PLoS ONE: Modulation af aktiviteten af ​​Sp transkriptionsfaktorer ved mithramycin analoger som en ny strategi for behandling af metastatisk prostata Cancer

Abstrakt

dereguleret aktivitet af transkriptionsfaktorer (TFS) i Sp /KLF familie, ligesom Sp1, Sp3 og SP4, og deraf følgende overekspression af Sp-regulerede gener forekommer hyppigt i humane kræftformer. Dette giver rationalet for udvikling af inhibitorer af Sp TF’er som kræftmedicin. Mithramycin A (MTM-A) er en naturlig polyketid som binder GC-rige DNA-sekvenser, inhiberer aktiviteten af ​​SP TF’er og udviser potent antitumoraktivitet i eksperimentelle systemer. Imidlertid er klinisk anvendelse af MTM-A begrænset af alvorlig toksicitet af forbindelsen. Her har vi undersøgt to MTM-A-analoger, som var blevet genereret af genetisk manipulation af MTM-A biosyntesevejen, og evalueret deres aktivitet i human prostatacancer i cellekulturer og musemodeller. Forbindelserne, opkaldt MTM-SDK og MTM-SK, var meget effektive

in vitro

inhibering af proliferation af prostata cancerceller og transkription af Sp-regulerede gener ved at blokere binding af Sp-proteiner til genpromotorer Ved indgivelse til mus begge forbindelser blev veltolereret med maksimalt tolererede doser af MTM-SDK og MTM-SK henholdsvis 4- og 32-gange højere end MTM-A. Efter systemisk administration, blev begge forbindelser ryddet hurtigt fra blodbanen men opretholdt plasmaniveauer langt over de aktive koncentrationer kræves

in vitro

for hæmning af Sp TF-aktivitet og celleproliferation. Konsekvent, MTM-SDK og MTM-SK inhiberede transkription af Sp-regulerede gener i prostata tumorxenoplantater og udviste kraftig antitumorvirkning i subkutane og metastatiske tumor xenograftmodeller med ingen eller minimal toksicitet. Tilsammen indikerer disse data, at MTM-SDK og MTM-SK besidder væsentligt forbedrede farmakologiske og toksikologiske egenskaber i forhold til MTM-A og repræsenterer lovende lægemidler til behandling af fremskreden prostatacancer

Henvisning:. Malek A, Núñez LE , Magistri M, Brambilla L, Jovic S, Carbone GM, et al. (2012) Modulation af aktiviteten af ​​Sp transkriptionsfaktorer ved mithramycin analoger som en ny strategi for behandling af metastatisk prostatakræft. PLoS ONE 7 (4): e35130. doi: 10,1371 /journal.pone.0035130

Redaktør: Leo T.O. Lee, University of Hong Kong, Hongkong

Modtaget: 7. oktober, 2011; Accepteret: 13 mar 2012; Udgivet: 19 april, 2012 |

Copyright: © 2012 Malek et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Fondazione Ticinese per la Ricerca sul Cancro, Swiss National Science Foundation og schweiziske Cancer League til CVC og GMC. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Medforfattere FM og LEN er medarbejdere og FM er aktionær i EntreChem SL, licenstageren selskab af forbindelserne, der er beskrevet i manuskriptet. Alle andre forfattere nødt til at erklære, at ingen konkurrerende interesser exist.This ikke ændrer forfatternes tilslutning til alle de PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Tumor initiering og progression er medieret af flere signalveje og de terapeutiske fordele opnåelige ved at målrette de enkelte veje kan være begrænset [1]. Målretning de steder konvergens af forskellige regulatoriske kaskader kan repræsentere en mere lovende strategi for kræftbehandling. Transkriptionsfaktorer (TFS) er særligt attraktive i denne henseende, da de er knudepunkt i signalveje og ofte dereguleret i humane cancere [1], [2]. Afvigende ekspression eller aktivitet af medlemmerne af Sp /KLF familie af TF’er, ligesom Sp1, Sp3 og SP4, forekommer i mange humane cancere [3] Sp TF’er binder til GC-rige DNA-elementer (GC-box) i genpromotorer, interagere med komponenter af basal transkriptionelle maskineri, samarbejder med andre TF’er og er nedstrømseffektorer af multiple signalveje [3]. Flere undersøgelser har vist, at Sp TF’er har vigtige roller i patogenesen af ​​menneskelige kræftformer og er lovende terapeutiske mål [3], [4], [5],.

