PLoS ONE: A Novel berbamine Afledte Hæmmer Cell Levedygtighed og inducerer apoptose i Cancer Stem-lignende celler af human glioblastom, via opregulering af miRNA-4284 og JNK /AP-1 Signaling

Abstrakt

glioblastoma ( GBM) er den mest almindelige primære hjernetumor, der tegner sig for ca. 40% af alle centralnervesystemet maligniteter. Trods standard behandling bestående af kirurgisk resektion, strålebehandling og /eller kemoterapi, er prognosen for GBM er dårlig; med en median overlevelse på 14,6 måneder. Kræften stamcelle eller cancer-initierende celle model har givet et nyt paradigme for forståelse udvikling og gentagelse af GBM efter behandling. Berbamine (BBM) er en naturlig forbindelse afledt af

Berberis amurensis

plante, og sammen med dets derivater, er blevet vist at udvise antitumorvirkning i flere kræftformer. Her, vi rapporterede, at en hidtil ukendt syntetisk berbamine derivat, BBMD3, hæmmer cellernes levedygtighed og inducerer apoptose af cancer stamceller-lignende celler (CSCS) på en tids- og dosisafhængig måde, når de CSCS fra fire GBM patienter (PBT003, PBT008, PBT022 og PBT030) blev dyrket. Disse CSCS voksede i neurosfærer og udtrykte CD133 og nestin som markører. Behandling med BBMD3 ødelagt neurosfæren morfologi, og førte til induktionen af ​​apoptose i CSCS. Induktion af apoptose i disse CSCS er afhængig aktivering af caspase-3 og spaltning af poly (ADP-ribose) polymerase (PARP). MicroRNA-4284 (miR-4284) viste sig at være overudtrykt omkring 4 gange i CSCS følgende BBMD3 behandling. Endvidere transfektion af syntetisk anti-sense oligonucleotid mod human MIR-4284 delvist blokeret anticancer virkninger BBMD3 på GBM afledte CSCS. BBMD3 også øget phosphorylering af c-Jun N-terminal kinase (JNK) /stress-aktiveret proteinkinase (SAPK), hvilket resulterer i en stigning ekspression af phosphoryleret c-Jun og total c-Fos; de vigtigste komponenter i transkriptionel faktor AP-1. JNK-c-Jun /AP-1-signalering pathway spiller en vigtig rolle i induktionen af ​​apoptose som respons på UV-bestråling og nogle medicinske behandlingsmetoder. Målretning glioblastoma stamceller-lignende celler med BBMD3 er derfor hidtil ukendt og kan have lovende som et effektivt terapeutisk strategi til behandling af GBM patienter

Henvisning:. Yang F, Nam S, Brown CE, Zhao R, Starr R, Horne DA, et al. (2014) A Novel berbamine Afledte Hæmmer Cell Levedygtighed og inducerer apoptose i Cancer Stem-lignende celler af human glioblastom, via opregulering af miRNA-4284 og JNK /AP-1-signalering. PLoS ONE 9 (4): e94443. doi: 10,1371 /journal.pone.0094443

Redaktør: Jeffrey K. Harrison, University of Florida, USA

Modtaget: November 12, 2013; Accepteret: 17 marts 2014; Udgivet: 14 April, 2014

Copyright: © 2014 Yang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Finansiering af undersøgelsen blev leveret af en bevilling fra National Institutes of Health /National Cancer Institute # CA-1155674 til RJ og opstart finansiering til RH fra Beckman Research Institute. Forskning rapporteret i denne publikation indgår arbejde udført i Translationel Biomarkør Discovery Core, som støttes delvist af National Cancer Institute of National Institutes of Health under award nummer P30CA33572. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

