev observeret. Længere varigheder øget DNA fragmentation til 14,8% (90 s) henholdsvis 17,9% (120 s). Sammenlignet med kontrollerne, 30 s og 60 s behandling CAP denne stigning var statistisk signifikant (p 0,05). Den stigende DNA-skader fra 90 s til 120 s behandling CAP viste en statistisk signifikans så godt. varighed på 180 s CAP føre til en yderligere DNA-fragmentering af 20,5% DNA i halen. Sammenlignet med de ubehandlede kontroller og alle andre behandlingstider denne tilvækst på 180 s var statistisk signifikant (p 0,05).

For OSC 19 celler 30 s plasma behandling inducerede en DNA-fragmentering på 4,0%, hvilket ikke var signifikant i sammenligning med de ubehandlede kontroller (3,1%; p 0,05). Længere behandling CAP (60 s og 90 s) inducerede en stigning på DNA-skader til 6,5% (60s) og 9,6% (90 s). Svarende til FaDu cellelinje eksperimenter denne stigning viste en signifikans (p 0,05) sammenlignet med kontrollerne og hver forudgående behandling tid. Faktisk i 120 s og 180 s blev der observeret en yderligere vækst af DNA fragmentation (9,8% i 120 s, 12,7% i 180 s), men denne forhøjelse var ikke signifikant sammenlignet med den kendte varighed 90 s (p 0,05). Fig 7 viser% hale DNA for OSC 19 celler i detaljer.

CAP induceret apoptose

For at afklare, om den tid, afhængig stigning i DNA-skader inducerer apoptose og hvis reduktion i cellernes levedygtighed kan forklares ved programmeret celledød, blev AnnexinV /PI farvning udført 24 timer efter behandlingen fælles landbrugspolitik. Som vist i figurerne 8 og 9, plasmabehandling induceret apoptose i begge cellelinier. 180 s af plasmabehandling resulterede i en over 4 gange forøgelse af tidlige apoptotiske celler sammenlignet med kontroller (p ≤ 0,002). I detaljer, for FaDu cellelinie (Fig 8) den ubehandlede kontrol viste et gennemsnit på 1,9% apoptotiske celler. Efter en behandling af den fælles landbrugspolitik på 30 s en svag stigning i apoptose (3,6%) blev registreret, hvilket var signifikant til kontrollerne (p 0,01). Efter 60 s gennemsnit 5,5% af cellerne apoptotiske og en varighed på 90 sekunder forøgede hastigheden af ​​apoptotiske celler til 7,3%. Sammenlignet med kontrol og hver kortere behandlingstid denne stigning var statistisk signifikant (p 0,05). Længere behandlingstider på 120 s og 180 s viste stigende satser for apoptotiske celler på 8,5%, henholdsvis 7,5%. Sammenlignet med kontrol og behandlingstider på op til 60 s disse satser var statistisk signifikante (p 0,05), men ingen betydning blev set i forhold til hinanden og til 90 s (p 0,05).

De ubehandlede OSC 19 celler viste et gennemsnit på 2,6% af apoptotiske celler (figur 9). For behandling CAP tider af 30 s, blev registreret en svag stigning af apoptose til 4,4%, men disse data er ikke signifikant. En behandling CAP på 60 s viste et gennemsnit på 5,5% apoptotiske celler, hvilket er en markant stigning i forhold til kontrollerne (p 0,05). Den 90 s behandling øget antallet af apoptotiske celler til 5,9% og 120 s til 6,4%. Begge varigheder viste en signifikant stigning i apoptotisk celle sats sammenlignet med ubehandlet celle (p 0,05), men ingen signifikans blev set, når sammenligne det med kortere behandlingstider. En behandlingstid på 180 s inducerede 11,3% apoptotiske celler. Denne stigning var statistisk signifikant sammenlignet med kontrolgruppen, og alle tidligere behandlingstider (p 0,05).