Mithramycin A (MTM-A) er en naturlig polycykliske aromatiske polyketid produceret af forskellige

Streptomyces

arter [14]. MTM-A binder fortrinsvis til GC-rige sekvenser i DNA, blokke kompetitivt binding af Sp TF’er og andre GC-bindende proteiner til GC-rige elementer i genpromotorer og hæmmer transskription af Sp regulerede gener [15], [16], [ ,,,0],17], [18], [19]. Inhibering af Sp regulerede gener er den vigtigste determinant for den biologiske aktivitet af MTM-A i eksperimentelle systemer [20], [21]. Klinisk anvendelse af MTM-A imidlertid begrænset på grund af toksiciteten af ​​forbindelsen [22]. Genetisk engineering af MTM-A biosyntesevejen har givet mulighed for at skabe nye analoger af MTM-A, der kan besidde forbedrede farmakologiske og toksikologiske egenskaber [23], [24], [25], [26]. For nylig, to forbindelser, opkaldt MTM-SDK og MTM-SK, blev opnået ved anvendelse af metabolic engineering tilgang [27], [28]. MTM-SDK og MTM-SK udviste større evne til at blokere Sp1-binding til DNA og cellulær optagelse sammenlignet med MTM-A. Dette førte til forøget biologisk aktivitet som inhibitorer af Sp reguleret gentranskription og proliferation af cancerceller både in vitro og in vivo [27], [29]. Således kan disse nye MTM-A-analoger være nyttige til behandling af cancere med unormal aktivitet af Sp TF’er.

I denne undersøgelse evaluerede vi aktiviteten af ​​MTM-A analoger MTM-SDK og MTM-SK i eksperimentelle modeller af human prostatacancer. Prostatacancer er den mest almindelige cancer og den næsthyppigste årsag til kræft dødsfald hos mænd i vestlige lande [30]. Konventionel styring af prostatakræft omfatter kirurgi, strålebehandling og androgen deprivation [31]. På trods af den gradvise stigning i sygdomsfri overlevelse og livskvalitet, metastatisk spredning er stadig den vigtigste dødsårsag for patienter med prostatacancer [31]. Fremskreden prostatacancer er ofte resistente over for hormonbehandling og systemisk kemoterapi har begrænset effekt [31], [32]. Palliativ behandling fortsat den vigtigste mulighed for mange af disse patienter. Derfor skal nye terapeutiske metoder, der skal gennemføres for at håndtere metastatisk prostatacancer. Staten Sp TF’er i prostatakræft har været dårligt undersøgt til dato. Vi fandt imidlertid dokumentation for en rolle for dereguleret aktivitet af Sp TF’er i initiering og progression af prostatakræft. Mange gener rapporteret at være involveret i prostata tumorigenese reguleres af Sp faktorer (se Metoder S1, tabel S1, S2 og referencer deri). Forbindelser, der interfererer med Sp TF’er ved forskellige mekanismer har relevant aktivitet i forskellige kræftformer, herunder prostatakræft [7], [8], [9], [10], [11], [33], [34], [35] , [36], [37], [38]. Disse overvejelser, sammen med bioinformatik analyser af offentliggjorte genekspression datasæt, førte os til at hypotesen, at Sp TF’er kunne være relevante mål i prostata tumorer, og at de nye MTM-A-analoger med forbedrede farmakologiske egenskaber kan være nyttige til behandling af denne sygdom.