glioblastoma (GBM) er den mest almindelige og dødelige primær hjernetumor. Trods de nuværende fremskridt i multimodalitet terapi, som omfatter kirurgi, strålebehandling og kemoterapi, prognose stadig meget dårlig for patienter, der typisk har en median overlevelse på mindre end 15 måneder [1], [2]. De fleste af GBM læsioner hurtigt udvikle sig fra en mindre ondartet forløber læsion, som der er ringe eller ingen kliniske, radiologiske eller morfologisk beviser, og det er blevet påvist, at en meget tumorigen subpopulation af kræftceller, kaldet GBM stamceller, fremmer modstand mod kemo- og radio- terapi [3] – [5]. Disse cancer stamceller eller tumor-initierende celler deler nogle kritiske egenskaber med normale, neurale stamceller, herunder ekspression af flere biomarkører, og evnen til selvfornyelse, differentiering og proliferation. På grund af den dårlige prognose for GBM patienter efter eksisterende behandlinger, udvikling af mere effektive protokoller til behandling af GBM er et presserende behov. Men fremskridt langsommere protokol udvikling er fortsat afhængige af yderligere forbedring af vores forståelse af de processer, der driver kræft invasion, indtræden af ​​resistens over for terapeutiske indgreb og mekanismer kørsel tumor tilbagefald i GBM patienter. Således kræver den effektive behandling af GBM direkte målrette disse GBM stamceller inden tumormassen, da de er de celler, der er resistente over for standardbehandlinger [6]. I denne henseende, Brown et al [7] for nylig givet et rationale for at udvikle et immunterapeutisk tilgang til udryddelse af GBM stamcelle befolkning ved at rapportere, at menneskelig tumor stamceller /initierende celler fra GBM patienter kunne anerkendes og dræbt af CD8

+ cytotoksiske T-lymfocytter.

Ud over denne immunologisk fremgangsmåde, microRNA (miRNA), som er en relativt ny klasse af små ikke-kodende RNA molekyle som findes i eukaryote celler, har vist sig at regulere et bredt spektrum af genekspression mønstre via en post-transkriptionel mekanisme [8]. Og en betydelig mængde beviser nu viser, at miRNA spiller nøgleroller i patogenesen af ​​kræft, og kan fungere enten som onkogener eller tumor undertrykkere [9]. Det er også blevet rapporteret, at høj ekspression af MIR-196 og miR10b i GBM patienter korrelerer med en dårlig prognose [10], og at nedregulering af MIR-128 fører til reduktion af selvfornyelse evne gliom stamceller ved at hæmme Bmi1 genekspression. Således er miRNA hurtigt frem som lovende mål for udvikling af nye, men meget selektive anticancer terapeutiske midler.

Flere år siden, berbamine (BBM), en naturlig bis-benzylisoquinoline alkaloid, blev identificeret fra den traditionelle kinesiske medicin

Berberis amurensis

, og sammen med flere af dets derivater, blev rapporteret at have kraftig antitumoraktivitet mod lymfom, myelom, hepatocellulær carcinom, lungecancer og brystcancer og lav ikke-specifik toksicitet [12] – [16] . BBM blev rapporteret at inducere apoptose i human myelom, og til at undertrykke væksten, migration og invasion af højt metastatiske humane brystcancerceller gennem inhibering NF-kappaB (NF-KB) aktivitet og dens downstream mål, såsom cyclin D1, Bd-XL og survivin [13], [14]. Således lav ikke-specifik toksicitet BBM, og visse derivater, gør fortsat udvikling af disse hidtil ukendte forbindelser potentielt lovende som effektive anti-cancer lægemidler til en række forskellige typer af cancer. Mod dette mål, vores laboratorium undersøgt tretten hidtil ukendte BBM derivater (BBMDs), som blev syntetiseret ud fra naturlige BBM. Vi fandt, at BBMD3 er den mest potente af denne serie af hidtil ukendte BBMDs til drab cancerceller. BBMD3 udviste over en 6-fold forøgelse i anticanceraktivitet mod melanom og prostata cancerceller sammenlignet med naturlig BBM. Dette blev tilskrevet hæmning af JAK2 /STAT3 signalvejen [17]. For nylig rapporterede vi også, at BBMD3 inhiberer cellelevedygtigheden, og inducerer apoptose i humane osteosarcomceller, som i dette tilfælde blev tilskrevet aktivering af JNK /AP-1-signalering pathway [18].

