PLoS ONE: Omfattende Evaluering af den antiangiogene og antineoplastisk Effekter af Endostar på leverkræft gennem Optical Molecular Imaging

Abstrakt

Molekylær billeddannelse muliggør ikke-invasiv overvågning af tumorvækst, progression, og narkotikabehandling respons, og det er blevet et vigtigt redskab til at fremme biologiske undersøgelser i de senere år. I denne undersøgelse, vi grundigt vurderet

in vivo

antiangiogene og antineoplastiske virkninger af Endostar på leverkræft baseret på optiske molekylære billeddiagnostiske systemer, herunder mikro-computer tomografi (Micro-CT), bioluminescens molekylær billeddannelse (BLI) og fluorescens molekylær tomografi (FMT). Ildflue-luciferase (Fluc) og grønt fluorescerende protein (GFP) dobbelt mærkede humane hepatocellulære carcinomceller (HCC-LM3-Fluc-GFP-celler) blev anvendt til at fastslå subkutan og ortotopisk levertumor model. Efter tumorcellerne blev implanteret 14~18 dage blev Endostar (5 mg /kg /dag) indgivet gennem en intravenøs injektion i halevenen for kontinuerlige 14 dage. Computeren tomografi angiografi (CTA) og BLI blev udført for den subkutane tumor model. FMT blev henrettet for ortotopisk tumor model. CTA data viste, at dannelse tumor fartøjet og peritumoral vaskulatur af subkutan tumor i Endostar behandlingsgruppen var signifikant inhiberet sammenlignet med kontrolgruppen. De BLI data udstillet den indlysende tumor hæmning dag 8 efter behandling. FMT påvises tumorsuppression virkninger af Endostar så tidligt som dag 4 efter behandling og måles tumoren placering. Ovenstående data bekræftede virkningerne af Endostar på anti-angiogenese og tumor undertrykkelse på leverkræft. Vores system kombineret CTA, BLI, og FMT at tilbyde mere omfattende information om virkningerne af Endostar på undertrykkelsen af ​​skibet og tumordannelse. Optisk molekylær imaging system gjorde det muligt for ikke-invasiv og pålidelig vurdering af anti-tumor narkotika effekt på leverkræft

Henvisning:. Zhang Q, Du Y, Xue Z, Chi C, Jia X, Tian J (2014) Omfattende Evaluering af den antiangiogene og antineoplastisk effekter af Endostar på leverkræft gennem Optical Molecular Imaging. PLoS ONE 9 (1): e85559. doi: 10,1371 /journal.pone.0085559

Redaktør: Matthew Bogyo, Stanford University, USA

Modtaget: 16 oktober, 2013; Accepteret: December 3, 2013; Udgivet: 8. januar 2014

Copyright: © 2014 Zhang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette papir er støttet af National Basic Research Program Kina (973 Program) under Grant nr 2011CB707700, National Natural Science Foundation of China (NSFC) under Grant nr 81.227.901 og Academy of Sciences Fellowship for unge Internationale Forskere (2013Y1GB0005). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

hepatocellulært carcinom (HCC) er en af ​​de mest almindelige kræftform i verden, og er ansvarlig for mere end 600.000 dødsfald årligt [1]. Uheldigvis er sygdommen ofte opdages på et sent tidspunkt, når potentielt helbredende behandlinger er ofte ineffektive [2]. De fleste kræftpatienter viser recidiv, der hurtigt udvikler sig til de fremskredne stadier med vaskulær invasion og deres 5-års relativ overlevelse er kun 7% [3]. Derfor er ekstremt behov for nye behandlingsformer og nye metoder til påvisning af denne aggressive sygdom.

Angiogenese er nødvendig for invasiv tumorvækst og metastase, så det spiller en vigtig rolle i kontrollen af ​​cancer progression [4], [5] . Den hurtige vækst af tumoren har behov for en stor mængde næringsstoffer og ilt, der fik væksten af ​​blodkar. Desuden HCC tumorer afhænger af en rig blodforsyning [6], [7], derfor, inhibering af angiogenese har udgjort et afgørende punkt i leverkræft terapi.

