PLoS ONE: Betinget Angivelse af Androgen receptor Øger modtagelighed for blærekræft i mus

Abstrakt

Blærekræft udgør en betydelig menneskelig tumor byrde, der tegner sig for omkring 7,7% og 2,4% af alle kræfttilfælde hos mænd og kvinder henholdsvis. Mens mænd har en højere risiko for at udvikle blærekræft, kvinder har tendens til at præsentere på et senere stadium af sygdommen og med mere aggressive tumorer. Tidligere undersøgelser har antydet en salgsfremmende rolle androgen signalering i styrkelsen blærekræft udvikling. For direkte at vurdere, hvilken rolle androgener i blære tumorigenese, har vi udviklet en ny transgen mus stammen,

R26hAR

LoxP /+

:

Upk3a

GCE /+

, hvor mennesket

AR

transgen betinget udtrykt i blæren urothelium. Interessant, både mandlige og kvindelige

R26hAR

LoxP /+

:

Upk3a

GCE /+

mus viser en højere forekomst af urothelial cellecarcinom (UCC) end alder og køn matchede kontroldyr fra samme kuld som reaktion på kræftfremkaldende, N-butyl-N- (4-hydroxybutyl) nitrosamin (BBN). Vi påvise ekspression af det humane

AR

transgen i CK5-positive og P63-positive basale celler i blæren urothelium. Yderligere analyser af UCC væv fra

R26hAR

LoxP /+

:

Upk3a

GCE /+

mus viste, at hovedparten af tumorceller af urotelial basal celle oprindelse. Positiv immunfarvning af transgene AR protein blev observeret i de fleste tumorceller af de transgene mus, hvilket giver en forbindelse mellem transgen AR ekspression og oncogen transformation. Vi observerede en stigning i Ki67-positive celler i UCC læsioner af transgene AR mus. Manipulation endogene androgen niveauer ved kastration og androgen tilskud direkte berørt blære tumor udvikling i mandlige og kvindelige

R26hAR

LoxP /+

:

Upk3a

GCE /+

mus hhv. Tilsammen vore data viser for første gang, at betinget aktivering af transgen AR ekspression i blæren urothelium forbedrer carciongen-induceret blære tumordannelse i mus. Denne nye AR transgene mus linje efterligner visse træk ved menneskelig blærecancer og kan bruges til at studere blære tumorigenese og for lægemiddeludvikling

Henvisning:. Johnson DT, Hooker E, Luong R, Yu EJ, han Y, Gonzalgo ML, et al. (2016) Betinget Angivelse af Androgen receptor Øger modtagelighed for blærekræft i mus. PLoS ONE 11 (2): e0148851. doi: 10,1371 /journal.pone.0148851

Redaktør: Irina U. Agoulnik, Florida International University, UNITED STATES

Modtaget: November 18, 2015; Accepteret: 25 januar 2016; Publiceret: 10. februar, 2016

Copyright: © 2016 Johnson et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:.. Dette arbejde blev støttet af National Institute of Health giver R01CA070297, R01CA151623, R01CA166894, R21CA190021, og R01DK104941

Konkurrerende interesser: forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser.

Introduktion

blærekræft udgør en betydelig menneskelig tumor byrde, med mere end 70.000 nye tilfælde af blærekræft diagnosticeret i nationen årligt, hvilket resulterer i ca. 16.000 dødsfald [1]. Den tegner sig for omkring 7,7% og 2,4% af alle kræfttilfælde hos mænd og kvinder, henholdsvis [1]. Men dødeligheden for mandlige og kvindelige patienter er ca. 20,4% og 25,4%, henholdsvis [2]. Ovenstående tyder på, at mænd har en højere risiko for blærekræft, mens kvinder har tendens til at have mere aggressive tumorer. I øjeblikket er de molekylære mekanismer bag disse kønsforskelle i blæren tumorigenese er uklar.