Materialer og metoder

Forbindelser og cellelinier

Menneskelig prostatakræft PC3, DU145, blev 22Rv1 og LNCaP celler opretholdt i RPMI 1640 [39]. Normale humane fibroblaster blev opretholdt i DMEM [27]. MTM-A, blev MTM-SK (EF-7072) og MTM-SDK (EF-7073) fremstillet som tidligere beskrevet [27]. Stamopløsninger af forbindelserne (10 mM) blev fremstillet i sterilt saltvand eller DMSO og fortyndes i steril saltvandsopløsning umiddelbart før anvendelse [29]. Til genekspression og chromatin immunoprecipitation (chip) celler blev behandlet med 100 nM af MTM-SDK og MTM-SK eller vehikel i 24 timer.

RNA og protein analyse

Totalt RNA fra dyrkede celler og tumorvæv blev isoleret og revers transkriberet som beskrevet [27], [29]. Kvantitativ real-time RT-PCR (QRT-PCR) blev udført under anvendelse ABI PRISM 7000HT Sequence Detection System og SYBRGreen PCR Master Mix (Applied Biosystems) som beskrevet [29]. PCR-primere er vist i tabel S3.

GAPDH

B2M

blev brugt som interne kontroller. Ekspressionssystemer data blev udtrykt som en procentdel af kontrol-genekspression som beskrevet [29]. Slutpunkt RT-PCR blev udført som beskrevet tidligere under anvendelse af SuperScript One-Step RT-PCR-system (Invitrogen) og genspecifikke primere [27]. Cellelysater blev fremstillet ud fra kontrol- og lægemiddelbehandlede celler og proteiner blev adskilt på SDS-polyacrylamidgeler. Immunoblotting blev udført som beskrevet tidligere [27], [40].

chromatin immunoprecipitation (chip)

Celler blev opsamlet, tværbundet med formaldehyd og behandlet efter en modificeret EZ-chip kit protokol (Upstate Biotechnology) som beskrevet [41]. Kromatin blev immunpræcipiteret med et antistof for Sp1 og normal muse-IgG som negativ kontrol. DNA-protein-tværbindinger blev vendt, og DNA blev oprenset fra totale cellelysater (input) og immunopræcipiteret fraktioner. qPCR blev udført som indikeret ovenfor. Primere til chipanalyse af C-MYC og VEGF-promotoren er vist i tabel S3. Mængden af ​​bundet DNA blev beregnet i forhold til en standardkurve og udtrykt som procent af input DNA [41].

In vitro

celievækstinhiberingen

Cellernes levedygtighed var bestemt ved anvendelse af MTT kolorimetrisk assay som beskrevet [27]. Celler blev udpladet i 96-brønds plader og inkuberet med vehikel eller forbindelser i 24 og 72 timer. Hver behandling blev udført tre gange og forsøg blev gentaget mindst tre gange.

Dyr og xenograftmodeller

athymiske mandlige nøgne mus (Balb c nu /nu, 6-8 uger gamle) blev erhvervet fra Harlan Laboratories. Musene blev opretholdt under patogenfrie betingelser med mad og vand forudsat

ad libitum

deres generelle sundhedstilstand blev overvåget dagligt. Alle protokoller involverer forsøgsdyr blev gennemført i overensstemmelse med de institutionelle retningslinjer og i overensstemmelse med nationale og internationale love og politikker. Eksperimentelle procedurer og studere protokoller er blevet gennemgået og godkendt af den schweiziske Cantonal Veterinary Authority (Godkendelse nr. 05/2011). At etablere subkutane tumorxenotransplantater, PC3-celler (2 x 10

6 celler) blev inokuleret i flanken af ​​mus. For den metastatiske xenograft model, PC3-celler (0,6 x 10

6) injiceret to gange i halevenen med en 24-h interval mellem injektionerne.