Prækliniske undersøgelser har vist, at endostatin kunne skrumpe eksisterende tumor blod fartøjer effektivt [4], [8] – [10]. Endostar er et hidtil ukendt rekombinant humant endostain udtrykt og oprenset i

Escherichia coli

med en modificeret N-terminal [11], [12], er det blevet vist at inhibere endotelcelle formering, migrering og dannelse fartøj [13 ]. Baseret på systemiske prækliniske studier og kliniske forsøg, staten Food and Drug Administration Kina (SFDA) godkendte regime til behandling af ikke-småcellet lungekræft i 2005 [14]. I denne undersøgelse, vi udforskede antitumor virkninger af Endostar på leverkræft

in vivo

.

Den traditionelle tilgang til antineoplastisk forskning såsom histopatologisk analyse er korrekte, men tidskrævende og kan ikke give 3-dimensional (3D) strukturel information. Desuden har nogle antiangiogene midler sædvanligvis inhibere tumorudvikling snarere end tumorvolumen krympning. Derfor er vurderingen af ​​terapeutisk respons kun gennem volumen måling tumor er ikke længere omfattende [15], og det er et presserende behov for at udvikle en mere følsom og effektiv påvisningsmetode.

Molekylær billeddannelse, som giver mulighed for følsomme, langsgående observation, er blevet et uvurderligt værktøj til tidlig påvisning af læsioner, overvågning terapeutisk effekt, og lette lægemiddeludvikling. Noninvasive billeddannelse af tumorangiogenese muliggør meget tidligere diagnose og bedre prognose, som i sidste ende vil føre til effektiv behandling [16]. I de senere år har optisk molekylær billeddannelse dukket op som et vigtigt redskab af teknologier til at fremme vores forståelse af sygdomsmekanismer og fremskynde lægemiddelforskning [17], [18]. Vi kombinerede CTA, BLI og FMT at overvinde de billeddiagnostiske dybder og opløsning grænser, som tillod forskerne at lokalisere tumoren progression og sted [19], [20].

Da det er den passende måde at repræsentere sygdommen proces i human, ortotopisk dyremodeller af human cancer er den optimale værktøj til prækliniske evaluering af nye behandlingsformer [21]. Selvom ortotopisk leverkræft model er blevet omfattende undersøgt [22], [23], dens anvendelse i optisk molekylær billeddannelse til langsgående overvågning og lægemiddelrespons på leverkræft har sjældent været forsøgt. Gennem vores Micro-CT /BLI /FMT-system, blev CTA udført for at analysere vaskulære 3D morfologiske ændringer og give den kvantitative vurdering. På grund af den minimale baggrund af BLI, blev det brugt til billeddannelse af subkutan tumor model. Idet fordelene ved gennemlysning mode og avancerede computeralgoritmer, FMT er at rekonstruere 3D kort af fluoroforer inden i levende dyr [24]. Vi valgte FMT at give tumor placering og information volumen for ortotopisk tumor model. Når dataopsamling var fuldført, blev resultaterne rekonstrueret gennem vores uafhængigt udviklet imaging software. Det optiske molekylær billeddannelse systemet tilladte letkøbt og tidlig påvisning af tumor progression og terapeutiske reaktioner, og vi præsenteret en omfattende evaluering af anti-tumor effekt af Endostar.

Materialer og Metoder

Materialer og Reagent

Endostar blev opnået fra selskab af Simcere (Nanjing, Kina). D-Luciferin blev købt fra Biotium (CA, Fremont, USA). Fenestra VC blev købt fra ART (Advanced Research Technologies Inc., Canada). Den dobbelte-mærket humant hepatocellulært carcinom cellelinie HCC-LM3-Fluc-GFP blev venligst stillet til rådighed af professor Jian Zhao af Shanghai Second Military Medical University [25]. Ingen signifikant forskel blev observeret mellem HCC-LM3 og HCC-LM3-Fluc-GFP celler i form af spredning, tumorigenicitet og migration.

Cell Culture

HCC-LM3-Fluc-GFP celler dyrket i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM; Thermo Scientific) og suppleret med 10% føtalt kalveserum (FCS) (HyClone; Thermo Scientific). De blev holdt ved 37 ° C inkubator med 5% CO

2.

