PLoS ONE: ScFv Anti-heparansulfat antistoffer uventet Aktiver Endotheliale og cancerceller gennem p38 MAPK: Konsekvenser for antistof-målretning af heparansulfatproteoglycaner i Cancer

Abstrakt

Tumor udvikling kræver angiogenese og antiangiogene terapier er blevet indført i behandlingen af ​​cancer. I denne sammenhæng heparansulfatproteoglycaner (HSPGs) fremstå som interessante mål på grund af deres funktion som co-receptorer af større, pro-angiogene faktorer. Følgelig har tidligere undersøgelser antydet antitumorvirkninger af heparin,

dvs.

over-sulfaterede HS, og forskellige heparin mimetika.; imidlertid en betydelig ulempe er deres uspecifik virkningsmekanisme og potentielt alvorlige bivirkninger relateret til deres antikoagulerende egenskaber. Her har vi undersøgt anvendelse af menneskelige ScFv anti-HS antistoffer (αHS) som en mere rationel tilgang til at målrette HSPG funktion i endotelceller (ECS). αHS blev oprindeligt udvalgt for deres anerkendelse af HS epitoper lokaliseret fortrinsvis til vaskulaturen af ​​patientens glioblastom tumorer,

dvs..

meget angiogene hjernetumorer. Uventet fandt vi, at disse αHS udviste potente pro-angiogene virkninger i primære humane EC’er. αHS blev vist at stimulere EF differentiering, der var forbundet med øget EF kanaldannelse og proliferation. Desuden αHS støttede EF overlevelse under hypoxi og sult,

dvs..

Betingelser typisk af tumor mikromiljø. Vigtigere er det, αHS-medieret proliferation blev effektivt mod handlet med heparin og var fraværende i HSPG-mangelfulde mutant celler, hvilket bekræfter HS-specifikke effekter. På et mekanistisk niveau, binding af αHS til HSPGs ECS samt glioblastomceller blev fundet at udløse p38 MAPK-afhængig signalering resulterer i øget proliferation. Vi konkluderer, at flere αHS der genkender HS epitoper rigelige i tumorvaskulaturen kan fremkalde en pro-angiogent respons, hvilket har betydning for udvikling af antistof-baserede målretning af HSPGs i kræft

Henvisning:. Christianson HC, van Kuppevelt TH, Belting M (2012) ScFv Anti-heparansulfat antistoffer uventet Aktiver Endotheliale og cancerceller gennem p38 MAPK: konsekvenser for antistof-målretning af heparansulfatproteoglycaner i Cancer. PLoS ONE 7 (11): e49092. doi: 10,1371 /journal.pone.0049092

Redaktør: Ramani Ramchandran, Medical College of Wisconsin, USA

Modtaget: August 21, 2012; Accepteret: 8 oktober 2012; Udgivet: 9. november, 2012 |

Copyright: © 2012 Christianson et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra den svenske Cancer Fund; det svenske Forskningsråd; den svenske Society of Medicine; Den fysisk-Society, Lund; de Gunnar Nilsson, Lundgren og Kamprad Fonde; de Skåne Universitetshospital donation midler; og det statslige finansiering af klinisk forskning inden for de nationale sundhedstjenester (ALF). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

progressionen fra malign transformation i åbenbar tumor udvikling kræver rekruttering af blodkar,

dvs

den angiogene kontakt [1], [2]. Angiogenese er en multi-trins proces afhængig af endotel (EF) proliferation, migration ind i det omkringliggende væv og endelig differentiering til et nyt fartøj. Binding af flere angiogene faktorer,

f.eks

VEGF-A, FGF, og HB-EGF til heparansulfat (HS) polysaccharidkæder understreger betydningen af ​​HS proteoglycaner (PG) i EF-biologi [3] – [5] . HSPGs fungere som co-receptorer, som er til stede vækstfaktorer til deres høje affinitet tyrosinkinase signaleringsreceptorer ved celleoverfladen [6], [7]. Omfattende postsynthetic modifikationer af de lineære HS kæder, der består af gentagne N-acetylglucosamin og glucuronsyre disaccharidenheder, indbefatter sulfatering ved forskellige positioner langs kæden, hvilket resulterer i negativt ladede domæner, der giver bindingssteder for forskellige vækstfaktorer, proteaser og cytokiner, der er involveret i tumorudvikling [3] – [7]. Følgelig musefostre manipuleret til at udtrykke et VEGF-A mangler HS-bindende sekvens udviste et fald i kapillær gren formation [8], og transgene musemodeller med enten homozygot deletion af HS-bindende motiv i PDGF-BB eller reduceres HS sulfatering, viste defekt pericyt rekruttering og utydelige mikrovaskulære anatomi [9], [10]. Ændret udtryk for regulatoriske enzymer involveret i udformningen af ​​fine struktur HS kæder har været impliceret i cancer,

