PLoS ONE: 4-oxo-N- (4-hydroxyphenyl) retinamid: To uafhængige måder at dræbe kræftceller

abstrakt

Baggrund

retinoid 4-oxo-N- (4-hydroxyphenyl) retinamid (4-oxo-4-HPR) er en polær metabolit af fenretinid (4-HPR ) meget effektivt dræber cancerceller fra forskellige histotypes, i stand til at inhibere 4-HPR-resistent cellevækst og at virke synergistisk i kombination med moderstoffet. I modsætning 4-HPR og andre retinoider, 4-oxo-4-HPR inhiberer tubulin-polymerisation, hvilket fører til multipolær spindeldannelse og mitosestandsning. Her undersøgte vi, om 4-oxo-4-HPR, like 4-HPR, udløste celledød også via reaktive oxygenarter (ROS) generation og om dens antimikrotubulær aktivitet var relateret til en ROS-afhængig mekanisme i æggestokkene (A2780), bryst ( T47D), livmoderhalskræft (HeLa) og neuroblastom (SK-N-BE) kræft cellelinjer.

Metode /vigtigste resultater

Vi fremlagt beviser, at 4-oxo-4-HPR, foruden skuespil som et antimikrotubulær substans, induceret apoptose gennem en signaleringskaskade startende fra ROS generation og involverer endoplasmatiske reticulum (ER) stress respons, jun N-terminal kinase (JNK) aktivering og opregulering af proapoptotiske placenta knoglemorfogenetisk protein (PLAB). Gennem tidsforløbet analyse og inhibering af ROS-relateret signalvej (opstrøms af vitamin C og nedstrøms af PLAB lyddæmpning), demonstrerede vi, at antimitotiske aktivitet af 4-oxo-4-HPR var uafhængig af oxidativt stress fremkaldt af retinoidet . Faktisk ROS-generering fandt sted tidligere end mitosestandsning (inden for 30 minutter og 2 timer, henholdsvis) og ophævelse af ROS-relaterede signalvej forhindrede ikke 4-oxo-4-HPR-induceret mitosestandsning.

konklusioner /Signifikans

Disse data indikerer, at 4-oxo-4-HPR anticancer aktivitet skyldes mindst to uafhængige mekanismer og give en forklaring af evnen af ​​4-oxo-4-HPR at være mere potent end moderstoffet, og også at være effektiv i 4-HPR-resistente cellelinier. Desuden kunne den dobbelte virkningsmekanisme tillade 4-oxo-4-HPR til effektivt målrette tumor og til sidst modvirke udviklingen af ​​lægemiddelresistens

Henvisning:. Tiberio P, Cavadini E, Abolafio G, Formelli F , Appierto V (2010) 4-oxo-N- (4-hydroxyphenyl) retinamid: To uafhængige måder at dræbe kræftceller. PLoS ONE 5 (10): e13362. doi: 10,1371 /journal.pone.0013362