Animal Model

4-5 uger gamle athymiske BALB /c nøgne mus (N = 36) blev erhvervet fra Institut for forsøgsdyr, Peking University Health Science center. Alle eksperimenter dyr blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne i Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) ved Peking University (tilladelsens nummer: 2011-0039). Procedurerne forskning blev godkendt af IACUC af Peking University. Alle operation blev udført under natrium pentobarbital anæstesi, og blev gjort alle bestræbelser på at minimere lidelse.

Den subkutane tumor model blev oprettet ved injektion 1 × 10

7 celler /ml HCC-LM3-Fluc-GFP-celle suspension 100 ul i den rigtige øvre flanker af BALB /c nøgne mus (N = 24).

de ortotopisk tumor model mus (N = 12) blev oprettet efter musene var blevet bedøvet med natrium pentobarbital. En laparotomi blev omhyggeligt udført, og leveren blev helt åbent. 1 × 10

HCC-LM3-Fluc-GFP cellesuspension 6 celler /ml 50 ul blev injiceret i venstre leverlap. Efter injektion blødning og tumorcelle escape blev undgået ved kortvarig lokal sammentrykning. Den bugvæggen og hud blev lukket med en kontinuerlig sutur.

Endostar Behandling

De subkutane tumor-bærende mus blev tilfældigt opdelt i forsøgsgruppen og kontrolgruppen (N = 12 pr gruppe), indtil tumorvolumen (volumen = 0,5 × a × b

2, hvor a og b var de respektive længere og kortere diametre af tumoren) steg 100 mm

3 i omkring 18 dage. De ortotopisk tumorbærende mus blev tilfældigt opdelt i forsøgsgruppen og kontrolgruppen (n = 6 pr gruppe) 14 dage efter plantage. Den eksperimentelle gruppe og kontrolgruppe for subkutane og ortotopisk tumor-bærende mus fik intravenøse hale injektioner med Endostar (5 mg /kg /dag) eller en tilsvarende mængde 0,9% saltvand i 14 dage. For at undgå den tumormetastase, blev ortotopisk tumor gruppe givet Endostar behandling tidligere end den subkutane tumor gruppen.

musenes kropsvægt og tumorvolumen

musenes kropsvægt blev målt ved elektroniske balance hver anden dag. Tumorvolumenet blev målt ved skydelære hver fjerde dag.

Histologisk Studies

Mus blev aflivet ved afslutningen af ​​forsøget på dag 14 efter behandling. Leveren og tumorvæv blev udskåret, fikseret i formalin, indlejret i paraffin og kontinuerlige sektioner (4

μ

m) opnåedes for hematoxylin og eosin (H den blå stiplede linje repræsenterer Micro-CT-systemet. B. Tallet af multi-modalitet system, som er beliggende i den sorte ledning boliger. C. plane fluorescerende billeddannelse af mus ortotopisk tumor model ved 0 ° grader, 90 ° grader, 180 ° graders og 270 ° graders.

CTA af Mouse Subkutan Tumor Model

CTA blev udført på en 14

th dag når den daglige behandling var afsluttet. Musene blev bedøvet med 2% isoflorane, og 200 pi vaskulær kontrastmiddel Fenestra VC blev injiceret i halevenen. Ti minutter efter injektion, blev 500 projektion synspunkter indsamlet af Micro-CT-systemet. Opkøb og behandling CT data blev udført ved hjælp af Windows Molecular Imaging System (WINMI) [27], som blev udviklet på grundlag af medicinsk billedbehandling Tool Kit (MITK) (Medical Image Processing og Analyse for Videnskab, Beijing, Kina, www.mitk .Netto). De CT-data gav segmentering af tumor fartøjer og rekonstrueret 3D-strukturen. Parametre blev fastsat som følger: spændingen på røntgenrøret var 80 kVp og detektoren integration tid var 0,467 sek, som erobrede et billede for hver 0,75 °

In vivo

BLI af. mus Subkutan Tumor Model

BLI blev udført for at de subkutane musemodeller på 0

th, 4

th, 8

th, og 12

th dagen efter daglig behandling begyndte. Musene blev fastet natten over inden forsøget for at forhindre mad fra forstyrre bioluminescens resultater. Musen blev først bedøvet med 2% isofluran og modtog D-luciferin-opløsning (150 mg /kg legemsvægt) 3 min før BLI blev startet. Musene blev holdt i højre sideleje. Parametrene for CCD var

f

num = 2,8, binning = 4, eksponeringstid = 180 sek.