f.eks

gen hypermethylering medieret gen silencing af 3-O sulfotransferase og HSulf-1 blev fundet i flere kræftformer [11], og HSulf-2 overekspression korreleret med øget angiogenese og vækstfaktor-bindingskapacitet i brystcancer [12]. Endvidere har HS-nedbrydende heparanase blevet associeret med tumorudvikling og dårlig patientresultatet gennem omformning af tumormikromiljøet [13]. HSPGs har således været impliceret i flere aspekter af tumor udvikling og angiogenese; dog stadig at blive defineret rolle HSPG som et mål for anti-angiogenese behandling. Faktisk har flere strategier blevet udforsket for at opnå dette formål, vigtigst HS efterligner heparin og dens derivater [14] – [18]. Store ulemper med disse forbindelser er deres relative uspecifikke former for målretning, og en betydelig risiko for blødningskomplikationer forbundet med deres antikoagulerende aktiviteter. Andre mulige HS-målrettede behandlinger for cancerterapi involverer proteiner eller peptider med positivt ladede aminosyrerester, der virker som kompetitive inhibitorer af vækstfaktor-binding til HS kæder [19].

Antistof-baserede terapi er en af ​​de hurtigste voksende terapiområder i medicinsk onkologi og antistoffer rettet mod VEGF, den epidermale vækstfaktor receptor 2 (HER-2), EGF-receptoren eller CD20 er blevet godkendt til behandling af

f.eks

metastatisk bryst- og tarmkræft og aggressiv B- cellelymfomer [20]. Mindre rekombinante antistoffer som enkeltkædede variable fragment (ScFv) antistoffer er interessante muligheder for forbedret målretning på grund af deres gunstige farmakokinetik [21] – [23]. Interessant nok har van Kuppevelt og medarbejdere tidligere beskrevne udvikling og karakterisering af flere epitop specifik, phagdisplay afledt, ScFv αHS til at undersøge strukturelle mangfoldighed HS kæder i forskellige væv [24], [25]. I den foreliggende undersøgelse, søgte vi at identificere ScFv αHS der genkender HS epitoper udtrykt i vaskulaturen af ​​patientens glioblastom-tumorer, og yderligere undersøgt anvendelsen af ​​disse αHS som et formodet strategi til at inhibere forskellige aspekter af EF-funktion.

Resultater

identifikation af αHS kloner, der anerkender HS epitoper af tumorvaskulatur

Vi oprindeligt søgte at identificere αHS kloner med kendt epitopspecificiteter (tabel 1) [26], der kan genkende den vaskulære niche af patientens glioblastom-tumorer. Denne tumortype blev valgt på grundlag af sin velkendte fænotypiske karakteristika af hypoxi-induceret angiogenese manifesteret ved dybe EF hyperplasi [27]. Som vist i fig. 1A-D, tre separate αHS kloner (AO4B08, EV3C3, og HS4E4) fortrinsvis farvet for HS epitoper lokaliseret til tumorvaskulaturen,

dvs.

αHS viste stærk co-lokalisering med EF markører von Willebrand faktor (vWF) og integrin avp3, hvor sidstnævnte er et kendt markør af aktiveret endotel [28]. HS epitoper genkendt af det samme sæt af αHS antistoffer viste sig at også udtrykkes i primære humane EC’er (HUVEC’er) (fig. S1A-C). Specificiteten af ​​αHS for HS

in vitro

blev vist ved markant reduceret binding til EC’er efter behandling med heparanase lyase der enzymatisk nedbryder HS (fig. S1D). Specificiteten af ​​αHS til HS var også sandt