Redaktør: Andrei L. Gartel, University of Illinois i Chicago, USA

Modtaget: Juli 9, 2010; Accepteret: September 20, 2010; Udgivet: 14 oktober 2010

Copyright: © 2010 Tiberio et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Undersøgelsen blev støttet af tilskud fra Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (https://www.airc.it), Milano, Italien, gennem tilskud og et fællesskab (P. Tiberio). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Retinoider er en klasse af kemiske forbindelser strukturelt beslægtet med vitamin a, som modulerer fundamentale cellulære processer, herunder celleproliferation, differentiering og apoptose [1]. Det syntetiske retinoid fenretinid eller N- (4-hydroxyphenyl) retinamid (4-HPR) er et ikke toksisk analog af all-trans-retinsyre [2], som allerede vist lovende resultater i præneoplastiske [3] – [5] og neoplastiske tilstande [6], [7]. I dyrkede celler, har 4-HPR blevet vist at inducere vækstinhibering og apoptose i forskellige cancercellelinier og forskellige virkningsmekanismer er blevet foreslået, herunder produktion af reaktive oxygenarter (ROS) og deraf følgende oxidativ stress [8], [9 ]. Vi har for nylig rapporteret, at i ovariecancerceller, er 4-HPR-induceret apoptose medieret af proapoptotiske placentalt knoglemorfogenetisk protein (PLAB), og at dens opregulering af 4-HPR sker gennem aktivering af en signaleringskaskade startende fra forøgelse af ROS generation , hvilket fører til induktion af endoplasmatisk reticulum (ER) stressrespons og Jun N-terminal kinase (JNK) aktivering [9], [10]. Ud fra analysen af ​​plasma prøver af 4-HPR-behandlede patienter, har vi identificeret en ny 4-HPR polær metabolit, 4-oxo-N- (4-hydroxyphenyl) retinamid (4-oxo-4-HPR) [11], som er udstyret med lovende biologiske egenskaber [12]. 4-oxo-4-HPR fremkalder antiproliferative og apoptotiske effekter i forskellige cancercellelinier (dvs. ovarie-, bryst-, og neuroblastom tumor cellelinier) og er to til fire gange mere effektiv end 4-HPR til inhibering af cellevækst [12]. Interessant 4-oxo-4-HPR er også effektiv i 4-HPR-resistente celler og i kombination med 4-HPR, har en synergistisk virkning [12]. I lighed med 4-HPR, tumor vækstinhiberende virkninger af 4-oxo-4-HPR er uafhængige af nukleare retinoidreceptorer (RAR). Desuden 4-HPR og 4-oxo-4-HPR deler flere signaling mellemprodukter, såsom ROS-generering, forøgelse af intracellulære ceramidniveauer, og aktivering af caspase-3 og caspase-9 [12]. Despites disse ligheder, 4-oxo-4-HPR synes at have yderligere virkningsmekanismer sammenlignet med det oprindelige lægemiddel, også foreslået ved dets evne til at være effektive i 4-HPR-resistente celler [12]. Til forskel 4-HPR, 4-oxo-4-HPR forårsager en markant akkumulering af celler i mitotisk fase, specifikt i præ-anafase, kombineret med aktivering af spindlen kontrolpunkt [13]. 4-oxo-4-HPR-induceret standsning i mitose er associeret med afvigende spindeldannelse (dvs. multipolær organisation uden tab af centrosom integritet), skyldes muligheden af ​​4-oxo-4-HPR at målrette mikrotubuli og til at inhibere tubulinpolymerisation via en direkte molekylær interaktion med tubulin [13] .Den foreliggende undersøgelse blev planlagt for yderligere at dissekere 4-oxo-4-HPR virkningsmekanismer underliggende sin antiproliferative virkning, undersøge, om anticancer aktivitet af retinoid kan opstå som af dens evne til at øge ROS-generering og om antimitotiske aktivitet af retinoid er relateret til oxidativt stress. Vi har heri påvist, at, ligesom 4-HPR, 4-oxo-4-HPR forårsager forøgelse af ROS-generering, efterfulgt af induktion af ER stress respons, aktivering af JNK og PLAB opregulering og at denne signaleringskaskade er delvist involveret i den antiproliferative virkning af retinoid. Desuden 4-oxo-4-HPR antimitotisk effekt er funktionelt uafhængig af ovennævnte apoptotiske kaskade, hvilket indikerer, at 4-oxo-4-HPR antitumor virkning skyldes mindst to uafhængige virkningsmekanismer.

resultater

ROS-generering deltager i 4-oxo-4-HPR-induceret apoptose i A2780-celler Salg

Vi har for nylig rapporteret, at 4-HPR udløser apoptose gennem aktivering af en signaleringskaskade, der starter fra ROS generation og som involverer ER stressreaktioner, JNK aktivering og PLAB opregulering [9]. For at undersøge, om signaleringskaskade ansvarlig for 4-HPR-induceret apoptose også var involveret i apoptose induceret af 4-oxo-4-HPR, vi først analyseret inddragelse af ROS-generering i apoptose induceret af 4-oxo-4-HPR i A2780, til en human ovariecarcinom cellelinie, valgt, fordi det allerede er kendt være lydhøre over for den retinoid (IC

50 = 0,6 uM i et 72 timers assay) og skabe ROS i respons på 4-oxo-4- HPR behandling [12]. Inddragelsen af ​​ROS-produktion blev analyseret ved at evaluere effekten af ​​antioxidanten vitamin C på 4-oxo-4-HPR-induceret apoptose. Fem uM 4-oxo-4-HPR behandling i 4 timer forårsagede en stigning af ROS produktionen, der blev forhindret ved tilsætning af 100 C uM vitamin (figur 1A). Ophævelsen af ​​ROS-generering af vitamin C forårsagede en reduktion (1,7 gange) den 4.-oxo-4-HPR-induceret apoptose, beregnet som DNA-fragmentering ved et ELISA-assay (figur 1B). En tilsvarende reduktion apoptose er blevet observeret gennem bestemmelse af sub-G

1 befolkning ved propidiumiodidfarvning efterfulgt af flowcytometri analyse (se figur 5 og relativ resultat afsnit). Disse data tydede på, at ROS-generering induceret af 4-oxo-4-HPR var involveret i 4-oxo-4-HPR-induceret apoptose.