superfamilie af mitogenaktiverede proteinkinaser (MAPK’er) omfatter: c-Jun N-terminale proteinkinase (JNK) /stress-aktiveret proteinkinase (SAPK); p38; og ekstracellulær signal-reguleret kinase (ERK). Generelt JNK og p38 er centrale mediatorer af reaktionen på stress og inflammation, mens ERK kaskade oftest induceres som respons på vækstfaktorstimulering [19], [20]. Den JNK stress vej deltager i mange forskellige intracellulære processer, herunder cellevækst, differentiering, transformation og apoptose [21], [22]. De JNK proteinkinaser er kodet af tre gener, hvoraf

Jnk1

JNK2

udtrykkes af alle væv, og

JNK3

gen er begrænset til en mere begrænset mønster af udtryk såsom i hjerne og hjerte [22]. JNK blev oprindeligt identificeret ved sin evne til specifikt at phosphorylere transkriptionsfaktoren c-Jun på dens N-terminale trans-aktiveringsdomænet i Ser63 og Ser73 [23]. c-Jun er en vigtig del af aktiverende protein-1 (AP-1), som er en dimer transkriptionel faktor, og er sammensat af proteiner fra flere genfamilier [24]. Selvom JNK /c-Jun eller JNK /AP-1-vejen har dobbelt roller i apoptose, er det klart, at aktivering af JNK-vejen er involveret i induktionen af ​​apoptose ved hjælp af specifikke celledød stimuli, såsom UV-bestråling og behandling med visse lægemidler [25] – [27].

i vores foreliggende undersøgelse viser vi, at et hidtil ukendt syntetisk BBM-derivat (BBMD3) inducerer apoptose i cancerceller stamceller-lignende celler, som er dyrket fra GBM patienter. Vi viser også, at celledrab er associeret med opregulering af miRNA-4284 og JNK /AP-1-signalering pathway.

Materialer og metoder

Reagenser og antistoffer

BBMD3 blev syntetiseret ved omsætning af naturlig BBM med NH

2-holdige substituenter. Strukturen og renheden af ​​produkterne blev analyseret ved anvendelse af HNMR-spektroskopi. BBMD3 vises over 98% renhed ved NMR-analyse. Humane miRNA-hæmmere (syntetiske oligonukleotider) mod HSA-miRNA-4284 og har-miRNA-27a blev købt fra GeneCopoeia. RNAiFect transfektionsreagens blev indkøbt fra Qiagen Inc. Rekombinant human epidermal vækstfaktor (EGF) og fibroblast vækstfaktor basisk (FGF) blev opnået fra R mens kontrollerne fik samme mængde kun køretøjet.

cellelevedygtighed assays

Cell levedygtighed blev udført med CellTiter 96 Vandig One Solution Cell Proliferation Assay fra Promega, som indeholder 3- (4 , 5-dimethylthiazol-2-yl) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulfophenyl) -2H-tetrazolium (MTS). Hver brønd i en 96-brønds plade blev podet med 5000 celler suspenderet i dyrkningsmedium. Celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af lægemiddel. Efter 24 timer eller 48 timer af behandlingen, blev MTS tilsat til cellerne ifølge leverandørens protokol, og absorbansen af ​​reaktionsproduktet dannet af de dyrkede celler blev målt ved 490 nm med en ELISA-pladelæser.

apoptose Assay

Celler (2 x 10

5) afledt af neurosfærerne blev podet i plader med 6 brønde med komplet stamcelle medium. Den følgende dag blev cellerne behandlet i yderligere 48 timer med de angivne koncentrationer af BBMD3. Efter behandling blev alle celler opsamlet, og de apoptotiske celler blev påvist under anvendelse af et Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit (BD Biosciences). Cellerne blev farvet med Annexin V-FITC og propidiumiodid (PI) ifølge leverandørens instruktioner. Levedygtige og apoptotiske celler blev påvist ved flowcytometri i vores Analytisk cytometri Core her på City of Hope National Medical Center. Apoptotiske celler omfatter både den tidlige apoptotiske del (Annexin V-positive) og den sene apoptotiske del (Annexin V og PI-positive).

