PLoS ONE: En RNA Interference Fænotypisk Screen Identificerer en rolle for FGF Signaler i Colon Cancer Progression

Abstrakt

I tumorceller, trinvis onkogen deregulering af signalering kaskader inducerer ændringer i cellulær morfologi og fremmer erhvervelsen af ​​maligne træk. Her har vi identificeret et sæt af 21 gener, herunder

FGF9

, som determinanter for tumor celle morfologi ved en RNA-interferens fænotypisk skærm i SW480 kolon kræftceller. Ved hjælp af et panel af små molekylære inhibitorer, vi efterfølgende etableret fænotypiske effekter, downstream signalering kaskader, og tilhørende genekspression underskrifter af FGF-receptor-signaler. Vi fandt, at inhibering af FGF-signaler inducerer epitel celleadhæsion og tab af motilitet i tyktarmen cancerceller. Disse virkninger medieres via mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK) og Rho GTPase kaskader. Efter aftale med disse resultater, hæmning af MEK1 /2 eller JNK kaskader, men ikke for de PI3K-AKT signalsystemer akse også induceret epitelcelle morfologi. Endelig fandt vi, at ekspressionen af ​​

FGF9

var stærk i en delmængde af avancerede coloncancerformer, og overekspression negativt korreleret med patienternes overlevelse. Vores funktionelle og udtryk analyser tyder på, at FGF-receptor-signaler kan bidrage til tyktarmskræft progression

Henvisning:. Leushacke M, Spörle R, Bernemann C, Brouwer-Lehmitz A, Fritzmann J, Theis M, et al. (2011) En RNA Interference Fænotypisk Screen Identificerer en rolle for FGF Signaler i Colon Cancer Progression. PLoS ONE 6 (8): e23381. doi: 10,1371 /journal.pone.0023381

Redaktør: Hana Algül, Technische Universität München, Tyskland

Modtaget: Februar 25, 2011; Accepteret: 15 Juli 2011; Udgivet: 11 August, 2011

Copyright: © 2011 Leushacke et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dele af det arbejde blev finansieret af den tyske Bundesministerium für Bildung und Forschung (give NGFN2 01GR0405 til BGH, og giver PKT-01GS08111-5 og PKM-01GS08105-8 til BGH og MM). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. Ingen yderligere ekstern finansiering blev modtaget til denne undersøgelse

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Sene trin tumorprogression kan resultere i. metastatisk spredning af tumorceller, og som har mistet epithelial karakteristika og erhvervede vandrende og invasive kapacitet. Morfologisk, denne fænotypiske switch ligner omdannelsen af ​​stationære epitelceller i migrerende mesenkymale celler under fosterudviklingen, og derfor alle disse processer er ofte betegnes epitel-til-mesenchymal overgang (EMT) [1], [2], [3], [4], [5]. Vigtige trin i udviklings- og tumor-associerede EMT er tab af E-Cadherin-baserede celleadhæsion (ved epigenetisk inaktivering eller transkriptionel repression af

CDH1

, der koder for E-Cadherin), reorganisering af cytoskelettet fører til ændret celle morfologi, og induktion af mesenchymale-specifik genekspression, såsom aktivering af

FN1

og

VIM

[6], [7], [8], [9], [10], [11]. I embryonet, EMT forekommer i en ordnet og meget reproducerbar måde. I tumorceller, men kan EMT-lignende fænomener være midlertidig, kaotisk og ufuldstændig.

i embryonet, er EMT induceret ved koordineret aktivering af signalveje, mens i tumorceller fuldstændig eller delvis EMT kan fremkaldes ved de kombinerede aktiviteter af onkogene mutationer og vækstfaktor-signaler, der modtages fra det indre af tumorcellen mikromiljø. Stadig, roller centrale signalveje og molekyler synes at være konserveret. For eksempel er β-Catenin indberettes for første embryonale EMT fører til dannelse af primitivstriberne og mesoderm [12], mens i coloncarcinom og andre tumorer β-Catenin transducerer vigtige signaler ved den invasive front fører til tab af tumorcelle adhæsion, induktion af cellemotilitet og metastase [13], [14], [15]. Flere receptortyrosinkinaser (RTK) har været impliceret i både, udviklingsmæssige og tumorassocieret EMT. I fosterudvikling, scatter faktor /hepatocytvækstfaktor receptor MET er afgørende for migration af muskel stamceller, er epidermal vækstfaktor (EGF) receptor kræves for epitelial morfogenese [16], [17], [18], og fibroblast vækstfaktor (FGF) receptor FGFR1 og dens ligand FGF8 er essentielle for cellemigrering gennem primitivstriberne og mesoderm formation [19], [20]. I tumorer, kan ufysiologisk signalering gennem RTK’er såsom MET, den vaskulære endotelvækstfaktor (VEGF) receptor og EGF og FGF-receptorer være forbundet med progression og metastase [21], [22]. Vigtigt er det, Globaliseringsfonden og VEGF-receptorer er mål for rationel terapi af fremskreden tyktarmskræft [23].