(A) Analyse af ROS-produktion i A2780-celler behandlet i 4 timer med 5 uM 4-oxo-4-HPR, med eller uden 100 pM vitamin C. analysen blev udført ved flowcytometri efter tilsætning af redox-sensitive farvestof CM-H

2DCFDA. Grafen viser repræsentative flowcytometri fluorescens-profiler i forskellige betingelser for behandling (et repræsentativt eksperiment af tre). Et skift til højre fra kontrol indikerer øget ROS niveauer. (B) A2780 celler blev behandlet i 24 timer med 5 uM 4-oxo-4-HPR, med eller uden 100 pM vitamin C og apoptose, beregnet som DNA-fragmentering, blev målt ved en ELISA-assay. Dataene er hjælp af tre uafhængige forsøg; lodrette streger er standardafvigelser. Asterisk angiver signifikant forskel (P 0,05).

4-oxo-4-HPR inducerer ER stress respons i A2780 celler

Vi analyserede, om 4-oxo-4-HPR, like 4-HPR [9], aktiveres, nedstrøms for ROS-generering, en ER stressrespons, ved at evaluere ER-stress specifikke signaler: post-transkriptionel splejsning af transkriptionsfaktoren X-box-bindende protein-1 (XBP-1), ekspressionen af ​​Chaperon proteiner glucose-reguleret protein 78 KD (GRP-78) /immunoglobulin-bindende protein (Bip) og varmechokprotein 70 (HSP70), og phosphorylering status af alfa-underenheden af ​​eukaryot initieringsfaktor 2 ( eIF2α) [14]. I A2780 celler, 5 pM 4-oxo-4-HPR behandling i 24 timer inducerede splejsning af en 25 bp intron fra XBP-1 precursor mRNA, forårsaget opregulering af GRP78 /Bip og HSP70 og phosphorylering af eIF2α (figur 2A). Aktiveringen af ​​disse ER stress-associerede begivenheder blev ophævet (XBP-1, GRP78 /Bip og HSP70) eller stærkt reduceret (eIF2α) ved tilsætning af vitamin C (figur 2A). Resultaterne viste, at 4-oxo-4-HPR forårsagede induktion af ER stressreaktion, som nedstrøms begivenhed af ROS generation.

(A) A2780-celler behandlet i 24 timer med 5 uM 4-oxo-4-HPR med eller uden 100 pM vitamin C, blev underkastet RT-PCR-assay til analyse af splejsning af 25 bp intron fra XBP-1-transkript og western blot-analyse for ekspression af GRP-78 /Bip, peIF2α, eIF2α. Til revers transkription-PCR, blev β-actin amplificeret som intern kontrol. Til Western blot-analyse, som en kontrol for påføring blev blottet inkuberet med actin antistof. (B) Celler behandlet som i (A) blev udsat for Western blot analyse for ekspression af pJNK og JNK.

4-oxo-4-HPR inducerer JNK aktivering i A2780 celler

Vi analyserede, om 4-oxo-4-HPR, like 4-HPR [9], fremkaldt JNK-aktivering. Western blot-analyse, i A2780 celler, viste, at 5 pM 4-oxo-4-HPR behandling i 24 timer medførte JNK phosphorylering og at tilføjelsen af ​​C-vitamin reduceret kraftigt aktiveringen af ​​kinasen (figur 2B). Dataene viste, at 4-oxo-4-HPR inducerede aktivering af JNK og at denne begivenhed fandt sted gennem en ROS-afhængig mekanisme.