Diskussion

Med at være en af ​​de mest potentielle midler mod enhver mikroorganisme og beviset for dens effekt i kliniske forsøg, CAP medicin er en hastigt voksende forskningsemne og udvikler større betydning i sundhedsvæsenet. Kræftbehandling er den mest lovende nye medicinske anvendelse af den fælles landbrugspolitik. In vitro og in vivo undersøgelser af forskellige former for tumorer afslørede stærke og særlige virkninger for cancerceller og hæmning af væksten kræft [14-16,18,19]. Det lader til, at den fælles landbrugspolitik kan fremkalde cellecyklusstandsning og ved tilstrækkeligt høje doser forårsage apoptose og nekrose i kræftceller. Men de nøjagtige mekanismer effekter fælles landbrugspolitik fortsat uklare.

Produktionen af ​​reaktive kvælstof og ilt arter af CAP menes at være en nøglespiller indlede de observerede direkte antitumorale virkninger. Adskillige publikationer antyder en forøgelse af intracellulære ROS /RNS niveauer efter behandling CAP, hvorved der induceres DNA-beskadigelse og apoptose i tumorceller [13,14,26]. Vandamme et al. viste en dosis afhængig induktion af apoptose efter behandling af malignt gliom (U87MG) CAP og colorectalt carcinom (HCT-116) celler [14]. Den apoptotisk celledød blev også forklaret som et resultat af ROS effekter. Udover ROS induceret DNA-beskadigelse efterfulgt af apoptose er der data, der beskriver en akut cytotoksisk /nekrotisk virkning [12]. Fra i dag er der ingen data, der viser effekten af ​​en SMD plasma enhed genereret CAP mod hoved- og halscancer celler. Alligevel, især for organer med naturlig åbning ligesom hud og slimhinde øvre aerodigestive tarmkanalen (mundhulen, oropharynx, dele af hypopharynx og strubehovedet) CAP afslører højpotente behandlingsmuligheder for kræft i hoved og hals. Desuden vores håndholdte SMD enhed, genererer plasma i den omgivende luft kan nå HNSCC via diffusion og samtidig undgå en bæregas eller gasstrøm. Således har vi hypotesen, at vores enhed kan inducere en behandlingstid afhænger celledød i HNSCC cellelinier.

celleviabilitetstest viste, at CAP havde en signifikant anti-tumor aktivitet på FaDu og OSC-19 cellelinier med en IC

50 af 120 sek (FaDu) og 90 sek (OSC-19) eksponeringstid. I OSC-19 cellelinjer, varighed af 180s førte til ca. 75% celledød. Disse resultater er i overensstemmelse med flere undersøgelser, som viste en anti-tumor aktiviteten af ​​den fælles landbrugspolitik om forskellige maligne cellelinjer, herunder melanom, gliom, hepatocellulært, og kolorektal carcinom [11,13,14,27-30]. Til sammenligning viste vores undersøgelser af raske mucosal cellekulturer med den samme indretning og under de samme eksperimentelle betingelser kun cellelevedygtighed reduktion på 15% efter 120 sekunder af plasmabehandling [20]. vi bevist derfor, at vores SMD plasma-enhed er effektiv mod HNSCC cellelinjer, mens raske celler ophold næsten upåvirket.

Udover kirurgi, strålebehandling (RT) er den vigtigste modalitet i primær HNSCC behandling og uundværlig for adjuverende strategier [31] . Den vigtigste mekanisme til anticancer aktivitet henholdsvis evne strålebehandling er stråling-induceret DNA skader, som initierer cellecyklus ændringer og signal kaskader endelig fører til celledød. At vurdere, om CAP er også i stand til at inducere DNA-beskadigelse i HNSCC celler, som kunne være ansvarlig for en reduktion afhængig levedygtighed behandlingstid, blev den alkaliske mikrogel elektroforese teknik (Comet assay) udføres bliver meget følsom til påvisning af DNA enkeltstrengede brud (SSB’er) , dobbelt streng pauser (DSBs) og alkali-labile steder (ALSs). Fordi SSB og /eller ALS forekommer mere sandsynligt end DSB og andre DNA ændringer såsom DNA tværbindinger eller indlejringer, den alkaliske mircogel elektroforese er meget følsomme til kvantificering lave niveauer af DNA-skader, hvilket gør det bedre end andre genotoksicitetstests [25,32] . Trods af den høje følsomhed skal det nævnes, at DNA-reparationsmekanismer og deres konsekvens på cellelevedygtigheden, betragtes ikke ved denne fremgangsmåde Vores test observeret en signifikant behandlingstid henholdsvis dosisafhængig forøgelse af DNA-skader i begge HNSCC cellelinier. I forhold til eksponering af sunde slimhinde vævskulturer på CAP [20], en op til fire gange DNA fragmentering i kræftceller blev opdaget. Derfor vores resultater viser, at CAP eller dets produkter interagerer med DNA’et af HNSCC cellelinier, og er i stand til at inducere dødelig DNA-beskadigelse, som kan forklare den dosisafhængige anticanceraktivitet af vores SMD plasma enhed.