mitogen-aktiveret protein kinase (MAPK) veje, såsom Jun-N-terminal-kinase (JNK) og de mitogenaktiveret proteinkinase kinase /ekstracellulær-kinase (MEK /ERK) pathways, integrere signaler fra flere RTK’er at kontrollere celleproliferation, cellemotilitet og andre cellulære egenskaber [24]. Onkogene mutationer i gener, der koder for signal transducere som relæ signaler fra RTK til MAPK veje såsom

KRAS

eller

BRAF

kan bevidstgøre signalering via MEK /ERK vej i tumorer, og sådanne mutationer afkræfte terapeutisk interventionsstrategier på opstrøms RTK-receptorer [25]. Både under udviklingen og i tumorer, EMT signaler ofte integreret ved transkriptionelle repressorer af

CDH1

, såsom Snail, Snail2, Twist og andre, som dermed spiller en vigtig rolle i kontrollen af ​​cellens morfologi og tumor progression [ ,,,0],9], [10], [26].

Her tog vi fordel af den molekylære lighed mellem udviklingsmæssige og tumor-associerede EMT at identificere nye kandidatgener involveret i tyktarmskræft progression. I et RNA-interferens skærm identificerede vi flere gener, hvis inaktivering fremmet en epitelial fænotype og E-cadherin-medieret celleadhæsion i SW480 colon cancerceller. Mange af de identificerede gener koder for komponenter af vigtige signalveje, såsom Wnt, Hedgehog og RTK veje, for eksempel

FGF9

,

PTCH1

,

GLI2

,

GLI3

TCF7L1

. Ved hjælp af identifikation af

FGF9

som bly, fandt vi, at FGFR signaler spiller roller i tab af tyktarmskræft celleadhæsion og induktion af celle motilitet. For at mægle disse effekter, FGFR signaler modulere MEK /ERK kaskade og Rho GTPaser. Vores resultater identificere således FGFR signaler som vigtige determinanter for MEK /ERK cascade aktivitet i SW480 colon cancerceller, selv i nærværelse af et onkogent KRAS mutation. Vi fandt, at

FGF9

blev udtrykt i tyktarmskræft og ekspressionsniveauerne korrelerer med patientens overlevelse, hvilket tyder på en funktionel rolle i kræft.

Resultater

En RNAi interferens fænotypiske skærmen for gener, der regulerer colon tumor progression

invasive vækst og metastase af tumorer involverer tab af epitel celleadhæsion og forstærkning af cellemotilitet. Vi ræsonnerede, at gener, hvis produkter spiller roller i tumor progression kan beriges blandt dem, der udtrykkes i den caudale ende af midten af ​​drægtighedsperioden mus embryo, et sted, hvor epitelceller undergår udviklingsmæssige EMT, dvs. en fænotypisk skifte til en mesenchymal tilstand af lav celleadhæsion og høj cellemotilitet. Vi brugte derfor MAMEP database (https://mamep.molgen.mpg.de) og litteratursøgninger at udarbejde en liste over gener udtrykt fortrinsvis i caudale ende af midten af ​​drægtigheden (E9.5) embryo, og identificeret deres menneskelige homologer. Dernæst vi målrettet disse gener ved hjælp esiRNAs [27] i SW480 humane colon cancerceller, som viser en mesenchymal ( “spindel-form”) morfologi, er motile og har lidt celleadhæsion. Vi screenet for gener, hvis inaktivering fremmes epitel ( “brosten”) celle morfologi og lokalisering af epitel celleadhæsionsmolekyle E-cadherin til celle-celle-kontakter (Fig. 1A). Ud af 364 gener screenede silencing af 18 kandidater induceret epithelmorfologi sammenlignes med interferens med henvisning