PLAB opregulering er funktionelt involveret i apoptose induceret af 4-oxo-4-HPR

Vi har tidligere rapporteret, at PLAB er opreguleret ved 4-HPR i en ROS afhængig måde [9], og at det spiller en funktionel rolle i apoptose induceret af retinoidet i A2780-celler [10]. Vi dermed vurderet, om også 4-oxo-4-HPR moduleret PLAB udtryk. Western blot analyse viste, at 5 pM 4-oxo-4-HPR behandling i 24 timer inducerede PLAB opregulering og at denne effekt var stærkt reduceret ved tilsætning af vitamin C (figur 3A). For at undersøge om PLAB opregulering spillede en funktionel rolle i apoptose induceret af 4-oxo-4-HPR, tog vi fordel af PLAB silencing i A2780 celler, der tidligere genereret af stabil transfektion [10]. Som forventet PLAB upmodulation induceret af 4-oxo-4-HPR var stærkt reduceret i celler transficeret med PLAB siRNA plasmidet sammenlignet med celler transficeret med en kodet plasmid anvendt som kontrol (figur 3B). Som vist i figur 3C, det apoptose induceret af 4-oxo-4-HPR i celler transficeret med PLAB siRNA var ca. 2 gange reduceret versus celler transficeret med krypterede plasmid. Reduktionen af ​​apoptose induceret af 4-oxo-4-HPR i PLAB tavshed celler er også blevet bekræftet ved evaluering af sub-G

1 befolkning efter propidiumiodidfarvning (data ikke vist). Resultaterne viste, at 4-oxo-4-HPR induceret PLAB opregulering som en begivenhed nedstrøms for ROS-generering og at PLAB bidrog til 4-oxo-4-HPR-induceret apoptose. Alle ovennævnte data antydede, at 4-oxo-4-HPR forårsagede aktivering af ROS-relaterede signalkaskade allerede vist at blive aktiveret af 4-HPR (ROS → ER stress → JNK → PLAB) [9].

(a) Western blot-analyse for PLAB ekspression i A2780-celler behandlet i 24 timer med 5 uM 4-oxo-4-HPR, med eller uden 100 pM vitamin C. Som en kontrol for påføring blev blottet inkuberet med actin antistof . (B) Western blot-analyse for PLAB ekspression i A2780 celler stabilt transficeret med et plasmid indeholdende et PLAB siRNA eller en kodet nonsilencing siRNA efter tilsætning af 5 pM 4-oxo-4-HPR i 24 timer. Som en kontrol for påføring blev blottet inkuberet med actin antistof. (C) Påvisning af 4-oxo-4-HPR-induceret apoptose i A2780 stabilt transficeret med et plasmid indeholdende et PLAB siRNA (sorte søjler) eller en kodet nonsilencing siRNA (grå søjler). Transficerede celler blev behandlet i 24 timer med 5 uM 4-oxo-4-HPR og apoptose, beregnet som DNA-fragmentering, blev målt ved en ELISA-assay. Dataene er hjælp af fire uafhængige forsøg; lodrette streger er standardafvigelser. Asterisk angiver signifikant forskel (P 0,01).

4-oxo-4-HPR inducerer Bcl-2 og Mcl-1 nedregulering i en ROS-uafhængig måde

Da det har blevet rapporteret, at 4-HPR kan inducere apoptose gennem regulering af medlemmer af Bcl-2-familien, som nedstrøms begivenhed af ROS generation [15] – [17], analyserede vi virkningen af ​​4-oxo-4-HPR på antiapoptotiske proteiner B-celle-lymfom-gen-2 (Bcl-2) og myeloid leukæmi celle-1 (MCL-1) og på proapoptotiske protein Bcl-2-associeret X protein (Bax). I A2780 celler, 5 pM 4-oxo-4-HPR behandling i 24 timer medførte et fald på Bcl-2 og Mcl-1-proteinekspression, hvorimod ikke havde effekt på Bax-ekspression (fig S1). Nedreguleringen af ​​både Bcl-2 og Mcl-1 blev ikke forhindret ved tilsætning af vitamin C (fig S1), hvilket antyder, at 4-oxo-4-HPR forårsagede et sådant fald i en ROS-uafhængig måde.

mitosestandsning og dannelse af multipolære spindler er uafhængige af ROS-relateret signaleringskaskade i A2780-celler

i modsætning til 4-HPR, som kun er lidt påvirker G

1 fase af cellecyklussen, 4- oxo-4-HPR forårsager en markant akkumulering af celler i G

2-M-faser [12]. Vi har for nylig rapporteret, at 4-oxo-4-HPR-induceret cellecyklus perturbation skyldtes evne retinoid til at inhibere tubulinpolymerisation, standsning celler i mitose [13]. Desuden blev antimitotiske virkning af retinoid vist til at blive koblet med dannelse af afvigende formede spindler (dvs. multipolars) på grund af dens virkninger på tubulin polymerisering [13]. For at undersøge om den 4-oxo-4-HPR-induceret mitosestandsning og dannelsen af ​​multipolære spindler var relateret til ROS-induceret signaleringskaskade vi først udført en tidsforløbet analyse af både ROS-generering og cellecyklus perturbation induceret af 4- oxo-4-HPR. ROS generation blev observeret så tidligt som 30 minutter efter retinoid behandling (figur 4A) og opholdt hele 24-timers-kursus. Derimod en lille G