in vivo

i glioblastom xenograft tumor sektioner, som heparanase behandling resulterede i et fuldstændigt tab af αHS farvning (fig. 1E, højre øverste panel). Dernæst udføres farvninger med et antistof (3G10), der er kendt for specifikt at genkende HSPG kerneprotein med en resterende HS stub efter behandling med heparanase, men det betyder ikke genkende enten frie HS kæder eller intakt HSPG [29]. Ubehandlede tumor sektioner viste ingen farvning med 3G10 (fig. 1E, nederste venstre panel), mens tumor sektioner behandlet med heparanase viste betydelig positivitet for 3G10 epitop overvejende lokaliseret til fartøjet-lignende strukturer, der nøje lignede de αHS farvningsmønster (jf fig. 1E, nederste højre panel og øverste venstre panel). Tilsammen udgør disse undersøgelser identificerer flere αHS kloner, der genkender HS epitoper forbundet med intakte HSPGs rigelige i det vaskulære niche af glioblastom tumorer.

, Patient glioblastom tumor sektioner blev farvet for HS hjælp af αHS antistofferne AO4B08 (A og D) , EV3C3 (B) eller HS4E4 (C) (grøn) og for vWF (A-C, endotel markør, rød) eller integrin avp3 (D, markør af aktiveret endotel, rød), og analyseret ved fluorescensmikroskopi. Stærk co-associering mellem HS epitoper og tumorvaskulatur er angivet med flettede billeder (A-D, højre paneler; gul). De viste billeder er repræsentative for tre forskellige tumorer og mindst fem sektioner pr tumor, og blev opnået ved 20 ganges forstørrelse. Scale bar, 50 uM. E, Øvre paneler: Specificitet af αHS blev vurderet ved AO4B08 farvning af U-87 MG glioblastom xenograft tumor sektioner efter enten ingen behandling (Ctrl) eller forbehandling med heparinase III lyase (HS lyase) at fordøje HS. Lavere paneler: 3G10 antistof blev anvendt til at påvise HS stubbe af HSPGs der bliver tilovers efter HS lyase fordøjelse. Expecedly, 3G10 farvning var ikke påviselig i ubehandlede tumor sektioner med intakt HS (Ctrl, venstre panel); dog 3G10 farvning af HS lyase behandlede prøver (højre panel) viser et fartøj lignende mønster, der i høj grad ligner AO4B08 farvning (øverste venstre panel). Scale bar, 20 uM

Funktionelle Virkninger af αHS i primære humane EC’er

Baseret på den hypotese, at HSPGs er egnede mål for anti-angiogenetisk behandling [3]. – [10], [13] – [18] vi næste udførte en række funktionelle undersøgelser med primær human EC’er. I overensstemmelse med en rolle HSPGs i EF-funktion, HS mimetiske heparin markant reduceret EF proliferation på en dosis-afhængig måde (Fig. 2A). Det samme var tilfældet for den lavmolekylære heparin sammensatte tinzaparin (Fig. 2B), som er et meget anvendt antikoagulant, og det er i øjeblikket under efterforskning for sin tumor hæmmende effekt hos patienter med lungecancer (https://clinicaltrials.gov/ct2/? show /NCT00475098 term = tinzaparincancer . rang = 7)

, HUVEC’er blev dyrket i serumfrit medium i nærværelse af de angivne koncentrationer af enten heparin (A) eller heparin med lav molekylvægt, Tinzaparin (B ). Celleproliferation blev bestemt ved måling af inkorporeret [

3H] thymidin i løbet af en periode på 48 timer. C, HUVEC’er blev dyrket i serumfrit medium i fravær (Ctrl) eller nærvær af AO4B08 (αHS, 3 ug /ml) i 72 timer. Cellemorfologi blev visualiseret ved krystalviolet-farvning, og taget med et inverteret lysmikroskop udstyret med et digitalt kamera. Venstre og midt paneler viser repræsentative billeder af en aflang EF fænotype i αHS behandlet i forhold til kontrol celler. Højre panel viser kvantitativ analyse af længden af ​​individuelle celler i tre separate mikroskopiske felter per brønd (n = 4), ved hjælp Billede J software. D, HUVEC’er blev dyrket på matrigel,

dvs.