Fotografi

Normalt NS kultur, ubehandlede GBM NS kulturer afledt fra patientens hjernetumorer (dvs. PBT003, PBT008, PBT022, PBT030) eller PBT003 NS behandlet med forskellige koncentrationer af BBMD3 blev fotograferet ved 10X forstørrelse under anvendelse af et Nikon ECLIPSE TE2000-U mikroskop.

Total protein Forberedelse og Protein Assay

Efter en 24 timers inkubation med 5 uM BBMD3, celler afledt fra patientens hjernetumorer (dvs. PBT003, PBT008, PBT022 og PBT030) blev opsamlet og vasket med kold phosphatpufret saltopløsning (PBS). Derefter blev hver cellepellet tilsættes til 150 pi Cell Signaling lysepuffer (EMD Millipore), ind i hvilken vi havde anbragt en proteasehæmmer cocktail tablet (Roche, Inc., Indianapolis, IN). Efter tre successive cykler af frysning i et tøris /ethanol-bad og optøning i et 37 ° C vandbad, blev den totale proteinkoncentration af lysatet bestemmes ved anvendelse af et Bio-Rad Protein Assay kit.

Immunoblotting analyse

Tyve mikrogram totalt protein blev løst gennem en pre-cast 4-15% gradient Tris-HCl polyacrylamidgel indkøbt fra Bio-Rad (Hercules, CA). Efter gelelektroforese blev proteinerne overført til Hybond-C-membraner (Amersham), blokeret i 1 time ved stuetemperatur (RT) i 10% fedtfri tørmælk, som blev opløst i PBST (1X PBS indeholdende 0,1% Tween-20 ) og inkuberet natten over ved 4 ° C med primære antistoffer (genkende proteinerne fremgår af teksten) suspenderet i PBST indeholdende 2% fedtfri tørmælk. Efter vask af membranerne i PBST, blev peberrodsperoxidase-mærket anti-muse- eller anti-kanin sekundære antistoffer inkuberet med membranerne i 1 time ved stuetemperatur. Placeringen på Hybond-C-membran af de antigene proteiner specifikt bundet til antistofferne blev påvist med SuperSignal West Pico substrat (Pierce).

kvantitativ analyse af microRNA

I alt microRNA blev isoleret fra PBT003 , PBT008, PBT022 og PBT030 neurosfærer efter en 15 timers behandling med 5 uM BBMD3 eller kontrol bilen med miRNeasy Mini (Qiagen). Kvantificering af den relative forekomst af hver enkelt microRNA, med eller uden BBMD3 behandling, blev afsluttet i Integrativ Genomics Core på City of Hope National Medical Center. Kort fortalt blev mikro-RNA-sekventering udført under anvendelse af Illumina HiSeq2000 efter fabrikantens protokol (TruSeq små RNA Sample Prep kit, oplyse, Inc.) med mindre optimering. 500 ng af mikro-RNA blev ligeret til 3′-adapter (5 ‘TCTCTGTAGGCACCATCAATC) med T4-RNA-ligase 2 i 1 time ved 22 ° C. De ikke-ligerede 3’adaptorer blev blokeret ved annealing dem med RT-primer (5 ‘ATTGATGGTGCCTACAGAGA) ved 75 ° C i 5 min og 25 ° C i 15 minutter. Den kvantificerede denatureret mikro-RNA-biblioteket blev fyldt i 1 ml hybridiseringspuffer til en slutkoncentration på 10 kl.

Behandling af mikro-RNA Inhibitors

8000 enkeltceller afledt fra PBT008 og PBT030 neurosfærer i komplet stamceller celledyrkningsmedier blev podet i hver brønd på plader med 96 brønde. Fem timer senere blev 60 nM MIR-4284 eller MIR-27a antisense-inhibitorer transficeret i cellerne ved RNAiFect transfektionsreagens. Kontrolsekvenserne celler blev transficeret med en kontrol mikro-RNA inhibitor. 24 timer efter transfektion med mikro-RNA-inhibitorer, blev 5 uM BBMD3 tilsat til cellekulturen plader. 24 timer efter BBMD3 behandling blev cellelevedygtighed bestemt.