BCL9L

, hvilket er en transkriptionel co-aktivator af β-Catenin [28]. Vi fandt også tre gener, hvis inaktivering fremmet en mere spindel-formen cellemorfologi. I modsætning hertil kontrol-transficerede celler ikke vise konsistente morfologiske ændringer (figur 1B. For interferens effekt, se Fig S1;. For en komplet liste over målrettede gener og positiver, se tabel S1 og tabel 1, henholdsvis)

.

En Skematisk oversigt over skærmen: gener blev udvalgt ved screening af MAMEP database (https://mamep.molgen.mpg.de) for gener, der viser kaudalt begrænset udtryk i mus embryo og litteratursøgning. Eksempel billeder af sådant gen ekspressionsmønstre er vist på toppen af ​​flowdiagrammet. Humane homologer blev inaktiveret ved RNA-interferens i SW480-celler. Positive gener blev identificeret ved deres evne til at fremme epitelcelle morfologi. B E-Cadherin distribution og morfologi af SW480-celler transficeret med esiRNA mod ildflue luciferase (

Fluc

, negativ kontrol),

BCL9L

(positiv kontrol) og flere positive gener. Gener markeret med (*) inducerede en mere spindel-formen morfologi. Scale søjler repræsenterer 50 um. For en komplet liste over gener målrettet på skærmen, se tabel S1. For en komplet liste over gener, der scorede positiv, se tabel 1.

Mange af de identificerede gener spiller kendte roller i kontrollen af ​​signalveje, der regulerer fosterudvikling, orgel homeostase, og tumor progression. Vi fandt

TCF7L1

, der koder for en nedstrøms transkriptionsfaktor af Wnt /β-Catenin signaleringskaskade [29], samt Wnt /β-Catenin signaling komponenter

SFRP1

CSNK2A1

. Vi isoleret også

PTCH1

,

GLI2

, og

GLI3

, som koder for dele af Hedgehog signalvejen [30]. Vi fandt

FGF9

EPHA4

, der koder for en RTK ligand og et RTK af ephrin underfamilien regulerer celle vedhæftning og cytoskelettet via MAPK og Rho [31], [32]. Kandidaten gen

TAX1BP3

kan også have roller i reguleringen af ​​Rho-signaler [33]. Blandt flere gener impliceret i reguleringen af ​​transskription, fandt vi

SIX1

, der koder for en homeobox transkriptionsfaktor impliceret i celledifferentiering og tumor progression [34], [35] (fig. 2).

Gene symboler positiver er givet i sorte bogstaver, tilhørende nøgle pathway komponenter er givet i grå bogstaver, der vises i farvede cirkler og bestilt af cellulære rum. Blå: Wnt vej, Grøn: Hedgehog pathway, Cyan: RTK veje. Gener blev tildelt til veje ved hjælp af litteratur, Gene ontologi og andre database-søgninger. Vigtige henvises der i hovedteksten.

FGF signaler regulerer vedhæftning og motilitet af kolon kræftceller

Da vi identificeret

FGF9

i vores cellulære skærm og fundet udtryk for FGF9 i tarm maligniteter af både mus og mennesker (se nedenfor), vi fokuseret på roller FGF signaler i coloncarcinomceller. Først, vi bekræftet screeningsresultat ved hjælp af en uafhængig

FGF9

siRNA forberedelse, som ligeledes inducerede en epitelial fænotype i SW480, jeg. e. førte til et tab af spindel-form celler og til en stigning i membranagtige E-cadherin-farvning (Fig. S2). I en anden coloncancercellelinie, HCT116, nedregulering af

FGF9

havde tilsyneladende ingen effekt. når vi målrettet

FGFR3

, der koder for et højaffinitetsreceptor af FGF9 og andre FGF’er, fandt vi, at den fremmet epitelcelle morfologi i HCT116 (fig. S2). Disse fund indikerer, at FGF-receptor signaler almindeligvis kan have roller i reguleringen af ​​tyktarmskræft cellemorfologi, og at forskellige pathway komponenter kan være begrænsende i de forskellige cellelinjer.