Toksicitet

Healthy CD-1 mus, som universitetet i Oviedo Animal Facility blev behandlet med en enkelt eller gentagne IV injektioner af MTM-SK, MTM-SDK og MTM-A. Hver gruppe bestod af 4 mus. For gentagne doser, blev medikamenter administreres af IV injektioner hver to eller tre dage for i alt 10 injektioner. Kropsvægt, dødsfald, ændringer i adfærd, motilitet, spise og drikkevaner, og andre tegn på lokal eller systemisk toksicitet blev registreret dagligt.

Farmakokinetik

Sunde CD-1 mus injiceret IV med MTM-SK (18 mg /kg) og MTM-SDK (2 mg /kg). Blod blev indsamlet på fem tidspunkter mellem 5 og 120 minutter. På hvert tidspunkt blev analyseret 3 mus per gruppe. Plasmaprøver blev fortyndet med 4 volumener acetonitril, vortexes og centrifugeret for at fjerne eventuelt uopløseligt bundfald. Supernatanten blev derefter anvendt til at måle MTM-SDK og MTM-SK ved LC-MS. Plasma niveauer blev vurderet efter intraperitoneal (IP) og IV injektion af MTM-SK (18 mg /kg) også ved HPLC-UV.

genekspressionsanalyse i tumorxenoplantater

For at evaluere effekten på transkription i tumorvæv blev mus der bar subkutane tumorer behandlet med MTM-SDK (1,2 mg /kg) og MTM-SK (8 mg /kg) eller saltvandsopløsning ved IV injektion. Dyr blev aflivet efter 1, 3 og 7 dage fra injektionen. Tumorer blev straks opsamlet og lynfrosset til RNA-isolering. QRT-PCR blev udført som beskrevet ovenfor. På hvert tidspunkt 4 mus blev analyseret i hver forsøgsgruppe og QRT-PCR udført tredobbelt for hver prøve.

Antitumoraktivitet

Mus der bar subkutane tumorer blev behandlet med forbindelser eller vehikel. Hver forsøgsgruppe bestod af 10 mus. Lægemidler blev fremstillet i steril saltvandsopløsning og givet ved IP injektioner hver 3 dage. Kontrolmus modtog IP injektion af steril saltvandsopløsning. Tumorstørrelse blev målt med en passer to gange om ugen. Dataene repræsenterer gennemsnit ± SD af 10 mus per gruppe.

Antimetastatisk aktivitet

For at evaluere forbindelser evnen til at blokere metastatisk tumorvækst, mus fik hale vene injektioner af tumorceller at etablere lunge metastase. Derefter mus blev behandlet med MTM-SDK (1,2 mg /kg), MTM-SK (8 mg /kg) eller sterilt saltvand afgivet IP injektioner hver 3 dage startende to uger efter haleveneinjektion af tumorceller. To grupper af ubehandlede mus (

n = 3 pr gruppe

) blev aflivet efter 1 og 2 uger fra injektionen for at bekræfte implantering og vækst af metastatiske celler. Kontrol og lægemiddelbehandlede mus (

n = 3 pr gruppe

) blev derefter aflivet efter 1 og 2 uger fra begyndelsen af ​​behandlingen. Lungevæv blev opsamlet for qPCR analyse og histologisk undersøgelse efter H 0,01; **, P 0,001. C) Level of Sp1, Sp3 og SP4 mRNA blev bestemt ved RT-PCR i PC3-celler inkuberet med 100 nM af MTM-SDK, MTM-SK eller køretøj, i 24 og 48 timer. GAPDH blev anvendt som kontrol. D) Protein niveau af Sp1, c-Myc, XIAP, og cyclin D1 blev bestemt ved immunoblotting i PC3-celler inkuberet med 100 nM af MTM-SDK, MTM-SK eller køretøj, i 24 og 48 timer.