et tumor-afledt ekstracellulær matrix, i serumfrit medium i fravær (Ctrl) eller nærvær af AO4B08 (αHS; 3 ug /ml) og fik lov til at danne rør i ca. 20 timer. Venstre og midt paneler viser repræsentative billeder af øget rør dannelse i αHS behandlet i forhold til kontrol celler fra mindst tre uafhængige forsøg. Højre panel viser kvantitativ analyse af antallet af intakte rør fra tre mikroskopiske felter per brønd (n = 4) ved anvendelse Billede J software. E og F, αHS stimulerer EF proliferation: HUVEC’er blev dyrket i serumfrit medium i fravær eller nærvær af AO4B08 (αHS) i de angivne koncentrationer og bedømt for proliferation efter [

3H] thymidininkorporering over en periode på 3 timer. F, HUVEC’er blev udsat for cellecyklus fase analyse efter 6 timer uden (Ctrl) eller med AO4B08 (αHS) behandling. Fraktion af celler i den respektive celle cyklus fase blev bestemt ved flow-cytometri efter kernefarvning med propidiumiodid. Data er præsenteret som den gennemsnitlige ± S.D. * Statistisk forskellig fra ubehandlet Ctrl, P. 0,05

En væsentlig ulempe med hepariner er deres uspecifik virkningsmekanisme og potentielt alvorlige bivirkninger. Vi besluttede derfor at undersøge muligheden for antistof-baserede målretning af HS som en mere specifik og rationel antiangiogen strategi, i første omgang at studere en af ​​de tidligere valgte αHS,

dvs..

AO4B08, om EF-funktion. AO4B08 behandlet EC’er vises en aflang morfologi med en stigning på ca. 75% af den gennemsnitlige celle-længde sammenlignet med ubehandlede celler (fig. 2C). EF forlængelse er kendt for at være forbundet med et rør formgivning og spiring EF fænotype [30]. Følgelig blev AO4B08 fundet at fremme kanaldannelse 2-fold i sammenligning med kontrolceller (fig 2D.). Desuden blev αHS fundet at øge EF proliferation på en dosis-afhængig måde med en maksimal stimulering af ca. 3,5 gange i sammenligning med kontrol (fig. 2E). Især blev AO4B08 medieret stimulation af EF proliferation vist allerede ved 3 timers behandling, hvilket tyder på en relativt hurtig reaktion. Effekten af ​​AO4B08 på EF-proliferation blev opretholdt efter 24 timers AO4B08 behandling (fig. S2). Stimulering af EF spredning af AO4B08 blev yderligere understøttet af en øget brøkdel af celler i S-fasen, og en tilsvarende reduktion af G1-fasen i AO4B08 behandlet i forhold til kontrol-celler (fig. 2F).

αHS Beskytter primære humane EC’er fra hypoxi og Starvation Associated celledød

som hypoxi og næringsstof mangel er karakteristiske træk ved tumormikromiljøet [31], og som hypoxi har vist sig at modulere celle-overflade HS sammensætning EC’er i en øget vækst faktor bindende kapacitet [32], vi ræsonnerede, at antistof-medieret blokering af HS kan sensibilisere EC’er i forbindelse med hypoxi og sult. Til dette formål EC’er blev dyrket ved hypoxi (1% O

2) i nærvær eller fravær af AO4B08, og vurderet for apoptose ved analyse af spaltede caspaser. Serum udsultning af hypoxiske EC’er induceret caspase 3 og 7 aktivering i EC’er og interessant, caspase spaltning blev effektivt mod handlet af AO4B08 behandling (fig. 3A). I yderligere støtte af disse data blev AO4B08 vist signifikant at øge antallet af levedygtige EC’er på hypoxisk og serum-mangel betingelser (fig. 3B). I alt ovenstående data tyder på, at en αHS vist at genkende tumorvaskulatur-hjemmehørende HS strukturer kan udøve pro-angiogene virkninger i EC’er.

, HUVEC’er blev dyrket i 72 timer i fuld medium (10% FBS), serum frit medium, eller i serumfrit medium suppleret med AO4B08 (αHS; 3 ug /ml) som angivet under hypoxiske betingelser (1% O

2). Cellelysater blev analyseret for total og spaltes caspase-3 og 7 samt α-tubulin ved immunoblotting. Øvre panel viser repræsentative immunoblots fra tre uafhængige forsøg. Lavere paneler viser kvantificering af spaltede caspase /samlede caspase nøgletal fra et repræsentativt eksperiment. B, blev HUVEC’er dyrket i serumfrit medium i fravær (Ctrl) eller nærvær af AO4B08 (αHS; 3 ug /ml) under hypoxiske betingelser i 72 timer, og derefter farvet med krystalviolet. Venstre panel viser repræsentative billeder af farvede celler. Højre paneler viser kvantitativ analyse af levedygtige celler. Data er præsenteret som den gennemsnitlige ± standardafvigelse. * Statistisk forskellig fra ubehandlet Ctrl, P. 0,05