Dernæst vi målrettet de FGF-receptorer ved hjælp af små molekyle inhibitor SU5402 [36], og vurderede ændringer i den cellulære fænotype. Efter aftale med vores RNA interferens data, hæmning af FGF-receptorer fremmet epitelial morfologi SW480 celler og befalede E-Cadherin og β-Catenin til celle-celle kontakter, der angiver

de-novo

samling af epitelial adherensovergange (Fig . 3A). Lignende effekter blev observeret på morfologien af ​​SW620-celler, som er afledt fra den samme patient, og på HT29 og HCT116-celler, som er afledt af andre patienter (Fig. S3).

et fænotypisk omskifter af SW480-celler ved FGF-receptor inhibering med SU5402. Top til bund: Cell morfologi i lyse felt, immunfarvning af E-Cadherin og β-Catenin. Billeder blev taget 72 timer efter start SU5402 behandling. Herunder: SW480 celler modtager FGF signaler, som kan blokeres af SU5402. B Scratch-viklet motilitet assay ved FGF-receptor-inhibering. SW480-celler blev dyrket til konfluens, og ridser blev induceret 24 timer efter behandlingens start. Bright felt billeder af scratch kant blev taget 24, 48 og 72 time efter ridse. Scale barer i A og B udgør 50 um. C, D immunfarvning af bunden kant. C Farvning af actin og mikrotubuluscytoskelettet i kontrol og SU5402-behandlede celler. Grøn: actin (phalloidin); gul: tubulin; blå: kerner (DAPI); Pile: områder med tæt omdrejningspunkt vedhæftning i bevægelige kontrol celler; pilespidser: forstærket cortical actin-farvning i SU5402-behandlede celler. D RhoA omfordeling i migrerende celler, der reduceres i inhibitor-behandlede celler. Grøn: actin; rød: RhoA; blå: kerner. grå pilespidser markerer nukleare RhoA. Den punkterede linje markerer scratch kant. Scale barer i C og D repræsenterer 25 um. E Kvantificering af spredning i kontrol og SU5402-behandlede celler. For tidsforløbet for spredning, blev cellerne forgyldt i replikater, og dobbelte prøver blev talt bi-dagligt i et Neubauer hematocytometer.

Cell vedhæftning og celle motilitet er ofte omvendt korreleret i tumorceller. Vi har derfor også vurderet cellemotilitet. Kontrol SW480 celler hurtigt migreret, mens SU5402-behandlede celler ikke længere kunne tæt en ridse såret (fig. 3B). FGF-receptor-hæmmede celler på bunden kant de viste øget farvning af cortical actin og reduceret antal af fokale vedhæftning kontakter, hvilket indikerer ændrede dynamik cytoskelettet (fig. 3C). Endvidere Rho GTPaser, som er vigtige effektorer af balancen mellem celleadhæsion og motilitet [37], optrådte lokaliseret til nukleare pletter i SW480-celler invaderer bunden, og blev reduceret i inhibitor-behandlede SW480-celler (fig. 3D). Celleproliferation blev kun let berørt af FGF-receptor-inhibering (fig. 3E). Vi så lignende virkninger på celle morfologi og motilitet ved hjælp af et strukturelt ubeslægtet lille molekyle hæmmer af FGF-receptorer, PD173074 (data ikke vist). Disse resultater indikerer, at FGF-receptor signaler kan spille væsentlige roller i overgangen fra en stationær til en vandrende fænotype, som er kendetegnende for de sene trin i intestinal tumor progression resulterer i metastase.

FGF signaler i colon cancerceller transmitteres via MAPK-vejen og Rho

FGF receptor signaler er kendt for at blive transmitteret via MAPK kaskader og via phosphoinositid-3-kinase (PI3K) /AKT signaleringskaskade [38]. Vi analyserede derfor aktiviteten af ​​centrale cellulære signaltransducere efter inhibering af FGF-receptorer eller centrale nedstrøms signaltransducere, dvs. U0126, inhibering af MEK1 /2 kinaser af den klassiske MEK /ERK MAPK cascade, SP600125, en inhibitor af den alternative JNK kaskade og LY294002 , en inhibitor af PI3K signaltransduktion. Som forventet, hæmning af MEK1 /2 afskaffet phosphorylering af ERK1 /2, og inhibering af PI3K afskaffet phosphorylering af AKT. Ved FGF-receptor inhibition, fandt vi en begrænset, men reproducerbar reduktion af ERK1 /2 phosphorylering (ca. 30%). I modsætning hertil blev aktiviteten af ​​p85-PI3K ikke påvirket. Ændringer i phosphoryleringen af ​​AKT indikerede, at yderligere signal transduktion net moduleres direkte eller indirekte, når inhibering FGF-receptorer eller JNK (fig. 4A, B).