Androgen signalering spiller en salgsfremmende rolle i væksten af ​​prostatacancer, og således, androgen ablation terapi er en effektiv behandling for patienter med naive prostatacancer [3 ]. Emerging beviser har også impliceret en vigtig rolle for androgen signalering i blæren tumorigenese [4-7]. Ekspression af androgen receptor (AR) er blevet påvist i både murine og humane blære urothelium og submucosa [7, 8]. Tidligere undersøgelser har antydet, at androgen signalering direkte eller indirekte kan forøge blærekræft udvikling [7]. Nedsat tumorincidens er blevet observeret i en Ar knockout musemodel (ARKO) [5, 7]. Men det lader til, at der ikke er nogen signifikant sammenhæng mellem tumor kvaliteter og AR ekspressionsniveauerne i prøver kliniske patient [8, 9]

En kræftfremkaldende-induceret musemodel system er blevet hyppigt anvendt til at undersøge udviklingen af ​​urothelial celle carcinom (UCC). Mus udsat for N-butyl-N- (4-hydroxybutyl) nitrosamin (BBN) udvikle et spektrum af blære patologier, herunder muskel-invasive carcinomer, ikke-invasiv carcinoma, pladecellecarcinomer og hyperplasi [10, 11]. Interessant i denne musemodel, en klar kønsdimorfisme i blæren carcinogenese er blevet observeret [7, 10]. Forekomsten af ​​blærecancer i hanmus var omkring to gange større end i hunmus [7]. Desuden hverken mand eller kvinde ARKO mus udviklede blærecarcinom efter 12-ugers udsættelse for BBN [7]. Svarende til den hele kroppen Ar knockout-mus, hanmus med betinget sletning af Ar i blære urothelium ved uroplakin II (UPII) promoter drevet Cre var mindre modtagelige for BBN-induceret blærecarcinom udvikling [5]. Derudover faldt blære urothelium cellulær proliferation blev observeret i både full-body og urothelial-specifikke Ar knockout-mus [5, 7]. Disse undersøgelser implicerer en salgsfremmende rolle for androgen signalering i onkogene transformation af blære urothelium.

Uroplakin 3a (UPK3a) tilhører uroplakin familie, en gruppe af integrerede membranproteiner [12]. Ekspressionen af ​​UPK proteiner, herunder Upk3a, er blevet observeret ved den luminale overflade af urothelium [13, 14]. Upk3a null mus viste fænotyper af primær blære-ureterrefluks (VUR) og hydronefrose [12].

Upk3a

GFP /cre /ERT2 /+

(Upk3a

GCE /+

)

transgene mus udtrykke en eGFPCreERT2 (Enhanced Green Fluorescent protein og Cre-ERT2) fusionsprotein under kontrol af musen

uroplakin 3a

(

Upk3a

) promotor. I denne musestamme har tamoxifen-induceret Cre rekombinaseaktivitet blevet påvist i blæren urothelium af neonatale hemizygotes [15].

For direkte at vurdere den biologiske rolle af androgen signalering i blæren tumorigenese, vi for nylig genererede en betinget AR transgene mus linje,

R26hAR

LoxP

, hvor et menneske

AR

transgen blev specifikt rettet i ROSA26 locus,

R26hAR

LoxP /+

[16, 17].

AR

transgen i denne musemodel kan konstitutivt udtrykkes i et væv bestemt måde gennem aktivering af

Cre

rekombinase [18]. Vi intercrossed

R26hAR

LoxP /+

Upk3a

GCE /+

mus for at målrette inducerbar ekspression af

AR

transgen til blæren urothelium. Både mandlige og kvindelige

R26hAR

LoxP /+

:

Upk3a

GCE /+

mus viste øget følsomhed over for BBN- induceret urotelial celle carcinom (UCC) udvikling efter betinget udtryk for

AR

transgen. Ekspression af både cytokeratin 5 (CK5) og P63, cellulære markører af basale celler i blæren urothelium, påvises i tumorceller af UCC læsioner. Manipulation endogene androgen niveauer ved kastration og androgen tilskud direkte berørt blære tumor udvikling i mandlige og kvindelige

R26hAR

LoxP /+

:

Upk3a

GCE /+

mus hhv. Tilsammen vores data viser for første gang, at betinget aktivering af transgen AR udtryk i blæren urothelium øger kræftfremkaldende-induceret blære tumor dannelse i mus.