Ved evaluering hvis dosisafhængig DNA-skade inducerer apoptose og hvorvidt det afhængige reduktionsbehandling cirka cellelevedygtighed er et resultat af en apoptotisk proces, vi udførte AnnexinV /PI-farvning. Efter 60 s behandlingstid og længere, vores CAP enhed induceret apoptotisk celledød i begge cellelinier i sammenligning med ubehandlede kontroller. Alligevel sammenligne behandlingstiderne separat, var der ingen signifikant dosisafhængig forøgelse af apoptotiske celler. Kun lange behandlingstider tilsvarende høje plasma doser inducerede en høj apoptotiske celler i OSC-19 cellelinie, som er i overensstemmelse med resultaterne af Arndt et al. I denne undersøgelse, der blev gennemført med samme plasma-enhed vi brugte (MiniFlatPlaSter®), og derfor havde den samme plasmafysik og kemiske sammensætninger, behandlingstider på 120 s inducerer DNA-skader og stærkt øget apoptose i melanom cellelinjer. I tilfælde af kortere behandlingstider blev observeret næsten ingen apoptotiske celle sats, men afslørede en ældning induktion [16].

Vi igen vil understrege, at en sammenligning af forskellige forsøg udført med forskellige enheder fælles landbrugspolitik er vanskelig på grund af forskellige fælles landbrugspolitik parametre og designs dvs DBD teknologi, SMD teknologi, effekt, spænding, frekvens, bæregas etc. resulterer i relevante forskelle i produktionen af ​​deres komponenter. Men forsøg udført med det samme plasma-enheden også føre til divergerende resultater, når forskellige cellelinier (maligne /non-maligne) er målrettet. Alligevel en selektiv cytotoksisk virkning på cancerceller er ved at opstå i korrelation med resultaterne af forskellige forsøg af CAP på maligne celler [14,15,18,19]. Mekanismen for denne selektivitet er fortsat uklart. Men i vore undersøgelser på epitelceller, CAP synes at have ligheder med anticancer mekanismer af stråling, med at vise en høj DNA-skader og celledød i høj prolifererende cancerceller, mens lav prolifererende sundt slimhindevæv synes at være mindre påvirket af den samme behandling . Ikke desto mindre til at kræve selektivitet med hensyn HNSCC celler og sundt væv, mere sammenlignelige undersøgelser af kræftceller i hoved og hals og slimhindevæv har, der skal udføres [20] .Dette er den første undersøgelse, evaluering af virkningerne af en SMD enhed genereret CAP på HNSCC cellelinier. En dosisafhængig høj reduktion af cellelevedygtighed blev observeret som er delvist forårsaget af apoptose induktion. Desuden blev opdaget en behandling tid, afhængigt høj DNA-fragmentering, som sandsynligvis er den vigtigste aktør vedrørende kræft celledød. Med disse resultater bekræftede vi, at SMD plasma-teknologi er en yderst lovende ny tilgang i hoved og hals kræftbehandling.

Støtte Information

S1 fil. Raw data

doi:. 10,1371 /journal.pone.0141827.s001

(XLSX)

S2 fil. Statistik rapport

doi:. 10,1371 /journal.pone.0141827.s002

(DOCX)