A Analyse phospho-ERK1 /2, Phospho-P85PI3K og phospho-AKT i SW480-celler efter behandling med DMSO (opløsningsmiddelkontrol), SU5402 (inhibering FGFR), U0126 (inhibering MEK1 /2-afhængig ERK1 /2 phosphorylering), SP600125 (inhibering JNK), og LY294002 (inhibering PI3K-medieret AKT phosphorylering) er vist. Histone H3 er vist som ladningskontrol. Phosphorylering blev vurderet 40 minutter efter inhibitor-behandling. B Kvantificering af ERK1 /2 phosphorylering, middelværdi af tre eksperimenter. C Morfologi, E-cadherin immunofluorescens og cellemotilitet af SW480-celler efter 72 timer af inhibitor behandling. Hæmning af den klassiske MAPK eller alternative MAPK /JNK kaskader inducerede en lignende fænotype som FGFR hæmning i SW480 celler, hvorimod hæmning af PI3K eller AKT havde nogen sådan virkning. Vi fandt, at PI3K-inhibering, men ikke AKT inhibition, inhiberer cellemotilitet. Afkobling af PI3K og AKT-signaler er blevet observeret før i tumorer [56]. Scratch-assay blev udført som i fig. 3B. Scale søjler repræsenterer 50 um. D Hæmning af FGF-receptorer eller MEK1 /2 fører til reduceret Rho aktivitet. Rho GTPase loading assays blev udført i SW480-celler 5 minutter efter serumstimulering i nærvær eller fravær af SU5402 eller UO126. N.d .: ikke bestemt.

Vi næste testede fænotypiske effekter af hæmning af de efterfølgende kaskader. Behandling af SW480-celler med U0126 (inhibering MEK1 /2) eller med SP600125 (inhibering JNK) støttede dannelsen af ​​epitelcelle adhæsionskomplekser, og blokeret cellemotilitet, ligner observerede virkninger efter inhibering af FGF-receptor-signaler (fig. 4C, fig. S4). I modsætning hertil fænotyper observeret efter behandling med LY294002 (hæmme PI3K) eller Calbiochem AKT-inhibitor var ikke sammenlignes med effekter ses efter FGF receptor hæmning (fig. 4C). En tilsvarende sammenhæng af cellulære fænotyper ved inhibering af signalering hubs blev observeret i HCT116-celler, som imidlertid ikke vise modulation af E-cadherin lokalisering under nogen betingelser (fig. S5, se også fig. S2). Sammenfattende indikerer disse resultater, at FGFR signaler modulerer aktiviteten af ​​MEK /ERK signaleringskaskade i SW480-celler, og at aktiviteten af ​​FGFR, MEK1 /2 og JNK er nødvendige for opretholdelsen af ​​en fænotype, der favoriserer cellemotilitet løbet celleadhæsion.

Da vi observerede re-lokalisering af Rho i bevægelige SW480 celler (se ovenfor, fig. 3D), bestemte vi effekten af ​​FGFR eller MEK1 /2 signaler på Rho-aktivitet, ved hjælp af Rho lastning analyser. Til dette, vi serumudsultet SW480-celler i 24 timer, og vurderet Rho aktivering efter serum restimulering. Tilsætning af serum medførte hurtig induktion af aktiv Rho-GTP i kontrolceller, mens Rho aktivering blev kompromitteret i nærvær af FGF-receptor eller MEK1 /2-inhibitorer (fig. 4D). Dette resultat tyder på, at i SW480 celler FGF-receptorer og MEK1 /2 play roller i reguleringen af ​​Rho GTPaser, der er centrale i modulering af cytoskelettet.