αHS Mediated Cell Stimulation er Specifikt for HS, men er ikke HS epitop eller Cell Specifik

Vi næste undersøgt specificiteten af ​​den funktionelle effekter af αHS. AO4B08 stimulering af EF proliferation optrådte strengt afhængig HS binding som angivet ved effektiv tilbageførsel af heparin i en dosisafhængig måde (fig. 4A). Allerede ved den laveste heparin anvendte koncentration (10 ug /ml), blev ca. 75% af AO4B08-afhængig proliferation inhiberes, og ved 100 pg /ml effekten var fuldstændigt ophævet (fig. 4A). Vigtigt er det, vi endvidere fundet, at yderligere αHS kloner vist at genkende glioblastom tumorvaskulatur, HS4E4 og EV3C3 (fig. 1), også stimuleret EF proliferation, og at denne virkning var effektivt modvirket af heparin (fig. 4C). Det skal bemærkes, at i proliferationen eksperimenterne vist i fig. 2A, celler blev behandlet med heparin i 48 timer, mens der i de αHS vending eksperimenter celler blev inkuberet med heparin kun til 3 timer (Fig. 4A og C). Vigtigere, forskellige varianter af CS,

dvs..

En glycosaminoglycan nært beslægtet med heparin, var ikke i stand til at vende den stimulerende virkning af αHS (fig. 4B). Endvidere under disse betingelser, heparin (10 pg /ml) effektivt hæmmede αHS celleoverfladebindende (fig. S3B). Selv om disse resultater viser, at αHS-medierede virkninger på EF proliferation er HS specifikke, men ikke begrænset til en bestemt HS epitop, blev den stimulerende virkning mest udtalt for EV3C3 efterfulgt af AO4B08 og HS4E4 (fig. 4C). Disse resultater syntes at korrelere med celleoverfladen overflod af den respektive αHS epitop,

dvs.

EC’er fortrinsvis bundet αHS i EV3C3 HS4E4 (Fig S3A.). Endvidere er virkningen af ​​de forskellige αHS kloner syntes ikke at være direkte forbundet med den cellulære fordeling af deres respektive epitop, som AO4B08 og HS4E4 farvninger viste et lignende mønster langs cellens periferi, hvorimod EV3C3 viste en mere diffus farvning med øget tæthed mod perinukleære region (fig S1A-C.)

A, HUVEC’er blev dyrket i serumfrit medium i fravær (hvide søjler) eller nærvær af AO4B08 (sorte bjælker; 1,25 ug /ml). og med den angivne koncentration af heparin i 3 timer og vurderet for celleproliferation af [

3H] thymidin inkorporering assay. * Statistisk forskellig fra ubehandlet kontrol, P 0,05; # Statistisk forskellig fra AO4B08-behandlet, P 0,05. Kontrolceller blev inkuberet uden antistof. B, blev HUVEC’er dyrket i serumfrit medium i fravær (hvide søjler) eller nærvær af AO4B08 (sorte bjælker; 1,25 ug /ml) uden (Ctrl) eller med CS-6, CS4, eller CS-0 (10 ug /ml), som indikeret. Celleproliferation blev bestemt ved [

3H] thymidin inkorporering assay. * Statistisk forskellig fra ubehandlet kontrol, P 0,05. C, HUVEC’er blev dyrket i serumfrit medium i fravær (hvide søjler) eller nærvær af heparin (sorte bjælker; 10 pg /ml) uden eller med de forskellige αHS antistof-kloner (1,25 ug /ml), som indikeret. Celleproliferation blev bestemt ved [

3H] thymidin inkorporering assay. * Statistisk forskellig fra ubehandlet kontrol, P 0,05; # Statistisk forskellig fra αHS-behandlet, P 0,05. D vildtype (CHO-K1) -celler og PG- deficiente (PgsA-745) CHO-celler blev dyrket i serumfrit medium i fravær eller tilstedeværelse af forskellige αHS antistof-kloner (1,25 ug /ml), som indikeret. Celleproliferation blev bestemt ved [