Materialer og Metode

Mus Eksperimenter

R26hAR-floxet

mus blev genereret som beskrevet tidligere [18]. For at generere den betingede

AR

transgene mus, vi intercrossed

R26hAR

loxP /vægt

mus med

Upk3a

GCE /+

stamme (JAX lager: 015.855). Til genotypebestemmelse, blev mus hale tips isoleret mellem alder 2-3 uger og inkuberet i lysepuffer (Cat # 102-T, VIAGEN Biotech, LA, CA) natten over ved 55 ° C. Prøver blev kortvarigt centrifugeret ned og genomisk DNA blev opløst i TE-buffer. Tre primere, der kan skelne vildtype fra AR target allelen blev anvendt til genomisk PCR amplifikation. Den fremadrettede primer, 5′-CTCTGCTGCCTCCTGGCTTCT-3 ‘blev anvendt til både vildtype og målrettet alleler, og den reverse primer for vildtype allelen var 5′-CGAGGCGGATCACAAGCAATA-3′, og for målrettet allel var 5’-TCAATGGGCGGGGGTCGTT- 3 ‘. PCR fragmenter til genotypebestemmelse blev amplificeret ved 94 ° C i 5 minutter, derefter 94 ° C i 20 sek, 64 ° C i 30 sekunder og 72 ° C i 25 sek i 30 cykler, derefter 72 ° C i 2 min. For at vurdere rekombination, blev den fremadrettede primer 5’-TTCGGCTTCTGGCGTGTGAC-3 ‘og den reverse primer 5′-GCTGTGATGATGCGGTAGTC-3’ anvendt i genomiske PCR-reaktioner. PCR-fragmenter blev amplificeret ved 95 ° C i 5 minutter, derefter 95 ° C i 45 sekunder, 63 ° C i 50 sek og 72 ° C i 2 min i 40 cykler, derefter 72 ° C i 5 min.

For kastration eksperimenter og testosteron pellet indsættelse, både

R26hAR

LoxP /+

:

Upk3a

GCE /+

mus og deres kontrol kuld blev bedøvet ved IP injektion med ketamin og xylazin. For at kastrere hanmus blev begge testikler og epididymides fjernes gennem en scrotal tilgang. Den distale ende af sædstrengen blev ligeret med silkesutur som tidligere [19] beskrevne. For pellet insertion, blev hunmus bedøvet som beskrevet ovenfor. Den testosteron pellet blev indsat subkutant i ryggen på nakken af ​​halsen. Alle dyreforsøg udført i denne undersøgelse blev godkendt af den administrative Panel om Laboratory Animal Care på Stanford University.

Tamoxifen Injection og BBN Behandling

Begge 5 uger gamle

R26hAR

LoxP /+

:

Upk3a

GCE /+

mus og kontrolprøver søskende blev administreret tamoxifen i majsolie, ca. 5 mg /25 g kropsvægt, ved IP injektion fem gange inden for en periode på tre uger. Efter den sidste injektion, efter 8 uger gamle, blev musene givet postevand indeholdende 0,1% N-butyl-N- (4-hydroxybutyl) nitrosamin (BBN) ad libitum (TCI America, Portland, OR) i 12 uger, og derefter normalt vand i en uge før analyser. Musene blev aflivet og urinveje blærer og andre unormale væv blev opsamlet og bevaret i 10% neutral pufret formalin. Musevæv blev indlejret i paraffin, snittet og farvet med hematoxylin og eosin (H 0,05 og P 0,01 blev anset for signifikant

Resultater

Angivelse af Upk3a i Mouse Blære urinvejene

Upk3a

GCE /+

blev transgene mus frembringes ved at indsætte en tamoxifen-inducerbar Cre-rekombinase (CreERT2) og eGFP-fusionen genet under kontrol af muse

Upk3a

promotor. Som tidligere rapporteret,

Upk3a

GCE /+

mus vises fænotypisk normal uden nogen abnormiteter [15]. For at identificere Upk3a udtryk celler, vi genererede

Rosa26-mT /mg Hotel (

R26RmT /Mg

):

Upk3a

GCE /+

mus ved Krydsning

R26RmT /mg

[20] og

Upk3a

GCE /+

musestammer (fig 1A). I denne musemodel, tamoxifen (TM) -induceret Cre aktivitet kan skifte membranbundet tdTomato (mT) til membranbundet grønt fluorescerende protein (mGFP) ekspression gennem rekombination af floxed reporter loci i målrettede celler. Vi administreres en dosis af tamoxifen (TM) eller kontrol køretøj til 6 uger gamle