2-M celle akkumulation blev kun observeret ved 2 timer og stigningen i andelen af ​​G

2-M anholdt celler var tidsafhængig op til 16-24 timer (figur 4B) . Tidsforløbet analyse således viste, at oxidativt stress fremkaldt af 4-oxo-4-HPR fandt sted tidligere end cellecyklusstandsningen og at de to begivenheder præsenteret forskellige kinetik. For at undersøge om den 4-oxo-4-HPR-induceret ROS-generering spillede en rolle i mitosestandsning analyserede vi virkningerne af C-vitamin på cellecyklus perturbation og dannelse af afvigende spindler induceret af retinoidet. I A2780 celler eksponeret i 24 timer til 5 uM 4-oxo-4-HPR, tilsætning af 100 uM C-vitamin ikke forhindre ophobning af G

2-M-celle population (figur 5 og S2) eller dannelsen af multipolære spindler (figur 5). Ensartede resultater i cellecyklusfordeling og dannelse af multipolære spindler blev opnået ved at inhibere ROS-relaterede signaleringskaskade ved en nedstrøms plan gennem PLAB silencing: transfektion med PLAB siRNA forhindrede ikke 4-oxo-4-HPR-induceret mitosestandsning og dannelse af multipolære spindler (data ikke vist). Resultaterne viste, at i A2780 celler, den mitosestandsning induceret af 4-oxo-4-HPR hverken var en begivenhed nedstrøms for ROS-generering, og heller ikke et trin til den ROS-relaterede signaleringskaskade.

(A) Analyse af ROS-produktion i A2780 celler behandlet med 5 pM 4-oxo-4-HPR i 30 minutter, 1 time, 2 timer, 4 timer, 6 timer, 16 timer og 24 timer. Analysen blev udført ved flowcytometri efter tilsætning af redox-sensitive farvestof CM-H

2DCFDA. Graferne viser repræsentative flowcytometri fluorescens-profiler i forskellige betingelser for behandling (et repræsentativt eksperiment af tre). Et skift til højre fra kontrol indikerer øget ROS niveauer. (B) Flowcytometrisk analyse af propidiumiodid-farvede A2780 celler behandlet med vehikel eller 5 uM 4-oxo-4-HPR i 30 minutter, 1 time, 2 timer, 4 timer, 6 timer, 16 timer og 24 timer. Numre i figuren indikerer procentdelen af ​​celler i fasen af ​​cellecyklussen, ifølge analysen udført med ModFit LT software. Et eksperiment repræsentativt for tre er vist.

Flowcytometrisk analyse af propidiumiodid-farvede A2780 celler behandlet i 24 timer med 5 uM 4-oxo-4-HPR med eller uden 100 pM vitamin C. Numbers i figuren indikerer procentdelen af ​​celler i fasen af ​​cellecyklussen, ifølge analysen udført med ModFit LT software. Et eksperiment repræsentativt for tre er vist. Til højre er vist et repræsentativt mitotisk celle billede for hver behandling, fremstillet ved immunfarvning med α-tubulin antistof (

grøn

) og nuklear farvning med Hoechst 33342 (

blå og). Scale bar = 5 um.

4-oxo-4-HPR virker via et dobbelt virkningsmekanisme også i cancer cellelinier af forskellig histotypes

For at afgøre, om inddragelse af to uafhængige mekanismer i 4-oxo-4-HPR-aktivitet var begrænset til A2780 celler eller repræsenterede den særprægede virkningsmekanisme retinoidet, vi udvidet analysen af ​​4-oxo-4-HPR effekter til tre andre humane cancercellelinier reagerer på retinoidet: T47D (brystadenocarcinom), HeLa (epithelial cervical adenocarcinoma) og SK-N-BE (neuroblastom) celler (figur 6A). Vi vurderede først den intracellulære generation af ROS induceret af 4-oxo-4-HPR som viser, at de tre cancercellelinier, 5 uM 4-oxo-4-HPR i 4 timer steg ROS produktion i forhold til kontroller, og at tilsætning af 100 pM vitamin C inhiberede ROS-generering induceret af retinoidet (figur 6B). I de tre testede cellelinier, blev 4-oxo-4-HPR behandling induceret PLAB opregulering og denne virkning reduceres ved tilsætning af vitamin C (figur 6C). Vi derefter udført cellecyklusanalyse viser, at 4-oxo-4-HPR behandling inducerede markant G