Statistik

Studerendes

t

test blev anvendt til at evaluere den statistiske signifikans af forskelle mellem to grupper og

s

0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Neurosfærer dyrket fra Enheder af GBM Patienter Exhibit Karakteristik af Cancer Stem-celler

Vi dyrket og udvidet kort-. udtrykket tumor neurosfærer i serumfrit stamcelle medier, (suppleret med EGF og FGF), som blev afledt fra fire primære GBM patienter, (dvs. PBT003, PBT008, PBT022 og PBT030). Disse GBM neurosfærer udviste en lignende morfologi som de normale neurale stamceller (fig. 1a). Det forlyder, at GBM stamceller-lignende celler (GBMSCs) og normale neurale stamceller (NSC) deler ekspressionen af ​​flere markører, såsom CD133 og nestin [28]. CD133 er et celleoverflademarkør udtrykt på normale humane NSC’er, og dets ekspression nedreguleres i differentierede cellelinier. Nestin er et intermediært filament protein produceret under udviklingen i stamceller oprindelse i pattedyrs centralnervesystem. Co-ekspressionen af ​​CD133 og nestin er forbundet med en dårlig prognose for malignt gliom patienter [28]. Vi observerede ved Western blot-analyse, at CD133 og nestin blev udtrykt i GBM neurosfærer dyrket fra hver af de fire GBM patienter, mens der ikke blev observeret nogen ekspression af CD133 og nestin i et etableret GMB cellelinie (dvs. U87 celler), (fig. 1B). β-actin ekspressionsniveauer blev overvåget for at sikre, at ækvivalente mængder af celleprotein blev fyldt i hver bane af gelen. Når de dyrkes i medier med serum, neurosfærerne afledt PBT003, PBT008, PBT022 og PBT030 GBM patienter har evnen til at differentiere til adhærente og neuron-lignende celler, (Fig. 1C). Cellekulturer afledt af prøver på de fire GBM patienter (PBT003, PBT008, PBT022 og PBT030) voksede i typiske neurosfærer, og bevaret evnen til selv-fornyelse og udtrykte neurale stamcelle markører, såsom CD133 og nestin når dyrket i serum- frie medier. Disse neurosfærer havde også evnen til at differentiere i serumholdigt vækstmedium. I denne rapport, vi definerede derfor disse neurosfærer som enten GBM stamceller-lignende celler eller cancer stamceller-lignende celler.

(A) morfologi PBT003, PBT008, PBT022 og PBT030 neurosfærer i stamcelle-dyrkningsmediet. (B) GBM neurosfærer udtrykte specifikke biomarkører for normale, neurale stamceller. (C) GBM neurosfærer udviser evnen til at skelne.

BBMD3 forstyrrer opbygning Neurosfærer og Hæmmer levedygtighed Cancer Stem-lignende celler dyrket fra de fire GBM Patienter

GBM afledte cancer stamceller-lignende celler, er mindre følsomme over, (eller bliver resistente over for), konventionel kemoterapi [4], [5]; fremhæve et kritisk behov for at finde nye og mere selektivt potente lægemidler til behandling af glioblastom. Berbamine, et naturligt produkt afledt af