MTM-A og dets analoger binder til GC-rige DNA-elementer og forhindrer binding af GC-bindende proteiner, såsom SP TF’er til genpromotorer. For at bestemme, om virkningerne på transskription var på grund af hæmning af Sp binding, målt vi bindingen af ​​Sp1 til

C-MYC

VEGFA

promotor i kontrol og narkotika behandlede celler ved kromatin immunopræcipitation . MTM-SDK og MTM-SK væsentligt reduceret binding af Sp1 til

C-MYC

VEGFA

promotor (fig. 1B). MTM-SDK var mere effektivt end MTM-SK, efter aftale med genekspression data. Som Sp proteiner kan styre deres egen transskription [3], vi vurderet om MTM-SDK og MTM-SK påvirkede deres udtryk. Sp1, Sp3 og SP4 udtrykkes i PC3-celler og behandling med MTM-A analoger reducerede mRNA-niveauet af Sp1, SP4 og i mindre grad Sp3 (fig. 1C). Igen MTM-SDK var mere effektivt MTM-SK. Protein niveauer af SP1 og Sp mål, ligesom c-myc, blev også reduceret ved behandling med MTM-SDK- og MTM-SK efter aftale med mRNA data (fig. 1D).

MTM-SDK og MTM- SK hæmme spredning af prostatacancerceller

Hæmning af Sp TF’er har vist sig at påvirke spredning og overlevelse af kræftceller. Vi undersøgte de antiproliferative virkninger af MTM-SDK og MTM-SK i et panel af prostatakræft-cellelinier, der repræsenterer androgen-afhængig (AD) og androgen-uafhængige (AI) prostatatumorer. LNCaP-celler er androgen receptor (AR) positiv og afhænger af AR signalering. 22Rv1 er AR positive men AI. PC3 og DU145 er AR negative og AI. Vækst af alle de testede cellelinjer, uafhængig af deres AR tilstand, var stærkt inhiberet af begge forbindelser, med MTM-SDK er mere effektiv end MTM-SK (fig. 2). IC

50 værdier er rapporteret i figur 2. Endvidere væksten af ​​prostatacancerceller blev inhiberet af ≥50% ved ≤100 nM begge lægemidler. Især lægemidlerne havde nogen virkning ved disse doser på normale humane fibroblaster (fig. 2). Levedygtighed normale fibroblaster blev påvirket lidt ved højere doser (~20-30% inhibering ved 500 nM). Denne forskel i følsomhed mellem normale og kræftceller var i overensstemmelse med vores tidligere data, der viser, at normale fibroblaster var mere modstandsdygtige end ovariecancerceller til induktion af apoptose, når de udsættes for MTM-SDK [27].

Prostatakræft celler (DU145, 22Rv1, PC3 og LNCaP) og primære kulturer af normale humane fibroblaster (NHF) blev inkuberet med forbindelserne i 72 timer. Cellelevedygtighed blev målt ved kolorimetrisk MTT-assayet. Data er præsenteret som gennemsnit ± SD af tredobbelte prøver af 3 uafhængige forsøg. IC

50 for hver celletype er rapporteret i det nederste panel.

Toksicitet af MTM-SDK og MTM-SK

Systemisk toksicitet er en stor begrænsning for den kliniske anvendelse af MTM-A. Derfor har vi vurderet de doser, hvor MTM-SDK og MTM-SK kunne sikkert administreret til mus på både akut og kronisk administration. De maksimale tolererede doser (MTD) af MTM-SDK og MTM-SK efter en enkelt intravenøs injektion var 4 mg /kg og 32 mg /kg (tabel 1). MTD MTM-SK til gentagen behandling var 8 og 18 mg /kg ved hjælp af q2d × 10 og Q3D × 10 tidsplan, hhv. MTD MTM-SDK var 1,2 mg /kg og 1,8 mg /kg, når det blev givet med q2d × 10 og Q3D × 10 tidsplan. Vi testede til sammenligning MTM-A og fandt, at MTDs var 1 mg /kg og 0,5 mg /kg for en enkelt og gentagne (q2d × 10) administration. Yderligere dosisøgning af både MTM-SK end MTM-SDK og gentagen behandling resulterede i fremadskridende tab af kropsvægt og andre tegn på alvorlig kronisk toksicitet, herunder nedsat mobilitet, conjunctivitis og perifer neuropati. Afslutningsvis kunne bemærkelsesværdigt højere doser af MTM-SK end MTM-SDK forhold til MTM-A gives sikkert både som enkelt og gentagen injektioner til mus uden tegn på toksicitet.