FGFR og MAPK signaler er forbundet med specifikke genekspression signaturer

for at isolere genekspression signaturer relateret til FGFR signaler og celle motilitet i tyktarmen kræftceller, vi sammenlignet genekspression profiler af kontrol opløsningsmiddel og inhibitor-behandlede SW480 celler. Vi brugte første funktionelle gruppering af gener liberaliseret mellem kontrol (DMSO-behandlet) og SU5402-behandlede celler ved hjælp Opfindsomhed pathway analyse (Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com). Blandt de signaleringsdata net stærkest ramt identificerede vi en klynge af deregulerede gener relateret til cellemotilitet, der er centreret på ERK1 /2-afhængige MAPK-vejen, der bekræfter vores tidligere resultater (fig. S6). Den udledte netværk indeholder centrale signal transducere af motilitets signaler såsom

ERK1

/2 og

pTk2-

(fokal vedhæftning kinase), og konvergerer på transkriptionsfaktorer

Juni

/

JunB

FOSL1

. Vigtigere,

FOSL1

er tidligere blevet identificeret som en central transskription faktor i kontrollen af ​​tumorcellemotilitet [39].

Næste sammenlignede vi DMSO-behandlede og PI3K-inhibitor-behandlede SW480 celler (visning mesenkymale “spindel-form” morfologi og svag celleadhæsion) med FGFR-inhibitor-, MEK1 /2-hæmmer og JNK-inhibitor behandlede celler (viser epitelial “brosten” morfologi og stærk celleadhæsion, se også fig. 4C). Vi brugte selvorganiserende kort til at identificere grupper af gener, hvis udtryk er forbundet med disse forskellige morfologier, og identificeret 29 gener, der var forbundet med stærke celleadhæsion og 23 gener associeret med svag celleadhæsion. Underskrift gener af SW480 celler, der har en stærk celleadhæsion var

RAP1GAP

, som er involveret i samlingen af ​​adherensovergange og

CLDN1

, en komponent af adherensovergange, der beviser, at epitelial celleadhæsion er reguleret i det mindste delvis på det transkriptionelle niveau. Vi fandt også forbedret udtryk for transskription faktor gener

ELF3

HMGCS2

, der spiller funktionelle roller i epitheldifferentiering [40], [41], de tumorsuppressorer

SYK

og

TFAP2C

og Rho regulator

ARHGEF37

. Underskrift gener af SW480 celler, der har svage celleadhæsion og mesenkymale morfologi blev beriget for gener, der er blevet tildelt onkogen aktivitet, nemlig

EDN1

,

IGFBP7

,

MCM5

,

MFI2

og

TNFAIP8

. Endelig har vi også fundet

TAX1BP3

, som vi ovenfor isoleret i vores fænotypiske esiRNA skærm, hvilket tyder på en funktionel rolle for dette gen i reguleringen af ​​vedhæftning og motilitet (fig. 5A) [33]. Vi observerede et lignende mønster af genregulering ved FGF-receptor inhibering i HCT116 colon cancerceller (som vist tab af spindel form efter

FGFR3

RNA-interferens eller FGF-receptor-inhibering, se Fig. S2, S3), implicerer en konserveret rolle af dette gen klynge nedstrøms for FGF-receptorer (fig. S7).

A-B Microarray analyse af SW480 efter små molekylære inhibering af FGFR, MEK1 /2, JNK eller PI3K. Gennemsnitlig ekspression af tredobbelte eksperimenter vises. Rød: Høj udtryk; Blå: lav udtryk Hvid: Median udtryk på tværs af alle profiler Grey: Gener med ingen eller marginal udtryk En Klynger af gener, hvis aktivitet korrelerer med epitel og mesenkymale fænotyper. Følgende fremgangsmåde blev anvendt til at identificere disse gener: Først gener dereguleret mere end 1.3fold (p 0,01) efter SU5402 behandling sammenlignet med kontrol (DMSO) blev isoleret. For det andet blev disse gener grupperet i selvorganiserende kort, og tre klynger, korrelerede med fænotypen blev udvalgt. Gener blev bestilt af fold-change udtryk efter FGFR hæmning. B Vurdering af vigtige gener impliceret i EMT eller stemness. C kvantitativ real-time PCR-analyse af

SNAI2

og

CDH1

efter SU5402 (FGFR Inhibitor) behandling. Expression blev normaliseret til opløsningsmiddel kontrolprøver.