Berberis amurensis

anlæg, synes at have cytotoksisk aktivitet mod en række forskellige kræftformer; hvilket fik fremstillingen af ​​en række analoger af berbamine. Disse analoger blev evalueret for at afgøre, om nogen af ​​dem kan være mere effektiv til at dræbe kræftceller end den oprindelige forbindelse. Vi fandt, at anticancer virkning af en af ​​de hidtil ukendte syntetiske derivater, (dvs. BBMD3), på melanom og prostatacancerceller oversteg de andre analoger [17]. Således har vi undersøgt de anticancer virkninger af BBMD3 på GBM stamceller-lignende celler, som blev afledt af neurosfærer dyrket fra GBM patientens PBT003, PBT008, PBT022 og PBT030. I løbet af undersøgelsen blev disse celler behandlet i 24 eller 48 timer i nærvær af komplet stamcelle dyrkningsmedium indeholdende 1, 3, 5, 8 eller 10 uM BBMD3. Kontrolsystemer cellekulturer blev behandlet med kun vehikel (DMSO) i stedet for BBMD3, og cellelevedygtigheden blev bestemt som beskrevet i fremgangsmåderne. BBMD3 inhiberede kraftigt levedygtigheden af ​​hvert sæt af GBM stamceller-lignende cancerceller, afledt af de enkelte neurosfærer patientgrupper, på en tids- og dosisafhængig måde (fig. 2A). En 48 timers behandling af neurosfærerne med 10 pM BBMD3 inhiberede cellelevedygtighed næsten 100%, og forstyrret strukturen af ​​neurosfærer på en dosis-afhængig måde. Figur 2B viser, at PBT003 afledte neurosfærer, behandlet med 0, 1, 3, 5 eller 10 uM BBMD3 i 48 timer, afbrudt den sfæriske morfologi af neurosfærer følgende BBMD3 behandling, og at afbrydelse af neurospherical form blev companied ved fremkomsten af ​​flydende døde celler.

(A) celler fra PBT003, PBT008, PBT022 og PBT030 neurosfærer blev behandlet med 0, 1, 3, 5, 8, 10 uM BBMD3 i 24 og 48 timer, og levedygtighed blev bestemt ved anvendelse af MTS-assay, som beskrevet i fremgangsmåderne. Hvert eksperiment blev udført tre gange. Toppen af ​​hver søjlediagram repræsenterer gennemsnittet af 3 eksperimenter, og

fejlsøjler

repræsentere ± standardafvigelsen fra middelværdien (SD). (B) BBMD3 forstyrrer strukturen af ​​neurosfærer, og induceret celle drab i en dosisafhængig måde i disse PBT003 afledte neurosfærer, når cellerne behandles i 48 timer med lægemidlet.

BBMD3 Fremkalde Caspase -3 Afhængig Apoptose of Cancer Stem-lignende celler dyrket fra Fire GBM Patienter

Fordi BBMD3 behandling dræbte GBM afledt cancer stamceller-lignende celler, vi undersøgt, om celle drab blev medieret af en apoptotisk proces. Celler (2 x 10

5) fra PBT003, PBT008, PBT022 og PBT030 neurosfærer blev podet i seks-brønds vævskulturplader, og behandlet i 48 timer med forskellige koncentrationer (0, 1, 3, 5, 10 uM) af BBMD3. Alle cellerne blev opsamlet og analyseret for ekspression af Annexin V under anvendelse af anti-Annexin V-FITC-antistof og propidiumiodidfarvning efterfulgt af relativ kvantificering via flowcytometri. Apoptotiske celler, vist i figur 3A, blev Annexin V positive (tidlige apoptotiske celler), eller Annexin V og propidiumiodid dobbelt-positive (sent apoptotiske celler). Vores resultater viser, at BBMD3 induceret apoptose i disse GBM stamceller-lignende celler i en dosis-afhængig måde. En 48 timers behandling med 10 pM BBMD3 dræbte næsten alle tumorcellerne. Aktivering af caspase-3, en kritisk inducer af den apoptotiske proces [29], resulterede i spaltning af poly (ADP-ribose) polymerase (PARP), som hjælper celler bevarer deres levedygtighed [30]. For yderligere at bekræfte, at celledrab induceret af BBMD3 er en apoptotisk proces blev Western blotting analyser udført for at detektere aktiveringen af ​​caspase-3 og spaltningen af ​​PARP i et totalt cellelysat efter en 24 timers behandling med 5 uM BBMD3. BBMD3 øget spaltning af caspase-3 til dens aktive form, og spaltningen af ​​PARP til dets inaktive form i celler afledt fra de fire neurosfære kulturer (fig. 3B). Disse data peger mod BBMD3 inducere apoptose i disse GBM stamceller-lignende celler via aktivering af caspase-3 kaskade. Vores data tyder også på, at flere mekanismer kan være involveret i induktion af celledræbende og tabet i celle levedygtighed, da, på det tidspunkt analyseres, PBT003 NS inkuberet med 5 uM BBMD3 inducerede en næsten total tab i celle levedygtighed, med en apoptose hastighed på ca. 60%; mens for PBT030 NS cellelevedygtigheden var ca. 20% efter inkubation med 5 uM BBMD3, mens apoptose var næsten 100% i denne kultur.