3H] thymidin inkorporering assay. * Statistisk forskellig fra ubehandlet kontrol, P 0,05; # Statistisk forskellig fra αHS-behandlede CHO-K1-celler, P 0,05. E og F, human umbilical arterie EC’er (HUAECs e) og U-87 MG glioblastom-celler (F) blev dyrket i serumfrit medium i nærvær af AO4B08 (αHS) i de angivne koncentrationer og proliferation blev bestemt ved [

3H] thymidin inkorporering assay. * Statistisk forskellig fra ubehandlet kontrol, P. 0,05

Det særlige ved αHS og afhængigheden af ​​HSPG for deres stimulerende virkninger var næste undersøgt ved hjælp af vildtype (CHO-K1) og mutant (pgsA- 745) CHO-celler, genetisk deficiente i xylosyltransferase (XT). XT katalyserer det første trin i HSPG samling,

dvs.

. koblingen af ​​xylose til specifikke serinrester i PG kerneproteinet. PgsA celler udtrykker ca. 5% HSPG sammenlignet med vildtypeceller [33]. Behandling af CHO-K1-celler med AO4B08, EV3C3 samt HS4E4 resulterede i en næsten 2-fold stigning i proliferation, hvilket viser, at de stimulerende virkninger af αHS ikke var begrænset til HUVEC’er (fig. 4D). Dette blev forstærket af den konstatering, at αHS inducerede spredning af menneskelig navlestrengen arterie EC’er (HUAEC),

dvs

anden kilde til primære humane EC’er, såvel som den menneskelige glioblastom cellelinie U-87 MG i en dosisafhængig måde og i samme omfang som i HUVEC’er (fig. 4E og F). Vigtigere, HSPG-deficiente mutante celler reagerer på alle de undersøgte αHS (fig. 4d), hvilket giver genetisk bevis for, at αHS-medieret aktivering af celleproliferation kræver uforstyrrede HS funktion.

αHS Afhængig Stimulering af proliferation Omfatter p38 MAPK Signaling Aktivering

Vi næste ønskede at belyse, om αHS induceret celleproliferation involveret en specifik signalvej. Ved hjælp af en phosphorylering-specifik receptortyrosinkinase array, fandt vi, at αHS behandling ikke aktiverede receptorer af kendte HS-bindende vækstfaktorer,

dvs.

FGF’er, PDGF’er, og VEGF’erne, sammenlignet med ubehandlede EC’er (Fig. 5A ). Disse resultater antyder, at mekanismen for αHS-medieret stimulering af EC’er ikke skyldes en direkte efterligning virkning HS-bindingsligander. Interessant, ved anvendelse af en phosphorylering-specifik kinase array, blev αHS behandling har en signifikant inducerer phosphorylering af p38 MAPK (cirka 2,5 gange) i sammenligning med ubehandlede EC’er (Fig. 5B). Array data blev bekræftet ved western blotting, viser tidsafhængig og forbigående induktion af p-p38 MAPK ved αHS (fig. 5C). Endvidere resulterer phosphorylering af CREB, en kendt nedstrømsmål af p38 MAPK [34], syntes at være forøget ved αHS behandling (med ca. 35% i forhold til kontrol) (fig. 5B). Imidlertid phosphorylering af en anden MAPK bredt impliceret i proliferation signalering, ekstracellulært signal reguleret kinase 1/2 (ERK1 /2), var upåvirket af αHS behandling (fig. 5B). Virkningen af ​​αHS på p38 MAPK signaleringsaktivering syntes at være en mere generelt fænomen, som en lignende reaktion blev fundet i mikrovaskulære EC’er isoleret fra muse lunge (fig. 5D) [35] samt i U-87 MG glioblastom-celler (Fig . S4A)

HUVEC’er blev inkuberet i serumfrit medium med eller uden αHS (AO4B08;. 1,5 ug /ml) i 5, 15, 45 og 60 min, og phosphorylerede receptortyrosinkinase proteiner blev bestemt på puljet cellelysater ved humane anti-phospho receptortyrosinkinase-antistof array analyse som beskrevet under