farmakokinetik MTM-SDK og MTM-SK

Blodniveauer af MTM-SK og MTM-SDK blev målt efter en enkelt IV injektioner i en dosis på 18 og 2 mg /kg (fig. 3). Begge forbindelser blev ryddet hurtigt fra blodbanen med lignende overordnede kinetik. Efter 5 min plasmaniveauer var omkring 20 og 0,7 uM for MTM-SK og MTM-SDK hhv. Efter 1 time niveauerne af MTM-SK og MTM-SDK var ca. 1 og 0,1 pM, henholdsvis. Således plasmaniveauer af begge forbindelser var på eller over koncentration, der kræves

in vitro

for cellevækst hæmning og undertrykkelse af Sp1 afhængig transkription. Næste sammenlignede vi farmakokinetik MTM-SK følgende enkelt IV og IP injektioner. Ved siden af ​​den første top set med iv injektion, kinetikken efter IV og IP administration var ret ens, frem til sammenlignelige lægemiddelniveauer i plasmaet inden 15-30 minutter og opretholde tilsvarende niveauer over 2-timers periode af analysen (fig. S3 ).

Mus (n = 3 /gruppe) modtog en enkelt intravenøs injektion af MTM-SK (a) eller MTM-SDK (B) og plasmaniveauer blev bestemt ved LC-MS. Doser af MTM-SK og MTM-SDK var 18 mg /kg og 2 mg /kg.

MTM-SDK og MTM-SK hæmme genekspression i human prostata tumorxenoplantater

for at bestemme om de MTM-a-analoger var i stand til at interferere med aktiviteten af ​​Sp TF’er in vivo efter systemisk administration, mus med PC3 tumorxenografter blev behandlet med en enkelt intravenøs injektion af MTM-SDK (1,2 mg /kg), MTM -SK (8 mg /kg) eller saltvandsopløsning. Tumorer blev udskåret ved 1, 3 og 7 dage efter injektionen og RNA-niveauer af udvalgte Sp regulerede gener blev målt ved QRT-PCR. Angivelse af

C-MYC

,

hTERT

,

VEGFA

,

C-SRC

,

CCDN1

,

CCNE1

,

XIAP

,

MCL1

BIRC5

blev signifikant reduceret med både MTM-SDK og MTM-SK på 24 timer (Fig. 4). Der var imidlertid en forskel mellem de to forbindelser i kinetikken for helbredelse fra transkriptionel inhibering. Effekten af ​​MTM-SDK varet længere. De fleste gener blev stadig undertrykt af 30 til 50% efter 3 dage. Selv efter 7 dage

VEGFA

,

C-SRC

XIAP

var stadig betydeligt nedreguleret. Virkningen af ​​MTM-SK blev vendt hurtigere med de fleste gener vender tilbage til kontrolniveauer indenfor 3 eller 7 dage. Således begge lægemidler var effektive til at reducere transkription af SP-regulerede gener, når det gives systemisk til mus, hvilket bekræfter akkumulering af aktive lægemiddelkoncentrationer i tumorvævet. Endvidere virkningen af ​​MTM-SDK var mere udtalt og vedvarende sammenlignet med MTM-SK, i overensstemmelse med

in vitro Salg data om Sp1-binding og genekspression.