(A) apoptotiske celler blev analyseret for Annexin V-FITC-reaktivitet og PI-farvning ved flowcytometri. Celler fra de PBT003, PBT008, PBT022 og PBT030 neurosfærer blev behandlet med BBMD3 (0, 1, 3, 5, 10 uM) i 48 timer. Apoptotiske celler blev identificeret som værende reaktivt med Annexin V-FITC-antistof (tidligt stadium af apoptose) eller PI og Annexin V-FITC /PI double-positive (sene stadium af apoptose) celler. Hvert forsøg blev udført dobbelt eller tredobbelt, og gentaget to gange som en uafhængig kopiere. Toppen af ​​hver søjlediagram repræsenterer middelværdien af ​​de fundne værdier fra disse gentagelser, og

fejlsøjler

repræsentere ± standardafvigelsen fra middelværdien (SD). (B) Graden af ​​spaltning af caspase-3 og PARP blev bestemt efter en 24 timers behandling med BBMD3 anvendelse af Western blotting-analyser. β-actin tjener som en intern kontrol.

BBMD3 også Reducerer Levedygtighed og inducerer apoptose i ikke-stamme-lignende GBM Cells

Som vi har rapporteret, BBMD3 er cytotoksisk at dæmme -lignende GBM tumorceller; hvilket antyder, at det også skal være cytotoksisk for ikke-stamceller-lignende GBM cancerceller. For at undersøge denne mulighed, anvendte vi dyrkede U87-celler, som er en etableret ikke-stamme-lignende GBM cancercellelinie. Vi observerede, at U87-celler ikke udtrykte den neurale stam–cellemarkører CD133 og nestin (se fig. 1B til sammenligning med de stamceller-lignende GBM tumorcellelinier). Som vi forventede, BBMD3 inhiberede cellelevedygtighed og apoptose i U87-celler (fig. 4A) på en måde svarende til den, der ses med GBM stamceller-lignende celler (fig. 2A og 3A). Vores data indikerer, at BBMD3 kan dræbe både stamceller-lignende og ikke-stamceller-lignende GBM tumorceller.

(A)

Venstre panel

, U87-celler blev behandlet med 0, 1, 3, 5, 8, eller 10 uM BBMD3 i 24 og 48 timer, og levedygtighed blev bestemt ved anvendelse af MTS-assayet, som beskrevet i fremgangsmåderne.

Højre panel

, U87-celler blev behandlet med 0, 1, 3, 5 eller 10 uM BBMD3 i 48 timer og apoptotiske celler blev analyseret for Annexin V-FITC-reaktivitet og PI-farvning ved flowcytometri. (B)

Venstre panel

viser morfologien af ​​en normal human neurosfære.

Right panel

viser levedygtigheden af ​​normale føtale hjerne afledte og tumor afledte neurosfærer efter 24 timers behandling med 1, 5 eller 10 pM BBMD3. Hvert forsøg blev udført tredobbelt, og replikeres som et uafhængigt forsøg mindst to gange. Toppen af ​​hver søjlediagram repræsenterer middelværdien af ​​de fundne værdier fra disse gentagelser, og

fejlsøjler

betegne ± standardafvigelsen fra middelværdien (SD).

Normalt Menneskelig neurosfærer er mindre følsomme over BBMD3 end GBM Afledt neurosfærer

berbamine og dets derivater er også blevet rapporteret at udøve mindre af en cytotoksisk virkning mod normale humane celler [17] end mod GBM og andre typer af tumorceller. For yderligere at evaluere den differentielle cytotoksiciteten af ​​BBMD3 mod normale neurosfærer, testede vi virkningerne af BBMD3 på normale humane neurosfærer afledt fra den normale føtal hjerne. Figur 4B viser morfologien af ​​normale neurosfærer, og virkningerne af BBMD3 på normale neurosfærer og neurosfærerne udledt af de fire GBM patienter efter en 24 timers eksponering for lægemidlet. I sammenligning med de tumorafledte neurosfærer, er normal neurosfære levedygtighed reduceres ved udsættelse for stigende koncentrationer af BBMD3, men disse normale neurosfære-kulturer er mindre følsomme over for de cytotoksiske virkninger af BBMD3 end de neurosfære kulturer afledt af de 4 GBM patienter.