2-M cellecyklusstandsning i alle testede cancercellelinier (figur 7 og S2). I lighed med, hvad der observeres i A2780 celler, i disse cellelinjer hæmning af ROS generation med C-vitamin forårsagede en markant reduktion af sub-G

1 befolkning, men ikke formindske den procentdel af cellerne anholdt i G

2 M-fasen (figur 7 og S2). Desuden 4-oxo-4-HPR-behandling forårsagede dannelse af multipolære spindler i T47D, HeLa og SK-N-BE celler (figur 7), og i hver af dem tilsætning af C-vitamin ikke forhindrede dannelsen af ​​afvigende spindler inducerede af retinoid (figur 7). Resultaterne antydede, at også i T47D, HeLa og SK-N-BE celler blev ROS-afhængige signaleringskaskade involveret i 4-oxo-4-HPR-induceret apoptose. Desuden 4-oxo-4-HPR-induceret cellecyklusstandsning og dannelsen af ​​multipolære spindler var uafhængige af ROS-associerede signaleringskaskade, ikke kun i æggestokkene, men også i bryst-, livmoderhals- og neuroblastom cancercellelinier, afslører særkende af 4-oxo-4-HPR at have en dobbelt virkningsmekanisme.

(a) Citotoxic virkning af 4-oxo-4-HPR på T47D (□), HeLa (▵) og SK-N- BE (○) cellevækst blev vurderet ved anvendelse af sulforhodamin B-assay. Den antiproliferative aktivitet af 4-oxo-4-HPR i hver cellelinje blev testet i tre uafhængige forsøg med fire replikatbrønde for hver analyse; lodrette streger er standardafvigelser. (B) Analyse af ROS-produktion i T47D, HeLa og SK-N-BE celler behandlet i 4 timer med 5 uM 4-oxo-4-HPR, med eller uden 100 pM vitamin C. Analysen blev udført ved flowcytometri efter tilsætning af redox-sensitive farvestof CM-H

2DCFDA. Graferne viser repræsentative flowcytometri fluorescens-profiler i forskellige betingelser for behandling (et repræsentativt eksperiment af tre). Et skift til højre fra kontrol indikerer øget ROS niveauer. (C) Western blot-analyser for PLAB ekspression i T47D, HeLa og SK-N-BE celler behandlet med 5 pM 4-oxo-4-HPR i 24 timer med eller uden 100 pM vitamin C. Som en kontrol for lastning, den blottet blev inkuberet med actin antistof.

Flowcytometrisk analyse af propidiumiodid-farvede T47D (A), HeLa (B) og SK-N-BE (C) celler behandlet i 24 timer med 5 uM 4-oxo-4-HPR med eller uden 100 pM vitamin C. tal i figuren indikerer procentdelen af ​​celler i fasen af ​​cellecyklussen, ifølge analysen udført med ModFit LT software. Et eksperiment repræsentativt for tre er vist. På bunden af ​​hvert histogram, immunfluorescensanalyse med α-tubulin-antistof (

Grøn

) af celler behandlet på samme måde. Nuclear morfologi blev visualiseret ved farvning med Hoechst 33342 (

blå og). Scale bar = 10 um.

Diskussion

4-oxo-4-HPR er en polær metabolit af det syntetiske retinoid 4-HPR, der blev detekteret i plasmaprøver fra kvinder behandlet med 4-HPR deltager i et fase III bryst forebyggelse af kræft forsøg [11]. Vores tidligere

in vitro Salg undersøgelser udført med 4-oxo-4-HPR har vist, at retinoidet er udstyret med meget lovende anticancer egenskaber, såsom højere tumor væksthæmmende effekter end 4-HPR (bliver dens IC

50 værdier to til fire gange lavere end det oprindelige lægemiddel i de fleste testede cellelinier), mangel på krydsresistens og synergistisk vekselvirkning med moderlægemidlet [12], hvilket tyder på, at det kunne blive foreslået som ny agent til cancerterapi. Til forskel fra 4-HPR og andre retinoider, 4-oxo-4-HPR målretter mikrotubuli og hæmmer tubulinpolymerisation forårsager mitosestandsning og dannelse af multipolære spindler uden tab af centrosom integritet [13]. På den anden side, i lighed med det oprindelige lægemiddel, 4-oxo-4-HPR inducerer stigning af ROS generation [12].