R26RmT /Mg

:

Upk3a

GCE /+

mus og analyseret dem to uger efter injektion (fig 1B). Vi observerede specifikt udtryk for mGFP udtryk i blæren urothelium af TM-induceret

R26RmT /Mg

:

Upk3a

GCE /+

mus, men ikke i ikke-inducerede kontroller (fig 1C-1D). Det er blevet foreslået, at voksne gnaver blære urothelium består af tre separate populationer af celler: paraply, mellemliggende og basale celler. Umbrella celler, også kendt som overfladiske celler, linje blære lumen og stærkt udtrykkelige uroplakins og Ck8, men ikke P63 eller CK5 [10]. Mellemliggende celler bor nedenunder paraply celler og udtrykker både uroplakins og P63, men ikke CK5. Basale celler ligger ved siden af ​​lamina propria og omkringliggende muskelvæv og udtrykke CK5 og P63 [21-23]. Brug af co-immunofluorescensassays, vi yderligere karakteriseret den cellulære identitet mGFP ekspressionsceller i blæren urothelium med CK5, Ck8 og P63-antistoffer (Fig 1E-1G “). Vi observerede ekspressionen af ​​CK5 (Fig 1E “), P63 (fig 1F”), og Ck8 (fig 1G “) overlejret med mGFP farvning hvilket antyder, at de fleste af cellerne i blæren urothelium opsøges af

Upk3a

GCE /+

mus [21]

(A) Skematisk demonstrerer Cre-medieret mærkning af Upk3a

GCE /+ -. positive celler med mT /mg reporter-system. (B) Tidsplan for tamoxifen (TM) injektion for at inducere Cre rekombination af

R26

mTmG /+

:

Upk3a

GCE /+

mus. (C-C ‘) Lavere og højere forstørrelse billeder af mærket mT, mtd-Tomat, (rød) eller Mg, mGFP, (grøn) i blæren urothelium af

R26

mTmG /+

:

Upk3a

GCE /+

før TM injektion (n = 4). (D-D ‘) Lavere og højere forstørrelse billeder af mærket mT (rød) eller mGFP (grøn) i blæren urothelium i

R26

mTmG /+

:

Upk3a

GCE /+

efter TM injektion (n = 6). (EG) Immunofluorescerende billeder af blære urothelium af TM injicerede

Upk3a

GCE /+

R26

mTmG /+

mus co-farvet med antistoffer mod GFP (EG “) med P63 (E’-E”), CK5 (F’-F “), eller Ck8 (G’-G”) (n = 6).

Betinget Ekspression af AR transgen i Mouse Blære urinvejene

Selvom den potentielle effekt af Ar er blevet vurderet tidligere ved hjælp af en vævsspecifik Ar knockout musemodel drevet af UPII-Cre model [5], AR-medieret onkogen transformation i blæren tumorigenese fortsat uklar. For direkte at imødegå den salgsfremmende rolle AR i blærekræft initiering og progression, genereret vi

R26hAR

LoxP /+

:

Upk3a

GCE /+

mus (fig 2A). Som påvist i

R26RmT /Mg

:

Upk3a

GCE /+

mus, udtryk for transgene AR protein kan induceres i blæren urothelium efter TM administration. Vi administreret TM til

R26hAR

LoxP /+

:

Upk3a

GCE /+

og R26hAR

LoxP /+

kontrol starter ved 5 ugers alderen (figur 2B). Brug genomiske PCR tilgange, bekræftede vi aktiviteten af ​​

Creer

i blære væv, hvilket resulterer i et 300 bp PCR-fragment svarende til sletning af

LSL

kassette gennem

loxP /Cre

rekombination i blære væv af

R26hAR

LoxP /+

:

Upk3a

GCE /+

mus med TM induktion , men ikke i de af

R26hAR

LoxP /+

mus ved 8 ugers alder (figur 2C). Vi bekræftede transgen AR proteinekspression gennem immunhistokemi med enten et antistof (441, Santa Cruz, sc-7305) specifikt for transgene humant AR-protein, Har, eller et antistof (N-20, Santa Cruz, sc-816) mod både human og mus AR proteiner, m HAr. Ved hjælp af disse to forskellige antistoffer tilladt os at skelne transgent humant AR fra endogene muse Ar i mus blære væv. Nuklear AR farvning med m Här antistof påvises i blæren urothelium af både