Når vi vurderede udtryk for vigtige modulatorer af EMT, vi så en lille, om end ikke signifikant, variation i udtryk for

CDH1

, hvilket indikerer, at mere drastiske ændringer, som vi ser i E-Cadherin lokalisering (se fig. 1B, 3A) forekommer overvejende via posttranskriptionel regulering. Angivelse af

VIM

TWIST

blev kun svagt påvirket, mens andre EMT markører viste sig at være ikke-udtrykt. Disse data antyder, at SW480 celler ikke underkastes en komplet mesenchymale-til-epitel overgang efter FGF-receptor eller MAPK-inhibering. Vi også ikke se regulering af intestinale stamcelle markører, der for nylig er blevet knyttet til EMT i tumorer (fig. 5B) [42], [43], [44]. Regulering af transkriptionsrepressor

SNAI2

sit mål gen

CDH1

via ERK1 /2-signaler er blevet påvist før i SW480 celler [45]. Vi vurderede derfor udtryk for

SNAI2

og

CDH1

ved QRT-PCR, som kan være mere følsomme end array analyse. Vi vil bekræfte milde aktivering af

CDH1

efter SU5402 behandling, mens

SNAI2

var uændret (fig. 5C).

FGF9 udtryk er korreleret med patientens overlevelse i den menneskelige kolon kræft

for at vurdere

in vivo

betydning af vores analyser, vi bestemt udtryk for

FGF9

i eksemplar af mus og humane intestinale tumorer. I mus tarm adenom, fandt vi øget udtryk for

FGF9

i en lignende mønster som Wnt målgenet

Axin2

. Når vi bestemt udtryk for

FGF9

i human tyktarmskræft, vi ligeledes fundet generaliseret udtryk i tumoren epitel i primære tumorer og lungemetastaser (fig. 6). Da vores skærm, sammen med vores efterfølgende funktionel analyse af de samlede FGF signaler, indikerede en mulig rolle for FGF9 signaler i tarmkræft, vi undersøgte de relative ekspressionsniveauer af

FGF9

i et sæt af 95 udtryk profiler af menneskelig tyktarmskræft, bestående normale kolon (4 profiler), avanceret colon carcinom (iscenesat T3 /4 af International Union Against cancer (UICC) kriterier; 41 profiler), og metastaser til lymfeknuder, lever og lunge (50 profiler) [46]. Vi fandt basal ekspressionsniveauer af

FGF9

i de normale colon væv profiler og i de fleste tumor-profiler, men høj ekspression af

FGF9

i en undergruppe af 7 colontumorer og 5 metastaser (fig . 7A; afskæring 2 gange sammenlignet med normalt væv). Af note, vi fandt også øget ekspression af

FGFR3

, der koder for en høj-affinitet FGF9-receptor, i 3 primære tumor profiler og flere metastaser (fig. 7A). Den høje ekspression af

FGF9

holdtes mellem par af primære tumorer og metastaser afledt fra tre patienter, hvilket indikerer, at

FGF9

aktivering i tumoren kan vare over lange perioder.

Ekspression af Wnt målgenet

Axin2 /AXIN2

(til venstre) og

FGF9

/

FGF9

(til højre) i mus og humane intestinale maligniteter var bestemt af RNA

in situ

hybridisering. Øvre paneler: adenom i tyktarmen fra en APC

min mus. Middle paneler: primære humane colon carcinom. Nedre panel: lunge metastase af human coloncarcinom. Negativ kontrol-hybridisering (ved anvendelse af en ubeslægtet asRNA sonde af lignende størrelse og CG-indhold, der ikke er vist) ikke frembringe et signal. Scale søjler repræsenterer 500 um.