In vivo

FMT af Mouse ortotopisk Tumor Model

FMT blev implementeret til de ortotopisk tumor musemodeller også på 0

th, 4

th, 8

th, og 12

th dag efter den daglige behandling begyndte. Musen blev anbragt på musen rack, som var placeret på rotation etape af multimodalitet system. 2% isoflorane blev givet til musen gennem en respiratorisk maske, der var knyttet til musen rack. Overfladen måling af de fluorescerende signaler blev opnået først. belysning excitation blev udført med et 488 nm kontinuerlig bølge halvlederlaser med udgangseffekten fra 20 mW. Parametrene erhvervelse af CCD blev indstillet som

f

num = 3,5, binning = 1, eksponeringstid = 10 sek. Det var nyttigt for nøjagtig rekonstruktion af fire billeder (0 ° grader ved 90 ° grader, 180 ° graden og 270 ° grader), som blev opnået uden at blive blokeret eller flyttes (Fig. 1C). Derefter blev 3D anatomiske data erhvervet ved hjælp af Micro-CT-systemet. Parametrene blev fastsat som følger: spænding af X-ray rør var 60 kVp, detektoren integration tid var 0,467 sek og et billede blev taget til fange hver 0,75 °

genopbygning metode baseret på homotopi blev brugt til at opnå. resultaterne for fluorescens tomografi [28]. På grund af den adaptive regulering strategi, genopbygningen metode var altid i stand til at rekonstruere kilder præcist uafhængigt af estimeringen af ​​legalisering parameter. Som vores bedste viden, blev denne metode sjældent anvendt på ortotopisk levertumor model. Den vigtigste proces af denne rekonstruktion algoritme var som følger:

For det første blev vektoren af ​​de resterende korrelationer beregnes:

For det andet blev den bærende sæt opdateret:

For det tredje, retningen for den næste iteration blev opnået ved:

fjerde skridt for den næste iteration blev beregnet. Den mindste blev taget kun over positive argumenter både for de to trin.

Algoritmen genopbygning bestemmer enten tilføje elementet til I eller fjerne elementet fra jeg afhængig af hvilken er mindre.

Endelig de ubekendte og legalisering parameter blev opdateret.

Statistisk analyse

data blev udtrykt som gennemsnit ± standardafvigelse (SD). Midler blev sammenlignet ved anvendelse envejs variansanalyse (ANOVA) ved hjælp af Prism 4.0 software, og

s

værdi 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

angiogenese. Hæmning blev opdaget og overvåges af CTA under Endostar Behandling

med hjælp af blodet pool kontrastmiddel, blev vaskularisering afsløret i udsøgte detaljer gennem CTA. En 3D repræsentation af karstrukturer afspejlede niveauet af angiogenese og forudsat en kvantitativ vurdering af tumorvækst over tid. Vi fangede detalje af vaskulaturen forskel, når det modne tumor fartøjet ikke var rig. Som vist i fig. 2A og B, for at vise de forskellige fartøjer omkring tumoren blodkarret nær tumoren blev markeret med rødt, og blodkarret væk fra tumoren blev markeret med blåt. Den microvascule af kontrolgruppen var rigere end forsøgsgruppen angivet ved den hvide pil. Selvom CTA ikke kan få morfologiske ændringer af tumorkapillærer så små som scanningselektronmikroskopi (SEM), CTA var en ikke-invasiv metode til at opnå kontinuerlig og dynamisk overvågning af tumorkapillærer, hvilket var vigtigt for evaluering lægemiddel.

A og B viser 3D segmentering images af CTA de hvide pile viser mikrokar spiring, blev blodkarret nær tumoren markeret med rødt, og blodkarret væk fra tumoren blev markeret med blåt. C og D viser CD31 immunohistokemi af tumorkar. Den sorte pil viser de mikrovaskulære områder.