R26hAR

LoxP /+

:

Upk3a

GCE /+

(fig 2F og 2F) og

R26hAR

LoxP

kontrolmus (fig 2D og 2D), skønt intensiteten af ​​førstnævnte er stærkere end det sidste. Som forventet blev positiv nukleare farvning med den menneskelige AR specifikt antistof, har kun observeret i blæren urothelial væv isoleret fra

R26hAR

LoxP /+

:

Upk3a

GCE /+

mus (fig 2E og 2E «). Disse data indikerer, at ekspressionen af ​​

AR

transgen i blæren urothelium er et resultat af den

LoxP /Cre

rekombination gennem TM-aktiveret

Cre

transgen drevet af

Upk3a

promotor.

(A) Skematisk skildrer Cre /LoxP-medieret rekombination, hvilket resulterer i sletning af STOP kassetten fra

R26AR transgen

allel. (B) Eksperimentel set-up for tamoxifen-inducerede menneske

AR

transgen ekspression. (C) Genomisk PCR-analyser af rekombinationsbegivenheder med specifikke primere for mennesket

AR

transgen allel (se figur 2A) med blære urothelium vævsprøver af

R26AR

LoxP /+

Upk3a

GCE /+

og

R26AR

LoxP /+

mus. AR trangene allel blev påvist i prøver af både

R26AR

LoxP /+

Upk3a

GCE /+

R26AR

LoxP /+

mus (sort pil), men TM induceret rekombination på AR transgen allel blev kun observeret i

R26AR

LoxP /+

Upk3a

GCE /+

mus (hvid pil). (D-F ‘) immunhistokemisk farvning af blæren urothelium af TM injicerede

R26AR

LoxP /+

mus ved hjælp af enten antistof, der er reaktivt til både mus og human AR protein ( m här), eller antistoffet, som er reaktivt over for eneste humane AR (HAR) (n = 9). (F-G ‘) immunhistokemisk farvning af blæren urothelium med de to forskellige AR antistoffer som beskrevet ovenfor ved hjælp af prøver af TM-injicerede

R26AR

LoxP /+

Upk3a

GCE /+

mus (n = 12). (HK “) Enkelt kanal og fusionerede immunfluorescerende billeder af blære væv af TM-injicerede

R26AR

LoxP /+

R26AR

LoxP /+

Upk3a

GCE /+

mus farvet med antistoffer mod CK5 P63, og den menneskelige AR (i rødt) (n = 6).

Brug immunfluorescerende tilgange, vi yderligere bekræftet udtryk for transgene AR protein i blæren urothelium gennem TM-induceret

LoxP /Cre

rekombination i

R26hAR

LoxP /+

:

Upk3a

GCE /+

mus (fig 2J “og 2K), men ikke i

R26hAR

LoxP /+ kun kontrol mus (fig 2H “og 2I«). I overensstemmelse med vores observation

R26RmT /Mg

:

Upk3a

GCE /+

mus, observerede vi en klar overlejring af transgen AR udtryk med både CK5 og P63 udtryk i urothelial celler

R26hAR

LoxP /+

:

Upk3a

GCE /+

mus (fig 2J ” og 2K “), tyder på, at transgene AR udtryk er til stede i basal og mellemliggende cellepopulationer i blæren urothelium [21].

Betinget Expression af transgene AR i Mouse blære urinvejene Forbedrer modtagelighed for kræftfremkaldende-induceret tumordannelse

N-butyl-N- (4-hydroxybutyl) nitrosamin (BBN) er et veletableret carcinogen, der har været hyppigt anvendt i gnavere til at inducere urinblæren kræft [24], som bærer væsentlige histopatologiske og molekylære ligheder med human sygdom [25]. Derfor har vi vurderet, om transgene AR udtryk i blæren urothelium ændrer modtagelighed for BBN-induceret tumorigenese. Begge

R26hAR

LoxP /+

:

Upk3a

GCE /+

og R26hAR

LoxP /+ Salg mus blev administreret TM ved 5 ugers alderen, og blev derefter behandlet med 0,1% BBN i deres drikkevand starter ved 8 uger gamle, i 12 uger. Mus blev aflivet 1 uge efter sluttede BBN behandling (Fig 3A). Gross og histologiske analyser viste et spektrum af patologiske forandringer i blæren urothelium, som omfattede hyperplasi, karcinom

in situ

, non-invasiv urotelial celle karcinom, og invasive urotelial celle carcinom (Fig 3B-3E). Interessant, otte ud af tolv mænd

R26hAR

LoxP /+

:

Upk3a

GCE /+

mus udviklede invasiv urotelial cellecarcinom (67%), der bærer de mest alvorlige tumor fænotyper sammenlignet med mus af andre genotyper (figur 3F). I modsætning hertil kun tre af tretten alder matchede mandlige

R26hAR

LoxP /+

kontrol søskende udviklede invasiv urotelial celle carcinom (23%). Endvidere fem ud af tretten kvindelige

R26hAR

LoxP /+

:

Upk3a

GCE /+

mus udviklede også invasive urotelial celle karcinomer (39%), mens ingen alder-matchede kvindelige

R26hAR

LoxP /+

kontrol søskende udviklet enten non-invasive eller invasive urothelial celle carcinomer (figur 3F). Disse data viser, at betingede udtryk for transgene AR i blæren urothelium celler øger modtageligheden for onkogen transformation og tumor aggressivitet i både mandlige og kvindelige

R26hAR

LoxP /+

:

Upk3a

GCE /+

mus med BBN induktion.

(A) Eksperimentel design at fremkalde transgen ekspression og blære carcinogenese i

R26AR

LoxP /+

R26AR

LoxP /+

Upk3a

GCE /+

. (BE) Lav (BE) og høj (B’-E ‘) forstørrelse billeder af H & E farvning skildrer rækken af ​​patologiske forandringer i

R26AR

LoxP /+

Upk3a

GCE /+

mus efter TM injektion og BBN behandling beskrevet i (A) (Hyperplasi: n = 30, carcinoma in situ n = 5, Non-invasiv karcinom: n = 1, invasive karcinom: n = 17). (F) Analyse af forekomsten af ​​hyperplasi eller urothelial celle karcinomer udvikling i mus med forskellige genotyper.

BBN-induceret urotelial Cell Carcinomer i

R26hAR

LoxP /+

:

Upk3a

GCE /+

Are urothelial Intermediate og Basal celle oprindelse

det er påvist, at BBN inducerede udviklingen af ​​blære urothelial cellecarcinom i mus [6, 22]. For yderligere at definere oprindelsen af ​​blæretumorer i

R26hAR

LoxP /+

:

Upk3a

GCE /+

mus udførte vi immunhistokemiske analyser for at undersøge en række cellulære markører i tumorvæv. Som vist i fig 4A-4D ‘, viste tumorceller positiv immunfarvning med det humane AR antistof (Fig 4A og 4A), hvilket tyder på en forbindelse mellem transgen AR ekspression og BBN-induceret oncogen transformation. Tumorceller viste stærk positiv farvning for CK5 (Fig 4B og 4B), som er kendetegnende for patologier, der følger af de basale celler [22]. Mindre pletter af Ck8 blev også observeret i tumorceller (Fig 4C og 4C). De fleste tumorceller var også reaktivt til P63 antistof (Fig 4D og 4D). Brug af co-immunfluorescerende fremgangsmåder, vi yderligere karakteriseret den cellulære identitet af tumorceller. Nuklear farvning af transgene AR overlejret ensartet med cytoplasmatisk membran farvning af CK5 i tumorceller af

R26hAR

LoxP /+

:

Upk3a

GCE /+

mus (fig 4F-4F “). Derudover fleste CK5 positive tumorceller isoleret fra både

R26hAR

LoxP /+

:

Upk3a

GCE /+

R26hAR

LoxP /+

mus var også reaktive til P63 antistoffer (fig 4G-4H “). Tilsammen antyder disse data, at oprindelsen af ​​BBN-induceret blære urotelial celle karcinom hovedsageligt stammer fra basale celler i

R26hAR

LoxP /+

:

Upk3a

GCE /+

mus og

R26hAR

LoxP /+

kontroller.