Mus (n = 4 /gruppe ) med subkutane tumorer blev behandlet med en enkelt intravenøs injektion af MTM-SDK, MTM-SK eller steril saltvandsopløsning. Doser af MTM-SK og MTM-SDK var 8 mg /kg og 1,2 mg /kg. Tumorer blev høstet 1, 3 og 7 dage efter lægemiddelinjektion. Genekspression blev bedømt ved QRT-PCR. Data repræsenterer gennemsnit ± SD af transkriptet niveau normaliseret til B2M RNA og præsenteres som procent af ekspression sammenlignet med kontrolmus, der modtog steril saltvandsopløsning. *, P 0,01; **, P. 0,001

MTM-SDK og MTM-SK hæmme væksten af ​​prostata tumorxenoplantater

Anti-tumor aktiviteten af ​​MTM-SDK og MTM-SK blev undersøgt anvendelse af subkutane tumorxenografter af PC3 prostatacancerceller. PC3 celler er AI, stærkt tumorigene og metastatiske. Således er disse celler repræsenterer en god model af avancerede kastrationsresistent prostatacancer. Mus der bærer PC3 tumorxenografter modtaget MTM-SDK (0,6, 1,2 og 1,8 mg /kg, Q3D × 10) og MTM-SK (4, 8 og 12 mg /kg,) hver 3 dage ved IP injektioner. IP administration blev valgt som det er almindeligt brugt i længere behandlinger med anticancer-forbindelser. Desuden IV og IP-injektioner var næsten tilsvarende i form af plasmaniveauer og farmakokinetik. Doser og tidsplan for administration blev også baseret på de farmakodynamiske og MTD data beskrevet ovenfor. Behandlingen blev afsluttet, når musene i kontrolgrupperne måtte ofres på grund af overdreven tumorbyrde. Lægemiddelbehandlede mus blev fulgt i en anden uge efter afslutningen af ​​behandlingen. Behandling med MTM-SDK og MTM-SK reducerede tumorvækst (fig. 5A-B). Forskellen mellem behandlede og ubehandlede mus var yderst statistisk signifikant ved alle testede doser. Efter behandlingen blev afbrudt, vækst af subkutane tumorer langsomt genoptaget med en lidt hurtigere kinetik i forbindelse med de lavere doser af MTM-SK. Dette er i overensstemmelse med farmakodynamiske data, hvilket indikerer en hurtigere genopretning af genekspression efter MTM-SK behandling. Interessant var imidlertid minimal tumorgenvækst set i mus behandlet med den højeste dosis af MTM-SK. Behandling med MTM-SDK og MTM-SK resulterede i en lille tab af kropsvægt, der var korreleret med dosisniveau men ikke statistisk signifikant (fig. 5C-D). Ingen tegn på akut toksicitet eller lokal irritation på injektionsstedet blev observeret under behandling. To mus behandlet med den højeste dosis af MTM-SDK (1,8 mg /kg) viste tegn på toksicitet (fx nedsat bevægelighed, perifer neuropati) efter flere injektioner. Disse mus blev taget behandling og blev ikke medtaget i vurderingen af ​​antitumoraktivitet. Da den samme dosis blev givet sikkert til ikke-tumorbærende mus, kunne den observeret ved denne dosis toksicitet skyldes tilstedeværelsen af ​​tumoren eller forskelle i mus stamme eller køn.

Mus med subkutane tumorer blev behandlet med de angivne doser af MTM-SDK, MTM-SK eller steril saltvandsopløsning (kontrol) administreret ved IP-injektioner to gange om ugen i fem uger (Q3D × 10). Tumorvolumen (A) og kropsvægt (B) blev målt to gange om ugen. Resultater udtrykkes som middel ± SD af tumorvolumen i hver gruppe. Pile viser begyndelsen og slutningen af ​​behandlingen. **, P. 0,001