Da 4-HPR-induceret ROS-generering er blevet vist at aktivere en apoptotisk kaskade involverer eR stressreaktion, JNK-aktivering og opregulering af pro-apoptotisk protein PLAB [9], besluttede vi at undersøge, om 4-oxo-4-HPR udløste apoptose også via ROS-generering, og hvorvidt dens antimitotiske aktivitet var relateret til denne ROS-afhængige vej. 4-oxo-4-HPR-induceret ROS produktion bidrog til den apoptotiske aktivitet af retinoid, fordi behandlingen med antioxidanten vitamin C forårsagede en reduktion af 4-oxo-4-HPR-induceret apoptose. I vores tidligere undersøgelse om 4-oxo-4-HPR karakterisering [12], var vi ikke i stand til at vise en klar årsagssammenhæng mellem generering af ROS og celle væksthæmmende aktivitet af retinoid. En mulig forklaring kunne være, at antioxidanten anvendt i det foregående analyse (dvs.

N

acetyl-L-cystein) ikke helt forhindre oxidativt stress fremkaldt af 4-oxo-4-HPR, men kun forårsagede en delvis reduktion af ROS produktion [12].

Nedstrøms ROS-generering, 4-oxo-4-HPR aktiverede andre signalsystemer mellemprodukter med 4-HPR apoptotiske kaskade, såsom ER stressrespons (detekteret ved XBP-1 splejsning, GRP78 /Bip og HSP70 opregulering, og eIF2α fosforylering) og JNK fosforylering, både forhindres ved C-vitamin tilsætning. Ekspressionen af ​​proapoptotiske protein PLAB blev dramatisk forøget med 4-oxo-4-HPR og dens opregulering blev reduceret med C-vitamin kommer, hvilket antyder, at proteinet ekspression modulation var en nedstrøms begivenhed af oxidativt stress fremkaldt af retinoidet. Endvidere demonstrerede vi, at PLAB spillede en funktionel rolle i 4-oxo-4-HPR apoptotisk aktivitet, fordi dens inaktivering formindskede apoptose induceret af retinoidet. Derfor er vores resultater indikerede, at 4-oxo-4-HPR, ud over at fungere som et antimikrotubulusstof, apoptose via signaleringskaskade, som vi allerede har vist sig at blive aktiveret af 4-HPR (ROS → ER stress → JNK → PLAB) [ ,,,0],9]

PLAB apoptotiske-inducerende aktivitet er blevet observeret og rapporteret af andre forfattere i flere cellulære sammenhænge og efter behandling med forskellige anticancer midler [9], [18] -. [21]. De specifikke downstream begivenheder, som PLAB medierer sådan virkning er endnu ikke fastlagt. Fra vores resultater, kan en involvering af proteinerne bcl-2 og MCL-1, et Bcl-2 familiemedlem, i PLAB apoptotisk aktivitet som eventuelt udelukkes. Faktisk, selv om 4-oxo-4-HPR-behandling forårsagede en nedregulering af ekspressionsniveauet for de to antiapoptotiske proteiner, et sådant fald ikke blev forhindret af inhibering af ROS-medieret apoptotiske kaskade involverer PLAB.

det er interessant at bemærke, at 4-oxo-4-HPR er en oxideret form af 4-HPR og at modifikationen i position 4 i cyclohexenring er sandsynligvis ansvarlig for 4-oxo-4-HPR antimikrotubulær aktivitet, men ikke påvirke evnen af ​​retinoid til at inducere ROS-generering og aktivere ROS-relaterede signaleringskaskade. En sådan kemisk modifikation kunne også være ansvarlig for de forskellige sphingolipid stofskifte observeret mellem de to retinoider. Både 4-HPR og 4-oxo-4-HPR er blevet vist at inducere en dramatisk stigning af dihydroceramide produktion; blev imidlertid bidraget fra distinkte molekylære arter til den samlede forøgelse rapporteret at være markant anderledes, hvad angår sphingosin /sphinganine og fedtsyreindhold. Desuden 4-oxo-4-HPR modsætning fra moderlægemidlet, har vist sig at stige en smule også ceramidproduktion [22].