(AD) lav (AD) og høj (A’-D ‘) forstørrelse billeder af immunhistokemisk farvning med antistof mod den menneskelige AR, HAr (A-A’) og CK5 (B-B ‘), Ck8 (C-C), eller P63 (D- D ‘) i blæretumorer fra

R26AR

LoxP /+

Upk3a

GCE /+

mus (n = 3 ). (EF “) Immunfluorescerende analyser af blære tumorvæv isoleret fra

R26AR

LoxP /+

R26AR

LoxP /+

Upk3a

GCE /+

mus. Enkelt kanal og flettede billeder, der viser CK5 (grøn) og human AR (rød) co-lokalisering i blæretumorer i muse væv (n = 3). (GH “) Tilsvarende analyser som beskrevet ovenfor blev udført ved hjælp af antistof mod CK5 (grøn) eller P63 (rød) i blæretumorer fra

R26AR

LoxP /+

R26AR

LoxP /+

Upk3a

GCE /+

mus (n = 4). (IL) immunhistokemisk analyser af blære tumorvæv isoleret fra mand eller kvinde

R26AR

LoxP /+

R26AR

LoxP /+

Upk3a

GCE /+

mus ved hjælp af et antistof mod spredning markør, Ki67 (n = 3). (M) Kvantificering af Ki67-positive celler detekteret i karcinomer fra begge genotyper i mandlige og kvindelige mus (n = 3).

Transgene AR Expression Fremmer tumorcelleproliferation i Blære af

R26hAR

LoxP /+

:

Upk3a

GCE /+

Mus

En salgsfremmende rolle AR i cellulær proliferation tidligere er blevet påvist i prostata [26-28]. Vi undersøgte den potentielle effekt af transgen AR udtryk i at fremme celleproliferation i blærer af BBN-behandlet

R26hAR

LoxP /+

:

Upk3a

GCE /+

mus. Vi udførte immunhistokemi til at farve blære væv lysbilleder med Ki67 antistof fra både mandlige og kvindelige R

26hAR

LoxP /+

:

Upk3a

GCE /+

og R

26hAR

LoxP /+

mus (fig 4I-4L). Ki67-immunfarvning blev kvantificeret ved tælling i alt 1000 blære urothelial celler fra fem high-power felter i hver prøve. Tre mus i hvert køn og genotype blev analyseret, repræsentativt data vises (fig 4I-4L). Den proliferative indeks i den mandlige

R26hAR

LoxP /+

:

Upk3a

GCE /+

gruppe var ca. en- gange højere end i mandlige

R26hAR

LoxP /+

kontrol mus, og kvindelige

R26hAR

LoxP /+

R26hAR

LoxP /+

:

Upk3a

GCE /+

mus (fig 4m). Disse resultater implicerer en salgsfremmende rolle transgene

AR

udtryk i cellulær proliferation af BBN-induceret blære urothelial tumorer.

Androgener Spil en dominerende rolle i Øget modtagelighed for BBN induceret urothelial Carcinoma Udvikling i

R26hAR

LoxP /+

:

Upk3a

GCE /+

Mus

I denne undersøgelse, vi observeret den højeste forekomst af BBN-inducerede invasive urothelial celle hos han-

R26hAR

LoxP /+

:

Upk3a

GCE /+ Salg mus sammenlignet med andre sex og genotype mus. Desuden tumorceller fra

R26hAR

LoxP /+

:

Upk3a

GCE /+

mus viste sig at være mere proliferativ end dem fra andre grupper af mus. AR er medlem af steroidhormonreceptoren superfamilien [29], og dets aktivitet er reguleret gennem androgener i almindelighed. For yderligere at karakterisere rolle androgen aksen i

R26hAR

LoxP /+

:

Upk3a

GCE /+

mus vi manipuleret androgen niveauer ved enten kastrere hanmus eller supplere hunmus med androgen pellets. Vi undersøgte dernæst BBN-induceret blære tumorigenese i ovenstående mus (Fig 5A). Interessant nok kastrerede

R26hAR

LoxP /+

kontrol mus kun udviklet blære urotelial hyperplasi (Fig 5B). Men to ud af fem (40%) kastreret

R26hAR

LoxP /+

:

Upk3a

GCE /+

mus udviklede urothelial carcinomer. Som vi tidligere observeret, intakt mandlige

R26hAR

LoxP /+

:

Upk3a

GCE /+

mus viste den højeste