MTM-SDK og MTM-SK hæmme væksten af ​​metastatisk prostatacancer

Vi var interesserede i at afgøre, om behandling med MTM-A-analoger var også effektive i et metastatisk model af prostatacancer. Til dette formål anvendte vi en eksperimentel lunge metastase at undersøge virkningerne af behandlingen på dissemineret humane cancerceller i immundeficiente mus. PC3-celler blev injiceret i halevenen på mus og væksten i lunge metastase blev overvåget ved qPCR over en 4 ugers periode [42]. En gruppe af ubehandlede kontrolmus blev aflivet efter den første og anden uge fra injektion af tumorceller. På dette tidspunkt, lungerne indeholdt 0,015 og 0,135% af humane celler, henholdsvis bekræfter implantation og proliferation af de injicerede humane cancerceller (fig. 6A). Derefter modtog musene hver 3 dage IP injektioner af MTM-SDK (1,2 mg /kg), MTM-SK (8 mg /kg) eller vehikel. Grupper af kontrol- og lægemiddelbehandlede mus blev aflivet to dage efter den anden og fjerde injektion og deres lunger undersøgtes for tilstedeværelsen af ​​metastaser. På dette tidspunkt, kontrolmus indeholdt 2,08% og 5,94% af henholdsvis humane cancerceller i overensstemmelse med udvidelsen af ​​metastatiske foci i lungerne (fig. 6A). I stedet mus behandlet med MTM-SDK havde 0,14% og 0,09%, og der blev behandlet med MTM-SK havde 0,43% og 0,42% af humane cancerceller efter den anden og fjerde injektion hhv. Således væksten af ​​disseminerede humane metastatiske celler blev næsten fuldstændig undertrykt af behandlingen. De qPCR data blev bekræftet ved histologisk undersøgelse af lungesnit taget ved afslutningen af ​​eksperimentet (fig. 6B). Multiple metastatiske knuder blev påvist i lungen af ​​kontrolmus, mens der ikke var nogen metastaser påvises ved mikroskopisk undersøgelse af serielle sektioner af lungerne af de lægemiddelbehandlede dyr.

Mus blev givet PC3 ved IV injektion i halevenen og derefter startende 3 uger senere modtog IP injektioner af MTM-SDK, MTM-SK eller steril saltvandsopløsning to gange om ugen i to uger. Doserne af MTM-SK og MTM-SDK var 8 mg /kg og 1,2 mg /kg. A) qPCR vurdering af lunge metastase. Kontrolmus blev aflivet 1 og 2 uger før behandling og derefter kontrollere og lægemiddelbehandlede mus blev aflivet ved slutningen af ​​den første og anden uge af behandlingen. Resultater er præsenteret som gennemsnit ± SD af procentdelen af ​​humane celler sammenlignet med den samlede museceller i lungen (n = 3). Pile angiver tidspunktet for lægemiddelinjektioner. B) Mikroskopisk evaluering af lunge metastase. Lungevæv blev opsamlet fra kontrol- og lægemiddelbehandlede mus ved afslutningen af ​​eksperimentet og farvet med H 0,001

Diskussion

Sp familie transkriptionsfaktorer styre mange cellulære processer er afgørende for udvikling af humane tumorer [3]. Diverse strategier er blevet undersøgt i de seneste år til at blande sig med aktiviteten af ​​Sp TF’er herunder naturlige forbindelser og små interfererende RNA. Aureolic-derivater, som MTM-A, er effektive hæmmere af Sp TF’er [15], [18], [19], [20]. Disse forbindelser binder til GC-rige DNA og forhindrer interaktionen af ​​TF’er med GC-rige sekvenser i genpromotorer. Eftersom Sp TF’er kontrollere deres egen transskription, MTM-A reducerer niveauet af Sp proteiner og dermed styrke effekten på transkriptionel aktivitet [21], [34]. Forskellige faktorer kan påvirke de farmakologiske og toksikologiske egenskaber af de aureolic antibiotika: affinitet for GC-rige sekvenser, forening /dissociationskinetikken til DNA, evne til at konkurrere med Sp proteiner til binding til DNA og cellulær optagelse [17], [20], [ ,,,0],27], [43].