Patologisk analyse er den gyldne standard for reflekterende væv læsioner. Immunhistokemi farvning af CD31 blev gjort for at vurdere virkningen af ​​Endostar på tumorangiogenese. Behandling med 5 mg /kg /dag af Endostar resulterede i et fald 34,7% i MVD sammenlignet med kontrolgruppen. Repræsentative histologiske billeder af CD31 farvning på tumorvæv blev vist i fig. 2C og D. mikrovaskulaturen tumor behandlet med Endostar var mindre i diameter, og CD31 positive celletal var mindre i Endostar behandling sammenlignet med kontrol. Den CD31 immunhistokemisk resultat var i overensstemmelse med CTA data, og begge af dem bekræftede, at kunne detekteres den antiangiogene virkning Endostar på leverkræft og vurderes af CTA.

Neoplastisk Inhibering blev overvåget ved BLI under Endostar Behandling

der var ingen statistisk signifikant ændring i kropsvægt mellem dyregrupper (fig. 3A), der er angivet, at dosisregimer var veltolereret. Tumorvolumenet blev vist i fig. 3B. For at spore tumor progression og regression mere præcis, vi ikke kun målt tumor volumen, men også udført BLI at registrere de dynamiske lyset skifter intensitet.

A. Musen legemsvægt af subkutane tumor model. B. Muse tumorvolumen af ​​den subkutane tumor model.

Resultaterne viste, at BLI signal af forsøgsgruppen blev inhiberet væsentligt siden dag 8 efter behandling (fig. 4), mens lyset intensiteten af ​​kontrolgruppen steg eksponentielt. Den mest åbenlyse forskel mellem de to grupper blev opnået på dag 12.

subkutane tumor BLI lysintensitet blev vist i fig. 5 Tumoren lysintensitet suppression kunne detekteres så tidligt som dag 8 efter behandling (P 0,05). Kontrolgruppen lysintensitet var 7,8 × 10

6 Fotoner /cm

2 /s på dag 12, mens forsøgsgruppen var kun 5,6 × 10

6 Fotoner /cm

2 /s.

for at give et fuldt anti-tumor evaluering af Endostar, vi oprettet leveren ortotopisk tumor model, som bevarer det maksimale omfang af kræft er “naturlige” mikromiljø [29] – [31]. Vi bedøvet 2 mus på dag 14 efter implantation, og derefter D-luciferin blev injiceret intraperitonealt 3 min med deres lever eksponeret før BLI (fig. 6A). Der var et intenst signal fra de hepatiske luftrør margener. Vi udskåret derefter leveren for BLI straks, og vævet forblev oplyses (fig. 6B). Levervævet blev derefter H 0,05), at FMT lysintensiteten af ​​eksperimentet gruppe var 3,27 × 10

7 Fotoner /cm

2 /s, mens kontrolgruppen var så højt som 4,98 × 10

7 Fotoner /cm

2 /s.

koronal graders visning af ortotopisk tumor progression og narkotika respons blev overvåget af FMT-systemet.

for ortotopisk tumor, plane fluorescerende billeddannelse var utilstrækkelig. Fordi de svage kilder nær overfladen måske vises den samme overflade lysintensitet til de stærkere kilder dybere i væv [32]. FMT var påkrævet for tumor lokalisering og distribution inde i et lille dyr til at producere præcise tomografiske rekonstruktion og visualisering i 3D-tilstand. Vi segmenteret lungerne og leveren gennem CT-data. Genopbygningen Resultaterne blev vist i fig. 9A og B, hvor tumoren var placeret i leveren lap margin. Den effekt af forsøget gruppen var 2,27 mW, mens kontrolgruppen var 3,83 mW. MITK blev anvendt til at rekonstruere tumorvolumen. Kontrolgruppen var 156 mm

3, mens forsøgsgruppen var 107 mm

3. Ud fra ovenstående data, foreslås det, at FMT giver den nøjagtige placering og kvantitativ analyse af den dybe lyskilde, og det fungerede som en ideel metode til dyb afsløring væv.

A og B. FMT rekonstruktion af den ortotopisk tumor model og den delvise forstørrede visning.

diskussion

Optisk molekylær billeddannelse har flere fordele i forhold til traditionelle metoder, især inden for

in vivo

kræft forskning. Det kan især forbedre visualisering, karakterisering og kvantificering af biologiske processer i levende fag [33]. Disse funktioner er meget værdifulde for præklinisk tumor forskning, navnlig til vurdering af nye anti-tumor narkotika.