Vi har tidligere rapporteret, at 4-oxo-4-HPR fungerer atypisk sammenlignet med 4-HPR og andre retinoider på grund af sin evne til at inhibere tubulinpolymerisation, fører til dannelse af multipolære spindler og mitosestandsning [13]. I denne undersøgelse har vi fundet, at mitosestandsning og den koblede dannelsen af ​​multipolære spindler induceret af 4-oxo-4-HPR var uafhængige af ROS-relaterede signaleringskaskade. Faktisk har vi vist, at 4-oxo-4-HPR-induceret ROS-generering fandt sted tidligere end den mitosestandsning, hvilket viser, at antimitotiske aktivitet af retinoid ikke var en begivenhed opstrøms for oxidativt stress. På den anden side, har inhibering af ROS-relateret pathway ved vitamin C eller ved PLAB silencing ikke forhindre evnen af ​​4-oxo-4-HPR at udøve sin antimikrotubulær aktivitet, hvilket antyder, at den mitosestandsning ikke var en ROS- afhængig mekanisme. Forekomsten af ​​en dobbelt virkningsmekanisme kunne plausibelt være et særligt kendetegn ved den virkemåde af 4-oxo-4-HPR, da disse to uafhængige veje blev fundet i kræft cellelinier af forskellige histotypes (æggestokkene, bryst, cervikal karcinom og neuroblastom).

selvom den nøjagtige mekanisme, hvormed 4-oxo-4-HPR antimikrotubulær aktivitet udløser celledød er endnu ikke fastlagt, på grundlag af ovennævnte data, vi kan spekulere, at både ROS- relaterede signaleringskaskade og antimikrotubulusmidler aktiviteter uafhængigt bidrager til 4-oxo-4-HPR antiproliferativ virkning, og vi foreslår, at retinoidet virker som præsenteres skematisk i figur 8. Ikke desto mindre analysen af ​​4-oxo-4-HPR virkningsmekanismer får brug yderligere undersøgelser for at undersøge, hvordan to veje molekylært føre til celledød. Det er fristende at spekulere, at ROS-uafhængig nedregulering af Bcl-2 og Mcl-1, observeret efter 4-oxo-4-HPR behandling, kunne spille en rolle i apoptose induceret af den antimikrotubulær aktivitet af retinoid, selv på nuværende ingen beviser understøtter denne hypotese. Ifølge vores observationer er det blevet rapporteret, at behandling med andre mikrotubulus-interfererende midler kan føre til et fald i Bcl-2 og Mcl-1 intracellulære mængder, der bidrager til apoptose [23] – [25].

4 -oxo-4-HPR inducerer celledød gennem to uafhængige virkningsmekanismer: 1) en ROS-relateret signaleringskaskade involverer ER stress respons, JNK aktivering og opregulering af proapoptotiske protein PLAB; og 2) antimikrotubulusmidler der består i inhibering af tubulin-polymerisation, mitosestandsning og dannelse af multipolære spindler.

Det er bemærkelsesværdigt, at andre mikrotubulus-målrettede midler er blevet vist at fremme ROS-generering i cancerceller, men forholdet mellem tubulin dynamik og oxidativ stress er fortsat uklare [26] – [33]. For nylig er anticanceraktivitet af paclitaxel blevet forbundet med dannelsen af ​​intracellulære og ekstracellulære ROS og det er blevet foreslået, at forstyrrelse af mikrotubulus-polymerisation tilstand induceret af dette middel, samt ved taxotere eller vincristin, kunne forøge ROS produktion gennem stabilisering af aktiv NADPH oxidase [31], [32]. ROS generation bidrog også til antiproliferativ virkning af patupilone, er blevet foreslået et medlem af mikrotubuli-stabiliserende midler epothiloner, og en årsagssammenhæng mellem den oxidative stress og ændringer af mikrotubulusdynamik [30]. Derimod ROS-generering induceret af stilben 5c, en mikrotubulus-inhibitor på colchicin site, har vist sig ikke at være relateret til lægemiddel-induceret cellecyklus perturbation [29], i lighed med, hvad vi har fundet til 4-oxo-4- HPR.

evnen af ​​4-oxo-4-HPR til at handle gennem mindst to uafhængige mekanismer kunne sandsynligvis gøre det muligt at modvirke udviklingen af ​​resistens. Faktisk har vi vist, at hvis en sti inhiberes (dvs. ROS-signalering pathway), retinoidet er i stand til at virke ved den anden mekanisme (dvs. mitosestandsning) til at dræbe kræftceller.