Metoder

. Vist er repræsentative immunblots fra to uafhængige forsøg. Indiceret områder viser FGFR, kolonne 1: FGFR1; 2: FGFR2; 3: FGFR3; 4: FGFR4. PDGFR, kolonne 1: PDGFRα; 2: PDGFRβ; 3: SCFR; 4: Flt3. VEGFR, kolonne 1: VEGFR1; 2: VEGFR2; 3: VEGFR3. B, blev HUVEC’er inkuberet i serumfrit medium med eller uden αHS (EV3C3 1.5 ug /ml) i 5, 15, 45 og 60 min, og phosphorylerede kinaseproteiner blev bestemt på puljede cellelysater af humane anti-phospho-kinase-antistof-array analyse som beskrevet under

Metoder

. Venstre paneler viser repræsentative immunoblots fra tre uafhængige forsøg. Right panel viser kvantificering af p-p38 MAPK, p-CREB, og p-ERK1 /2 niveauer på de forskellige betingelser, præsenteret som relative intensiteter

vs.

Vifte reference (rød boks). C, HUVEC’er var enten ubehandlede (Ctrl) eller inkuberes med αHS (AO4B08; 1,25 ug /m) for de angivne perioder efterfulgt af immunoblotting for phospho-p38 MAPK, total p38 MAPK og α-tubulin. Venstre panel viser repræsentative immunoblotter af tre separate forsøg. Højre panel viser kvantificering af relative phospho-p38 MAPK niveauer (P-p38 /α-tubulin) fra et repræsentativt eksperiment. D, Samme forsøg som i (C) blev udført med muse lunge mikrovaskulære EC’er, der viser sammenlignelig induktion af p38 MAPK phosphorylering med αHS som i HUVEC’er. E-F, αHS proliferation afhænger af p38 MAPK. Proliferation blev bestemt ved [

3H] thymidin i muse EC’er (E) og U-87 MG glioblastom-celler (F) efter behandling med p38 MAPK inhibitor SB203580 (1 uM) og /eller αHS (AO4B08; 1,25 ug /ml) i 3 timer, som angivet. Basal celle proliferation blev ikke signifikant påvirket af p38 MAPK hæmning mens αHS induceret proliferation blev næsten fuldstændig vendt. * Statistisk forskellig fra ubehandlet kontrol, P 0,05; # Statistisk forskellig fra αHS-behandlet, P. 0,05

Flere vækstfaktorer, måske vigtigst pro-angiogene FGF har VEGF, og PDGF vist sig at udløse p38 MAPK aktivering i bestemte celletyper [ ,,,0],36]. Vi udførte således en række angiogenese og tyrosinkinasereceptor phosphorylering antistof Array eksperimenter for at belyse, om cellestimulerende effekter og p38 MAPK-aktivering med αHS kan være sekundær til induktion af specifikke vækstfaktorer og deres respektive signaleringsreceptorer. Men vi var ude af stand til at finde signifikant induktion af αHS enten af ​​disse vækstfaktorer eller deres receptorer (data ikke vist). Til direkte studere den funktionelle betydning af p38 MAPK signalering i αHS-medieret proliferation, anvendte vi den veletablerede p38 MAPK inhibitor SB203580 [34], [37]. Forventeligt, inhibitoren effektivt modvirket p38 MAPK-aktivering i HUVEC’er (fig. S4b), og nedsat serum samt αHS-medieret aktivering af p38 MAPK nedstrøms target CREB (fig. S4C). SB203580 blev vist at inhibere basal p-CREB (fig. S4C) og proliferation i ikke-stimulerede HUVEC’er (data ikke vist), men ikke i muse-EC’er og U-87 MG glioblastom-celler (Fig. 5E og F),

dvs

yderligere undersøgelser blev udført i de sidste celletyper. Interessant nok blev αHS proliferation af muse EC’er (Fig. 5E) såvel som glioblastom celler (Fig. 5F) effektivt svækket ved p38 MAPK-inhibering. Tilsammen udgør disse data indikerer, at bindingen af ​​αHS til celle-overflade HSPGs ECS samt glioblastom celler udløser en p38 MAPK-afhængig signalvej resulterer i øget proliferation.