En Angivelse af

FGF9

eller

FGFR3

i invasiv og metastatisk kolorektal cancer, som vurderet ved microarray analyse (n = 95) . Expression i hver prøve er angivet med cirkel, er median udtryk i hver gruppe givet af røde bjælke. Tal i

FGF9

graf indikerer primære tumor /metastase par afledt fra den samme patient. B Kaplan-Meier overlevelsesanalyse af patienter undersøgt i et (primære tumorer med kun opfølgende data, n = 39). Patienterne blev grupperet efter høj ( 2-fold af median, angivet med grøn cirkel i figur 7A.) ​​Og lav

FGF9

FGFR3

udtryk

Vi endelig korreleret udtryk for

FGF9

i primære tumorer (n = 39) med patientens overlevelse, ved hjælp af Kaplan-Meier analyse. Den undergruppe af 7 patienter med høj ekspression af

FGF9

havde signifikant kortere overlevelse end patienter med lav

FGF9

udtryk (fig. 7B,

s

= 0,008). Vi så et lignende resultat, når vi inkluderede patienter med høj ekspression af

FGFR3

i gruppen (fig. 7B,

s

= 0,006). Den observerede korrelation mellem høj ekspression af

FGF9

og korte patient overlevelse kan indikere funktionelle roller FGF9 i tumor progression.

Diskussion

Her har vi foretog en fokuseret skærmen for at identificere gener, hvis udtryk er nødvendig for at opretholde en mesenchymal, potentielt metastatisk fænotype i SW480 kolon kræftceller, og isolerede flere kandidater. Mange af disse gener kan knyttes til større signaleringsveje eller har været impliceret i EMT og tumorprogression før. Vi fandt HMG-box transskription faktor gen

TCF7L1

(også kendt som

TCF3

), som kan overføre Wnt /β-catenin signaler [29]. Interessant er det tilknyttede transkriptionsfaktor TCF7L2 (også kendt som TCF4), der kræves til at transmittere Wnt /β-Catenin signal og opretholde knoglemarven i tarmen [47], [48]. Det familiemedlem

TCF7L1

er dog også til udtryk i tyktarmen krypt og tyktarmskræft (fig. S8). Vores resultater indikerer derfor, at

TCF7L1

kan have en endnu uidentificeret rolle i overførsel af tumor-relaterede β-catenin signaler.

Vi identificerede også

ptch

,

GLI2

og

GLI3

, som koder for dele af Hedgehog signalvejen. Mulige roller Hedgehog signaler i tyktarmskræft progression og metastase er kontroversielle [49], [50]. Resultater af vores skærm støtte en rolle Hedgehog signaler i modulering af celleadhæsion i colon cancerceller.

Uventet skærmen gav også tre gener, hvis inaktivering fremmet en mere spindel-formular fænotype. To af disse,

BICC1

MAGI1

har vist før at være nødvendig til samling af E-Cadherin-medierede celle vedhæftning komplekser [51], [52]. Konstateringen af ​​funktionelle roller af disse gener i opretholdelsen af ​​resterende celle-celle kontakter i tumorceller kan indikere en mere universel rolle for disse gener i reguleringen af ​​celleadhæsion end forventet før.

FGF signaler har været impliceret i kontrollen af ​​intestinal cellemotilitet og tyktarmskræft progression før. For eksempel har FGF1 og FGF2 vist sig at fremme migrering af intestinale epitelceller [53], og specifikke isoformer af FGFR3 kan mediere vækst og migrering af colon cancerceller [54]. I vores skærm, vi identificeret

FGF9

som et gen involveret i reguleringen af ​​tyktarmskræft celleadhæsion. Bruge små molekylære inhibitorer og aktivitetsassays af centrale signaltransducere, fandt vi, at MAPK kaskade og Rho GTPaser er kritiske i transmissionen af ​​FGF-signaler, der styrer celleadhæsion og motilitet i tyktarmen cancerceller, mens PI3K kaskade er ikke. SW480 colon cancerceller indeholder en velkarakteriseret sæt af mutationer, herunder en aktiverende

KRAS

(G12V) mutation [55]. Vore data indebærer derfor, at onkogene mutationer i KRAS ikke helt Frakobl MAPK aktivitet fra opstrøms stimuli, men kan i stedet potensere RTK signaltransduktion. I patienten, terapi succes ved hjælp VEGF og EGF-receptor-hæmmere høj grad afhænger fraværet af downstream KRAS eller BRAF-mutationer [25].

De seneste modeller af tumor progression indebærer en ukontrolleret aktivering af udviklingsmæssige signalveje og embryonale genekspression programmer, hvilket resulterer i en koordineret tab af celleadhæsion gevinst på cellemotilitet og erhvervelse af stamcelle træk i metastatiske tumorceller [42], [43], [44]. Vores skærmen identificerer flere kandidatgener, der kunne spille roller i disse processer.