Sammenligning Fig. 3B med fig. 4 og 5, fandt vi, at forskellene i lysintensiteten opdaget af BLI mellem kontrol- og eksperiment grupper var mere dramatisk end tumoren volumen målt ved calipre. Grunden var, at det bioluminescerende lys udsendt fra tumorcellerne blev afledt fra levende tumorceller, som gav en kvantitativ surrogat måling af antallet af levende tumorceller [34], [35]. Derfor BLI var mere følsomme end traditionelle måling når tumoren hæmning ikke var fuldt afspejlet i tumoren volumen svind. FMT var ikke kun i stand til at rekonstruere tumor placering, men også at beregne tumorvolumen (fig. 9). Således den dybe væv ortotopisk tumor, tomografi var mere passende.

roller CTA, BLI og FMT er komplementære til hinanden, vi brugte det optiske molekylær billeddannelse system til at gøre en mere omfattende vurdering af Endostar om anti -angiogenesis og undertrykkelse af hepatoma vækst. For det første ved hjælp af en blod pool kontrastmiddel og software MITK, CTA muligt for os at opnå en kvantitativ vurdering af fartøjets struktur. Denne metode giver mulighed for kontinuerlig og ikke-invasiv angiogenese forskning. For det andet blev bioluminescerende lys udsendt fra tumorceller afledt af metabolisk aktive tumorceller, kan således pålidelig detektering såsom nogle antiangiogene midler sædvanligvis inhibere tumorudvikling snarere end tumorvolumen krympning opnås ved BLI. Som et resultat, BLI er følsomme nok til at detektere den indlysende tumor hæmning af Endostar gruppe så tidligt som dag 8. For det tredje kan tumorplacering rekonstrueres gennem FMT, som er mindre dybde afhængig. For leveren tumor, FMT var i stand til at rekonstruere 3D fluorescens distribution og give præcise kvantificering som i tidligere undersøgelser [36], [37]. Derfor kombinationen af ​​CTA, BLI og FMT muligt for os at forbedre nøjagtigheden af ​​Endostar anti-cancer effekt.

Vores fremtidige arbejde retning er for yderligere at optimere løsningen af ​​vores Micro-CT. Den konventionelle histologi af tumor fartøjer kræver at ofre stort antal dyr på forskellige tidspunkter, så tager tid for udskæring og farvning væv til at identificere placering og tætheden af ​​skibene. Derfor, hvis CTA er i stand til at opdage minimal vaskulære ændringer, kan det blive en real-time metode til at estimere

in vivo

anti-angiogenese effekt kontinuerligt, hvilket er en effektiv måde at reducere omkostningerne og spare tid. Samtidig vil vi forbedre genopbygningen nøjagtighed bedre løse problemet med høj absorption af lys i dyb væv og integrere forskellige molekylære billeddiagnostiske modaliteter.

Konklusion

Optisk molekylær billeddannelse blev brugt fra en multi-vinkel til verificere virkninger Endostar i leverkræft hæmning. Integrationen af ​​et multi-modalitet systemet opfylder kravene om at være invasiv, præcis, og i stand til kontinuerligt at overvåge Endostar anti-cancer forskning og evaluering narkotika. Den subkutane og ortotopisk mus tumor model samtidig fungerede som omfattende værktøj om evaluering af Endostar terapeutisk forskning. Kombinationen af ​​funktionelle oplysninger med konventionel anatomisk visualisering kunne præcist karakterisere læsioner, og giver invasive biomarkører for terapeutisk ydeevne og patient prognose. Udviklingen af ​​yderligere optiske molekylære billeddiagnostiske faciliteter vores mere omfattende observation af kræft progression og accelererer opdagelsen af ​​nye behandling.

Tak

Vores særlige tak går til læge Sijun Hu, Læge Hui Yan og Doctor Hao Hu fra State Key Laboratory of Cancer Biology og Institut for Digestive Diseases, Xijing Hospital, Den fjerde Military Medical University; de tilbød generøst hjælpe i tumor model bygning.