BBMD3 Øger Expression af miR-4284 og miR-27a i PBT003, PBT008, PBT022 og PBT030 Neurosfærer

Selvom miRNA har været kendt for kun et par år, har de vist sig at spille afgørende roller i processer medierer tumorigenese, angiogenese, celleinvasion, og apoptose i en række forskellige tumortyper. Vi undersøgte derfor, om BBMD3 behandling kunne ændre udtrykket profil miRNA i GBM stamceller-lignende celler. Neurosfærer afledt af PBT003, PBT008, PBT022 og PBT030 GBM patienter blev behandlet med 5 pM BBMD3 i 16 timer, mens kontrolceller blev behandlet med kun bærer (DMSO). Mængder miRNA blev isoleret fra disse neurosfære-kulturer, og ekspression af hvert miRNA blev kvantificeret. I forhold til kontrollerne, BBMD3 behandling opreguleret udtryk for nogle miRNA, og nedreguleret udtryk for andre miRNA. Tabel 1 viser de gennemsnitlige miRNA ekspressionsprofil, i forhold til den ubehandlede kontrol GBM stamceller-lignende celler, for hver af de fire GBM patienter efter BBMD3 behandling. MIR-7 er den mest nedreguleret miRNA, med et fald i ekspression på 1,06 gange. Derimod er de to mest opreguleret miRNA er MIR-4284 og MIR-27a; stigende 4,48 og 2,25 gange hhv. Det blev rapporteret, at opregulering af miR-23a, 27a, og 24-2 inducerer både caspase-afhængig og -uafhængig apoptose i humane embryonale nyreceller [31]. Til dato har vi ikke kunnet finde nogen publikation, der beskriver de lovgivningsmæssige funktion (er) i miR-4284.

MIR-4284 Inhibitor blokerer virkningerne af BBMD3 på levedygtigheden af ​​GBM Neurosfærer

for at bekræfte, om forøget ekspression af miR-27a og miR-4284 induceret af BBMD3 behandling korrelerer med nedgangen i GBM neurosfære levedygtighed, vi undersøgt, om miR-27a og miR-4284 anti-sense-sekvenser kunne hæmme den cytotoksiske aktivitet BBMD3. Vores første skridt var at undersøge, om disse inhibitorer alene hæmmede cellernes levedygtighed. 60 nM af humane anti-sense miRNA-hæmmere (dvs. syntetiske oligonukleotider) mod HSA-miRNA-4284 og HSA-miRNA-27a blev transficeret ind i celler, der stammer fra PBT008 og PBT030 neurosfærer. Ubeslægtet anti-sense mikro-RNA-inhibitor blev anvendt som en negativ kontrol, og 48 timer efter transfektion med disse miRNA inhibitorer blev cellelevedygtighed bestemt. Resultaterne er vist i fig. 5A viste, at miR-27a og MIR-4284 hæmmere alene ikke effektivt nedsætte cellernes levedygtighed i forhold til, at de utransficerede celler (untran). Vi derefter testet effekten af ​​MIR-27a og MIR-4284 inhibitorer på den cytotoksiske aktivitet af BBMD3 hjælp PBT008 og PBT030 neurosfærer. Efter disse GBM neurosfærer blev transficeret med, og fik lov til at udtrykke i 24 timer, den MIR-27a og MIR-4284 antisense-inhibitorer, eller kontrol miRNA inhibitorsekvensen blev celler inkuberet med 5 uM BBMD3 i yderligere 24 timer, på hvilket punkt cellelevedygtighed blev bestemt. Hvert eksperiment blev udført tre gange.