Diskussion

Antistof baseret tumor vaskulær målretning til behandling af cancer er baseret på den kendsgerning, at tumorer kræver angiogenese for at udvide og metastasere, og at EC’er står lumenet af blodkar og er således relativt tilgængelige til systemisk terapi. Begrundelsen for HSPG-dirigeret antitumorterapi er muligheden for simultan multi-targeting af visse centrale pro-angiogene proteiner, vigtigst VEGF-A, FGF’er, HB-EGF, PDGF, og IL-8, hvilket kan fremme tumorangiogenese i en delvist redundant måde med implikationer for behandling modstand. I den foreliggende undersøgelse har vi identificeret adskillige αHS kloner, som genkender HS epitoper rigeligt udtrykt i vaskulaturen af ​​malignt gliom tumorer. Uventet, finder vi, at disse αHS stimulerer flere aspekter af EF-funktion,

dvs..

Differentiering, dannelse rør, spredning og modstandsdygtighed over for hypoxi og sult afhængig celle-død. Vi leverer dokumentation for, at disse effekter er specielt afhængige af αHS bindende, og er ikke relateret til uspecifikke interaktioner. Vigtigt er det, de stimulerende virkninger syntes at involvere flere HS-epitoper, som AO4B08, EV3C3 samt HS4E4 alle viste stimulerende aktivitet, som syntes at være direkte korreleret med deres respektive celle-overflade overflod i EC’er. Endvidere blev αHS stimulering findes i tre forskellige typer af primære EC’er,

dvs.

HUVEC’er, HUAECs, og muse lunge mikrovaskulære EC’er, såvel som i transformerede CHO-celler og humane U-87 MG glioblastom-celler, hvilket tyder ., at vores resultater har mere generel relevans

Tidligere undersøgelser yde støtte til begrebet HSPG som en relevant mål for kræftbehandling [7] – [18]. Disse strategier har hovedsageligt været fokuseret på heparin, dets derivater, og andre polyanioniske forbindelser, såsom suramin [18]. Andre strategier til at forstyrre HSPG funktion omfatter falske substrater for HS biosyntese,

dvs..

Xylosides [38], hæmning af HS-nedbrydende enzymer [39], og genetisk manipulation af HS biosyntetiske maskiner [40]. De påviste inhiberende virkninger af disse forbindelser kan hovedsagelig forklares ved direkte konkurrence blokering af ligand-HSPG interaktioner derved dæmpe nedstrøms receptor signalering aktivering (polyanioniske forbindelser), eller ved at modulere den biologiske tilgængelighed af HSPGs for ligandbinding (xylosides, enzymer, genetiske strategier). Interessant vore data viser, at den dominerende virkning af antistof-binding til cellulære HSPGs er at direkte fremme celleaktivering, frem for at blokere HS ligand-afhængig celleaktivering. På et mekanistisk niveau, binding af αHS til HSPGs ECS samt glioblastom celler viste sig at udløse p38 MAPK-afhængig signalering, og uforstyrrede p38 MAPK funktion var påkrævet for αHS-medierede celle stimulation. I denne sammenhæng er det bemærkelsesværdigt, at andre HS-bindende ligander har vist sig at stimulere EC’er gennem p38 MAPK-vejen [41]. Denne intracellulære kinase blev oprindeligt identificeret som en vigtig pro-inflammatorisk mediator og blev senere fundet at være involveret i flere cellulære processer og i sygdomme, herunder cancer [36]. Faktisk har p38 MAPK været impliceret som en undertrykker af maligne processer,

f.eks.

Onkogen-medieret celleældning og kontaktinhibering. Andre undersøgelser har imidlertid vist, pro-migrerende og invasive virkninger af p38 MAPK-aktivering i cancerceller og stromale celler [36]. Ligesom andre MAPK’er, funktionerne af p38 er afhængig af sine down-stream kinaser, herunder serin /threoninkinaser, såsom p38-regulerede /aktiveret kinase (Prak) og MAPK-aktiveret kinase-2, og mange forskellige opstrøms kinaser, såsom som MKK3 /6, MKK4, samt MAPKK uafhængige signaler. Cellespecifik samt subcellulære lokalisering specifikke virkninger føje til kompleksiteten af ​​p38-funktion. I forbindelse med tumorangiogenese det er af særlig interesse, at p38 nylig blev vist at aktivere tumor EC’er gennem Prak [42]. Fremtidige studier vil have at afklare, om Prak og hvilke alternative p38 nedstrøms signalering mekanismer er involveret i αHS-medierede pro-angiogene virkninger. Desuden var vores studier begrænset til de registreres af antistoffet vifte kinaser,

dvs

andre kinaser ikke indgår i array kunne aktiveres ved αHS udover p38.

Den dominerende celle-overflade